PADRONIZAÇÃO DO CULTIVO DE ALGODÃO (Gossypium hirsutum) IN VITRO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA 4ª Semana do Servidor e 5ª Semana Acadêmica 2008 UFU 30 anos PADRONIZAÇÃO DO CULTIVO DE ALGODÃO (Gossypium hirsutum) IN VITRO Rafael Rogério Pereira da Silva (1), Universidade Federal de Uberlândia ICIAG, Av. Amazonas s/n, Campus Umuarama, Bloco 2E, CEP , Uberlândia- MG rafaelrogerio@gmail.com Ana Paula de Oliveira Ribeiro (2), Juliana Rainho Teixeira (3), Maria Amélia dos Santos (4), Adão de Siqueira Ferreira (5) Resumo: O presente trabalho teve como objetivo, estabelecer métodos para obtenção e manutenção de clones de algodão in vitro. Foram realizados quatro ensaios. De maneira geral, todas as sementes utilizadas foram desinfestadas com etanol 70% e NaClO 2,5%, em diferentes tempos e em seguida, colocadas em tubos de ensaio contendo meio de cultura. Os ensaios de germinação foram feitos a 25 o C sob condições de escuro e exposição à luz. As sementes utilizadas para os testes de germinação foram imersas em Benomyl overnight e, posteriormente, desinfestadas por 1 no álcool 70% e 8 no hipoclorito de sódio 2,5% e lavadas em água estéril por três vezes, e transferidas para tubos Falcon contendo Meio para Germinação de Cotton (MGC). As sementes foram incubadas durante a germinação no escuro por uma semana, e transferidas para ambiente iluminado por 12 horas diárias e temperatura controlada de 25 C. Posteriormente, o sistema radicular foi excisado das plântulas, e os explantes foram transferidos para frascos contendo meio MS onde foram cultivados, e levados para sala de crescimento, sob condições controladas de temperatura e luz. Após 30 dias, as plântulas foram repicadas realizando cortes de aproximadamente 2 cm, tomando o cuidado de preservar pelo menos uma gema lateral em cada explante. Após, transferiu-se para frascos contendo meio MS, suplementado com 1 mg L -1 de BAP (benzilaminopurina) e estes foram levados à BOD. Em todos os casos, a incubação foi mantida a 25 ± 1 C, irradiância de 35 mmol m -2 s -1, fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas de 16 W. Observou-se que o meio MGC se mostrou mais adequado para a germinação das sementes de algodoeiro; o meio MS atendeu as exigências para o desenvolvimento de plântulas de algodoeiro; e o meio MS suplementado com BAP possibilitou a obtenção e manutenção de clones in vitro. Palavras-chave: biotecnologia, micropropagação, meio MGC, algodoeiro. 1. INTRODUÇÃO O algodão (Gossypium hirsutum) é uma excelente fonte natural de fibra têxtil (Agrawal et al.,1997), além disso, as sementes desta malvácea são fontes importantes de proteínas que podem ser utilizadas na alimentação humana e animal, e na extração de óleo potencial (Carvalho et al., 2006). Por apresentar grande importância econômica, a cotonicultura tem recebido uma atenção especial de pesquisadores que buscam através de técnicas de melhoramento a obtenção de variedades e cultivares mais resistentes a pragas e doenças, O melhoramento também inclui a seleção de cultivares adaptadas a diferentes condições edafoclimáticas, visando à produção nos padrões de lucratividade aos agricultores. O número de plantas produzidas in vitro tem aumentado gradativamente, uma vez que as técnicas empregadas garantem inúmeras vantagens, a exemplo da possibilidade de multiplicação em larga escala e em curto espaço de tempo; controle de condições ideais de cultivo e conhecer (1) Acadêmico do curso de Agronomia; (2) Pós-Doutoranda em Agronomia UFU/FAPEMIG; (3) Acadêmica do curso de Ciências Biológicas; (4) Docente do Instituto de Ciências Agrárias; (5) Orientador e docente do Instituto de Ciências Agrárias

2 aspectos de metabolismo e de fisiologia das plantas sob condições de estresses. O cultivo in vitro é indicada ainda para produzir clones de plantas, visando à homogeneidade e vigor das plantas em estudos sob condições de bioensaio (Ribeiro, 2006). Portanto, as técnicas de cultura de tecidos que consistem no cultivo de órgãos, tecidos ou células vegetais (chamados explantes) em meio nutritivo apropriado, e em ambiente asséptico, são grandes aliadas no melhoramento e obtenção de novos cultivares, por oferecerem condições para obtenção de plantas de difícil propagação e de ciclos de vida longa, em menor tempo que o melhoramento convencional. Já que os explantes, ao serem colocados em frascos estéreis com as condições apropriadas, se multiplicam com rapidez, formando plantas idênticas geneticamente à plantas matriz, ou, quando induzidas e selecionadas, apresentam modificações em uma ou mais de suas características como, maior produtividade, maior tolerância à seca, ou a deficiência mineral do solo, que é suplementada pelo meio nutritivo utilizado (Pescador et al., 2000). Técnicas de micropropagação podem aumentar a oferta de diferentes espécies, através da regeneração de plantas com bom estado fitossanitário, mantendo a fidelidade genética pela produção de clones. Dessa forma, os sistemas de estabelecimento in vitro são excelentes pela sua eficiência como veículos para a manipulação genética e multiplicação clonal de plantas, além de serem instrumentos importantes para o estudo de aspectos relacionados ao seu desenvolvimento. (González, 1998). Porém, há necessidade de desenvolvimento e otimização de métodos e protocolos para o crescimento de plântulas in vitro, com objetivos específicos. Portanto, o presente trabalho teve por objetivo o estabelecimento de protocolos para obtenção e manutenção de clones de algodão in vitro. 2. MATERIAL E MÉTODOS Foram conduzidos quatro protocolos para desinfestação e, posterior, germinação das sementes baseados em já existentes na literatura, de forma adequá-los nas condições de crescimento das culturas testadas Determinação do processo de desinfestação com etanol 70% e NaClO 2,5%, com cultivo em meio LGI-P. Vinte sementes de algodão Fabrika` foram testadas primeiramente, para verificar qual o tempo ideal para uma desinfestação efetiva. O controle consistiu de sementes que não haviam sido desinfestadas nem por etanol 70% nem por hipoclorito de sódio (NaClO) 2,5% (testemunha absoluta). Os outros tratamentos testados foram: 1-1 em etanol 70%; 2-1 em etanol 70% e 1 em hipoclorito de sódio 2,5%; 3-1 em etanol 70% e 2 em hipoclorito de sódio 2,5%; 4-1 em etanol 70% e 4 em hipoclorito de sódio 2,5%; 5-1 em etanol 70% e 8 em hipoclorito de sódio 2,5%. As sementes desinfestadas foram colocadas em tubo de ensaio contendo meio LGI-P semi-sólido (0,2 g de K 2 HPO 4 ; 0,6 g de KH 2 PO 4 ; 0,2 g de MgSO 4.7H 2 O; 0,02 g de CaCl 2 ; 0,002 g de Na 2 MoO 4.2H 2 O; 4 ml de FeEDTA; 5 ml de 0,5% azul de bromotimol em KOH 0,2 M; 1 ml de solução de vitaminas; 1000 ml de água destilada, 1,75 g de ágar e ph - 6,0 com 1% de sacarose). Parte das sementes tratadas foi mantida na luz em câmara de crescimento, e outra, em BOD à 25ºC no escuro, por 2 semanas Desinfestação com Benomyl e Cultivo em meio MS Sementes de algodão foram colocadas em solução de água com fungicida Benomyl (1 mg ml -1 ) sob agitação overnigth. Posteriormente, 25 foram selecionadas e lavadas com água esterilizada e devidamente desinfestadas com etanol 70% durante 1 e hipoclorito de sódio 2,5% por 8. As sementes foram transferidas para tubos de ensaio contendo meio nutritivo MS (82,5 g de NH 4 NO 3, 95 g de KNO 3, 1,24 g de H 3 BO 3, 34 g de KH 2 PO 4, 0,166 g de KI, 50 mg de Na 2 MoO 4 2H 2 O, 5 mg de COCL 2 6H 2 O, 17,6 g de CaCl 2 H 2 O, 80 mg de glicina, 74 g de 2

3 MgSO 4 7H 2 O, 3,3782 g de MnSO 4 4H 2 O, 1,72 g de ZnSO 4 7H 2 O, 5 mg de CuSO 4 5H 2 O, 7,45 g de NaEDTA 2H 2 O, 5,57 g de FeSO 4 7H 2 O, 30 g de sacarose 1000 ml de água destilada, 7 g de ágar e ph - 5,8) acrescido de 10 mg de tiamina HCl, 50 mg de ácido nicotínico, 50 mg de piridoxina, 0,1 g de mio-inositol (Murashige & Skoog, 1962). Antes da transferência das sementes para os tubos, foi realizado um pequeno corte na ponta das mesmas, para facilitar a germinação no meio de cultura. Os tubos com as sementes foram primeiramente mantidos no escuro por 1 semana, para que ocorresse a germinação, e logo depois foram passados para luz em sala de crescimento a 25ºC por mais 1 semana. As plântulas formadas foram cortadas com lâminas de bisturi aproximadamente 2 cm abaixo da gema e inoculadas em frascos, contendo meio MS acrescido de 0,25 mg.l -1 de BAP (benzilaminopurina). As plântulas que apresentavam bom vigor no tubo de ensaio, tiveram sua haste cortada em várias partes e essas foram colocadas em meio MS contendo BAP Desinfestação sem Benomyl e Avaliação da Germinação Sementes de algodoeiro foram devidamente desinfestadas com etanol (70%) durante 1 e NaClO (2,5%) por 8. Em tubos falcon de 50mL, contendo meio nutritivo MS, foram colocadas as sementes de algodoeiro. Esses tubos foram mantidos na luz em sala de crescimento por 2 semanas. Posteriormente, as plântulas desenvolvidas foram cortadas com lâmina de bisturi, aproximadamente 2 cm abaixo da gema e foram transferidas para frascos, contendo meio MS mais BAP (0,25 mg.l -1 ). Para os protocolos realizou-se a quantificação do percentual de germinação e de contaminação após 3, 7 e 14 dias Germinação em MGC e multiplicação dos clones obtidos em MS. As sementes de algodão foram imersas overnight em uma solução de Benomyl (1 mg ml -1 ), posteriormente, foram lavadas abundantemente com água destilada estéril, até retirar o excesso do fungicida. Em seguida, as sementes foram desinfestadas em álcool 70% por 1, e hipoclorito de sódio 2,5% por 8 e enxaguadas 5 vezes com água esterilizada. Após os procedimentos de desinfestação, as sementes foram transferidas assepticamente para tubos Falcon, contendo o Meio para Germinação de Cotton - MGC (14 gl -1 de sacarose; 0,2 gl -1 de K 2 HPO 4 ; 0,6 gl -1 de KH 2 PO 4 ; 0,2 gl -1 de MgSO 4. 2 H 2 O; 0,02 gl -1 de CaCl 2.2H 2 O; 0,002 gl -1 de Na 2 MoO4.2H 2 O; 0,01 gl -1 de Fe EDTA; 8 gl -1 de ágar; ph 5, 5) preparado anteriormente e autoclavado à 120 C, por 30. Para a germinação in vitro e formação das plântulas matrizes, as sementes permaneceram por 1 semana no escuro, incubados a 25 C, em BOD ; e, posteriormente, 1 semana na presença de luz, em câmara de germinação (fotoperíodo de 12 horas, à 25 C). Em câmara de fluxo laminar, o sistema radicular foi separado das plântulas, e os explantes foram transferidos para frascos onde foram cultivados em meio MS, e levadas para câmara de crescimento com o fotoperíodo e temperatura citado acima. Após 30 dias, da transferência do explante realizou-se a primeira repicagem, na qual se fez cortes nas plântulas cultivadas de ± 2 cm, tomando o cuidado de preservar as gemas laterais em cada explante. Deste modo, cada explante foi transferido para frascos contendo meio MS, suplementado com 1 mg L -1 de BAP e levados à BOD. Em todos os casos, a incubação foi mantida a 25 ± 1 C, irradiância de 35 mmol m -2 s -1, fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas de 16 W. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Determinação do processo de desinfestação com etanol 70% e NaClO 2,5%, com cultivo em meio LGI-P. 3

4 As sementes de algodão que foram desinfestadas em tempos diferentes obtiveram resultados significativos, mostrando que nas sementes submetidas a um maior tempo em hipoclorito de sódio apresentaram menor porcentagem de contaminação (Tabela 1). Tabela 1. Porcentagem de contaminação de tubos de cultivo nos diferentes tratamentos de desinfecção de sementes de algodão. Tratamentos local de incubação câmara de crescimento BOD Testemunha absoluta 100%* 100% 1 à etanol 70% 60% 80% 1 - etanol 70% e 1 - NaClO 2,5% 40% 0% 1 - etanol 70% e 2 - NaClO 2,5% 10% 0% 1 - etanol 70% e 4 - NaClO 2,5% 0% 0% 1 - etanol 70% e 8 - NaClO 2,5% 0% 0% Quanto ao crescimento das plântulas, os melhores resultados foram nos tubos armazenados em sala de crescimento (Tabela 2, Figura 1 e Figura 2). Nos tubos mantidos em BOD, apenas 2 sementes começaram a germinar, lançando para fora apenas uma pequena ponta. Dentre estas duas sementes, uma havia sido submetida ao tratamento com 4 de NaClO e outra à 8. Os resultados mostram que a exposição das sementes à solução de hipoclorito diminui a contaminação e aumenta a porcentagem de germinação das sementes de algodão. A propagação in vitro em meio LGI-P foi melhor na exposição por 4, havendo eliminação da contaminação por fungos e bactérias. A porcentagem de germinação foi de 40%. Tabela 2. Crescimento da haste da plântula do algodão por tubo de ensaio armazenado em sala de crescimento. Tratamentos Altura da haste (cm) 13 a 15* 7 a 10* 1 a 3* Testemunha absoluta álcool 70% etanol70% e 1 - NaClO 2,5% etanol 70% e 2 - NaClO 2,5% etanol 70% e 4 - NaClO 2,5% etanol 70% e 8 - NaClO 2,5% *valores aproximados Figura 1. Sementes de algodão Fabrika` submetidas ao cultivo in vitro em meio LGI-P sob condições de sala de crescimento. 4

5 Figura 2. Estágios de crescimento de plântulas de algodão Fabrika, em meio LGI-P sob condições de sala de crescimento Desinfestação com Benomyl e Cultivo em meio MS Das 25 sementes que haviam sido colocadas em meio MS e mantidas em câmara de crescimento (segundo protocolo), 8 não germinaram, 2 muito pouco, 8 germinaram de forma invertida, 3 com germinação normal e tamanho de haste equivalente a metade do comprimento do tubo de ensaio e 4 com germinação normal e crescimento até o final do tubo de ensaio. Partes vegetativas das plântulas de algodoeiro foram transferidas para meio MS com BAP (Figura 3) a fim de se obter clones. Figura 3. Partes vegetativas das plântulas de algodoeiro em meio MS com BAP, sob condições de sala de crescimento. No processo de desinfestação de sementes, o etanol e os compostos à base de cloro são as substâncias com ação germicida mais utilizadas (Silva et al., 2008). Porém a utilização de uma solução de água com Benomyl sob agitação overnigth, antes do processo de desinfestação das sementes de algodão é um acréscimo à técnica importante, já que o tratamento das sementes com o fungicida proporciona uma menor contaminação do que apenas a utilização de etanol e hipoclorito de sódio. Em meio MS, não foi observada contaminação por fungos e bactérias, isto se deve provavelmente ao tratamento com o fungicida. Neste tratamento, o percentual de germinação foi de 70% Desinfestação sem Benomyl e Avaliação da Germinação 5

6 Das 35 sementes de algodão armazenadas, apenas 8 cresceram satisfatoriamente. Algumas foram contaminadas e a maioria não germinou. O fato de não terem germinado, pode ter sido, dentre outros fatores, o não procedimento de corte da ponta da raiz por um bisturi antes da transferência, e o não tratamento em solução de Benomyl overnigth Germinação em MGC e multiplicação dos clones obtidos em MS Nos testes de germinação in vitro geralmente utiliza-se o meio MS (Golle, 2007; Pinheiro et al., 2001; Silva et al., 2005), já que o mesmo possui uma formulação rica em nutriente muito utilizada em cultura de tecidos de plantas, apresentando altos níveis de nitrato, potássio e amônio (Guerra & Nodari, 2008). Foi testada a germinação das sementes de algodão no meio MS (dados não apresentados), e observou-se que as plântulas não eram vigorosas como o desejado, optou-se pela utilização de outro meio mais simples em sua composição. Logo, verificou-se que o Meio para Germinação de Cotton - MGC (Figura 4) melhor atendeu as necessidades para o desenvolvimento inicial da plântula, e este apresenta como um de seus diferenciais a quantidade de sacarose disponibilizada no meio e a sua menor concentração de sais quando comparado com o meio MS. Além disso, o meio MGC não possui compostos nitrogenados, o que aparentemente não interferiu na germinação das sementes. Outro ponto importante foi que durante o repique manteve-se pelo menos um meristema, o que permitiu que a planta se desenvolvesse sem necessidade de hormônios vegetais suplementados no meio de cultivo. Além de que, o aparecimento de calejamento nas extremidades do explantes era comum nos experimentos anteriores, nos quais se utilizou apenas o hipocótilo como explante inicial (dados não apresentados). Assim, após a escolha do meio adequado à germinação das sementes, e posterior transferências das plântulas para os frascos contendo meio MS (figura 5), obteve-se excelentes resultados quanto ao estabelecimento in vitro das plântulas, que apresentaram bom desenvolvimento sob as condições de temperatura, fotoperíodo e meio de cultivo escolhido. Além disso, observou-se baixa taxa de contaminação in vitro. Figura 4. Plântula de algodoeiro, com 15 dias, mantida em câmara de germinação em Meio para Germinação de Cotton - MGC no tubo Falcon. 6

7 Figura 5. Plântulas de algodoeiro com 30 dias em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) mantidas em sala de crescimento. Agrawal et al. (1997) utilizaram meio de cultura MS suplantado com 2,5 mg.l -1 de benzilaminopurina (BAP) e obtiveram sucesso em seus experimentos de micropropagação com algodão. Os explantes obtidos foram transferidos para outros frascos contendo meio MS suplementado com 1 mg L -1 de BAP. Foi observado um ótimo estabelecimento dos mesmos in vitro, garantindo a obtenção dos clones a partir das plântulas matrizes (Figuras 6 e 7), com raízes bem desenvolvidas e ausência de calejamento. Os meios contendo os clones apresentaram baixos índices de contaminação, sendo os contaminados descartados. Figura 6. Visão geral da bancada contendo os fracos contendo clones de plântulas de algodoeiro in vitro em meio MS, na sala de crescimento do laboratório de Biotecnologia Vegetal - ICIAG. Figura 7. Clones de plântulas de algodoeiro in vitro em meio MS, mantidas na sala de crescimento do laboratório de Biotecnologia Vegetal - ICIAG. 7

8 4. CONCLUSÃO Com base nos resultados obtidos quanto à contaminação, pode-se concluir que (1) as sementes submetidas um maior tempo em hipoclorito de sódio apresentaram menor porcentagem de contaminação; (2) o uso de fungicida é efetivo na desinfestação das sementes; (3) as sementes de algodão submetidas à germinação sob condições de escuro, por uma semana, em BOD e posteriormente transferidas para sala de crescimento apresentaram bons resultados na obtenção de plântulas; (4) verificou-se que o Meio para Germinação de Cotton - MGC melhor atendeu as necessidades para o desenvolvimento inicial da plântula; (5) os frascos contendo meio MS suplementado com 1 mg L -1 de BAP, garantiram resultados esperados quanto ao estabelecimento in vitro das plântulas. 5. AGRADECIMENTOS Agradecemos à FAPEMIG pelo apoio financeiro à pesquisa. À Professora Maria Rita da Universidade Federal de Goiás (UFG) pela ajuda na padronização do cultivo in vitro de plântulas de algodão. Aos professores Jonas Jäger Fernandes, José Magno Q. Luz e Marcus Vinícius Sampaio e membros dos Laboratórios de Biotecnologia Vegetal, Nematologia, Entomologia-Controle Biológico, Fitopatologia e Virologia Vegetal da UFU, que gentilmente cederam instalações e equipamentos para realização de parte do experimento. 6. REFERÊNCIAS Agrawal, D.C., Banerjee, A K., Kolala,R.R., Dhage, A.B., Kulkarni, W.V.,Nalawade, S.M., Hazra, S. and Krishnamurthy, K.V., 1997, In vitro induction of multiple shoots and plant regeneration in cotton (Gossypium hirsutum L.), Plant Cell Reports, Vol.16, pp Carvalho, J. M. F. C., Pimentel, N. W., Aires, P. S. R. and Pimentel, L. W., 2006, Micropropagação in vitro de cultivar de algodão BRS-verde via organogênese utilizando as citocinas BAP e KIN, Campina Grande, Embrapa Algodão, 16 p. Golle, D.P., 2007, Germinação in vitro de Pinus taeda L. a partir de sementes selecionadas. Tese de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental, Universidade Federal de Santa Maria, 97 p. González, E. A. J.,1998, Generalidades del Cultivo in vitro, In: Ponce, J. N. P. (ed.) Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología, Villa Clara, pp Guerra, M. P. and Nodari, R. O., 2008, Apostila de biotecnologia, Disponível em: < Acesso em: 15 ago Murashige, T. and Skoog, F. A., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture, Physiologia Plantarum, Vol. 15, pp Pescador, R., Araújo, P. S. and Maas, C. H., 2000, Protocolos para obtenção de Safrol, Biotecnologia Ciências e Desenvolvimento, Vol.3, n.15, pp Pinheiro, C.S.R., Medeiros, D.N., Macêdo,C.E.C. and Alloufa, M.A.I., 2001, Germinação in vitro de mangabeira (Hancornia speciosa Gomez) em diferentes meios de cultura, Rev. Bras. Frutic. Vol 23 n.2 Jaboticabal, pp Ribeiro, J. M., 2006, Comparison between the techniques of sterilization of plant tissue culture media with sodium hypochlorite and by autoclaving Tese defendida para obtenção do título de Doctor Scientie pela Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, 47 p. Silva, A.L.L., Bisognin, D.A., Barriquello, C.J. and Ritter, C.E.L., 2005, Germinação in vitro de sementes de mogango (Cucurbita pepo l.) cucurbitaceae, Ciência e Natura, UFSM, Vol. 27, n.1: p Silva, P. C., Dias, J. M. M., Neves, J. C. L., Salomão, L. C. S.; Couceiro, M. A.m. and Rocha, M. A., 2008, Protocolo para desinfestação de sementes de tangerineira Cleópatra (Citrus reshni) 8

9 Hort. Ex Tan.). Disponível em: < Acesso em: 28 fev