UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO HEMOPLASMOSE FELINA RELATO DE CASO

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1 UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO QUALITTAS INSTITUTO DE PÓS-GRADUAÇÃO CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA DE PEQUENOS ANIMAIS HEMOPLASMOSE FELINA RELATO DE CASO Adriana Wolf Wander Porto Alegre, jul. 2009

2 UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO ADRIANA WOLF WANDER Aluna do curso de Especialização em Clínica Médica de Pequenos Animais HEMOPLASMOSE FELINA RELATO DE CASO Trabalho monográfico de conclusão do curso de Especialização em Clínica Médica de Pequenos Animais (TCC), apresentado à UCB como requisito parcial para a obtenção do título de Especialização em Clínica Médica de pequenos Animais, sob a orientação da Prof a Fernanda Vieira Amorim da Costa. Porto Alegre, jul. 2009

3 ADRIANA WOLF WANDER HEMOPLASMOSE FELINA RELATO DE CASO Foi analisado e aprovado com grau:... Porto Alegre, de de. Professora Orientadora Porto Alegre, jul iii

4 RESUMO A hemoplasmose felina é causada por hemoplasmas hemotrópicos, ou seja, bactérias pleomórficas que parasitam os eritrócitos dos gatos domésticos. Seus agentes etiológicos já foram chamados de Eperythrozoon felis, Haemobartonella feliz e atualmente são conhecidos como Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis. Estes agentes podem causar anemia primária em gatos, mas quando há co-infecção com as retroviroses felinas, incluindo o vírus da imunodeficiência felina e o vírus da leucemia felina, o quadro clínico é mais grave. Foi demonstrado que as transfusões de sangue infectado são eficazes na transmissão do microorganismo (Gary et al 2006), mas ainda não está provado que parasitas hematófagos, por exemplo, mosquitos e pulgas, são vetores adequados. Os sinais clínicos desta enfermidade incluem principalmente anorexia, anemia regenerativa, icterícia e esplenomegalia. O diagnóstico deve ser firmado quando encontrarmos o microorganismo na avaliação hematoscópica, juntamente com sinais clínicos da doença e a presença de anemia regenerativa, porém, o teste da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é conhecido por ser mais sensível do que a citologia para o diagnóstico e permite a diferenciação das duas espécies de hemoplasmas. O tratamento preconizado inlcui o uso de doxiciclina, mas o uso de enrofloxacina vem sendo sugerido recentemente. O presente trabalho objetiva relatar um caso de hemoplasmose felina, enfatizando os sinais clínicos, diagnóstico e eficácia do tratamento com o uso da doxiciclina. Palavras-chave: hemoplasmas; anemia; gatos. ABSTRACT The feline hemoplasmosis is caused by hemoplasmas hemotrópics, or pleomorphic bacterias that parasite the domestic cats erythrocytes. Their etiologic agents have already been called Eperythrozoon felis, Haemobartonella felis and nowadays they are known as Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum and Candidatus Mycoplasma turicensis. These agents may cause primary anemia in cats, but when there are co-infection with feline retrovirosis, including the feline immunodeficiency virus and the feline leukemia virus, the clinical picture is more severe. It was shown that the transfusion of infected blood are effective in the transmission of the microorganism (Gary et al 2006), but is not yet proven that hematophagous parasites, such as mosquitoes and fleas, are suitable vectors. The clinical signs of this disease mainly include anorexia, regenerative anemia, jaundice and splenomegaly. The diagnosis must be established when the microorganism is found in the hematoscopic assessment, in assossiation with clinical signs of the disease and the presence of regenerative anemia, however, the test of Polymerase Chain Reaction (PCR) is known to be more sensitive than cytology for the diagnosis and also allows the differentiation of two species of hemoplasmas The recommended treatment includes the use of doxycycline, but the use of enrofloxacin has been suggested recently. This study aims to report a case of feline hemoplasmosis, emphasizing the clinical signs, diagnosis and effective treatment with the use of doxycycline. Key-words: hemoplasma; anemia; cat. iv

5 SUMÁRIO Resumo... iv Lista de Figuras... vi Parte 1....R evisão bibliográfica I ntrodução E tiologia H istórico E pidemiologia P atogênese S inais Clínicos D iagnóstico...10 v

6 1.8...T ratamento P rognóstico R elato de caso D iscussão e conclusão...20 Anexos...22 Referências bibliográficas...23 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - M. haemofelis e M. haemominutum em sangue de gatos infectados... 3 Figura 2 - Precursores imaturos de células eritróides em um gato portador do vírus para leucemia viral felina... 9 Figura 3 - Esfregaço sanguíneo demostrando a presença de M. haemofelis em aproximadamente 50% dos eritrócitos vi

7 Figura 4 - Esfregaço sanguíneo demostrando a presença de M. haemofelis em aproximadamente 65% dos eritrócitos vii

8 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1. INTRODUÇÃO A anemia infecciosa felina ou hemoplasmose felina é causada por hemoplasmas hemotrópicos, ou seja, bactérias pleomórficas que parasitam os eritrócitos dos gatos domésticos. Por esta razão, suas principais espécies, Mycoplasma haemofelis e Candidatus Mycoplasma haemominutum, são comumente conhecidas como hemoplasmas felinos (Neimark et al 2001, Messick 2004). A hemoplasmose causa um distúrbio hemolítico extravascular que também pode acometer caninos, bovinos, búfalos, veados, ratos, porcos da Índia, esquilos, caprinos, macacos e pessoas (Harvey e Gaskin 1978). A doença tem maior importância em gatos domésticos e, nos caninos, é uma patologia incomum, acometendo principalmente animais esplenectomizados (Jones 2000). O modo de transmissão ainda não foi completamente elucidado, mas suspeita-se que ocorra através da transferência de sangue de um gato para outro (Norsworthy 2004). Foi demonstrado que as transfusões de sangue infectado são eficazes na transmissão do microorganismo (Gary et al 2006), mas ainda não está provado que parasitas hematófagos, por exemplo, mosquitos e pulgas, são vetores adequados (Norsworthy 2004). A infecção já foi realizada experimentalmente por injeções parenterais de sangue e também por administração de sangue infectado por via oral (Hoskins 1991). Acredita-se não haver predileção por raça ou sexo, contudo, parece que os machos são mais propensos a apresentarem a hemoplasmose devido aos hábitos mais freqüentes de ambulação e luta, e, com isso, maior exposição a gatos infectados por M. haemofelis (Harvey 1998). Gatos mais jovens do que 6 anos de idade, têm maior risco de desenvolver hemoplasmas hemotrópicos, porém, esse risco declina em gatos idosos (Hayes e Priester 1973, Grindem et al 1990, Harrus et al 2002). Um resultado positivo no exame de detecção do vírus da Leucemia felina 1

9 (FeLV) e histórico de abscessos causados por mordidas de outros gatos também têm sido identificados como um fatores de risco (Grindem et al 1990). Apesar de ser uma das principais causas de anemia em gatos, ainda existem poucas informações disponíveis em relação à sua epidemiologia e às doenças que este parasito causa. Um dos principais fatores limitantes à investigação desse organismo é que ainda não há sucesso no seu cultivo fora do hospedeiro. Contudo, recentemente, estudos moleculares têm avançado nosso entendimento sobre a sua natureza e patogenicidade (Tasker e Lappin 2002). A hemoplasmose é uma doença comum em felinos domésticos. Porém, o seu diagnóstico só pode ser firmado quando encontrarmos o microorganismo na análise hematoscópica, juntamente com sinais clínicos da doença e a presença de anemia regenerativa (Grace 2004). Entretanto, devido à alta freqüência de falso-negativo na avaliação hematoscópica de esfregaços sanguíneos, a enfermidade é pouco diagnosticada. O teste da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é conhecido por ser mais sensível do que a citologia para o diagnóstico e permite a diferenciação das duas espécies de hemoplasmas (Berent et al., 1998; Foley et al., 1998; Westfall et al., 2001). O presente trabalho objetiva relatar um caso de hemoplasmose felina, enfatizando os sinais clínicos, diagnóstico e eficácia do tratamento com o uso da doxiciclina ETIOLOGIA Os hemoplasmas hemotrópicos são organismos pequenos (0,3 a 0,8 µm), gram-negativos, epicelulares, firmemente aderidos à membrana dos eritrócitos (Davenport 1994). Não possuem parede celular nem flagelo, são resistentes à penicilina e seus análogos, mas são suscetíveis à tetraciclina (Neimark et al 2001, 2002). Estudos ultra-estruturais, em meados dos anos 60, mostraram claramente que esses parasitas estão na superfície das células vermelhas sanguíneas e não parecem penetrar no interior das mesmas. (Small e Ristic 1967). Os hemoplasmas possuem DNA e RNA e se replicam por divisão binária. Esses organismos não têm sido cultivados fora de seus hospedeiros, diferenciando-os assim da espécie Bartonella, pois essas são bactérias que podem ser cultivadas em células livres (Harvey 1998). 2

10 Foram identificadas duas linhagens distintas de M. felis (Figura 1). A forma grande, Mycoplasma haemofelis (Mhf), relativamente patogênica associada à anemia hemolítica grave em gatos imunocompetentes, e a forma pequena, Candidatus Mycoplasma haemominutum (Mhm), não associada à doença em gatos imunocompetentes. (Foley et al 1998, Jensen et al 2001, Westfall et al 2001). Entretanto, gatos co-infectados com Mhm e FeLV são mais susceptíveis a desenvolver a anemia clínica do que gatos infectados apenas com o Mhm. Há alguns indícios que o desenvolvimento de doenças mieloproliferativas é acelerado em gatos infectados concomitantemente com Mhm e FeLV (George et al 2002). Análises da seqüência do gene 16S do DNA ribossômico mostraram uma semelhança genética de 83% entre o M. haemofelis e Candidatus M. haemominutum (Foley e Pedersen 2001). Figura 1: M. haemofelis (nas células azuis) e M. haemominutum (seta, nas células vermelhas) em sangue de gatos infectados. Fonte: Foley et al Recentemente, um novo hemoplasma, Candidatus Mycoplasma turicensis (Mtc), foi detectado em gatos na Suiça com história de hemólise intravascular grave (Willi et al 2005). Posteriormente, esta espécie foi descrita em gatos na Austrália, Reino Unido, África do Sul e Estados Unidos, sugerindo uma distribuição mundial. No Brasil este parasita foi descrito apenas 3

11 em felinos selvagens mantidos em zoológicos (Willi et al 2007). Análises da seqüência do gene 16S rrna revelaram que esse organismo está mais estreitamente ligado ao Mycoplasma coccoides e ao Mycoplasma haemomuris, ambos espécies de hemoplasmas de roedores (Iralu e Ganong 1983), do que a outros hemoplasmas felinos. Sua inoculação em gatos resultou em anemia, apesar de sua patogenicidade em condições naturais ainda não ser bem entendida (Sykes et al 2008). Também foram detectadas, por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), provas moleculares de infecção em 2 de 263 gatos com e sem anemia por um organismo semelhante, o Candidatus Mycoplasma haematoparvum, que é um hemoplasma canino(sykes et al 2008). Através de testes de análises da seqüência do gene 16S rrna, verificou-se que o M. haemofelis apresenta mais semelhanças com o M. haemocanis, que causa anemia em cães esplenectomizados, do que com outros M. haemofelis isolados, e por causa disso, foi sugerido que M. haemofelis e M. haemocanis sejam o mesmo organismo infectando diferentes espécies de animais (Brison e Messick 2001, Birkenheuer et al 2002). Ao se inocular o sangue de cães infectados com M. haemocanis em gatos sadios, estes permaneceram assintomáticos, mas o sangue desses gatos, quando inoculado em cães, reproduz a doença (Lumb 2001). Em outro experimento, o sangue de gatos infectados com M. haemofelis foi inoculado em gatos suscetíveis, em cães esplenectomizados e em cães não esplenectomizados, não resultando em anemia ou bacteremia citologicamente detectável nesses animais (Splitter et al 1956 e Lumb 2001). Por causa desses resultados e devido à morfologia diferente desses dois organismos, alguns autores acreditam que o seqüenciamento do gene 16S rrna pode não ser adequado para diferenciar essas espécies (Sykes 2003). Desde o desenvolvimento da PCR para a detecção dos hemoplasmas hemotrópicos, vários estudos têm investigado a prevalência da infecção com Mhm e Mhf em diferentes países, incluindo África do Sul (Lobetti e Tasker 2004), EUA (Hackett et al e Eberhardt et al 2006, Ishak et al 2007), Austrália (Tasker et al 2004), Suiça (Willi et al 2006), Reino Unido (Tasker et al 2003) e Japão (Watanabe et al 2003). 4

12 Morais et al (2008) descreveram a primeira infecção dupla com Mhf e Mhm, na América do Sul, descrevendo sinais clínicos e anormalidades laboratoriais idênticos às observadas em outras partes do mundo HISTÓRICO Em 1942, Clark descreveu uma infecção por Eperythrozoon em um gato anêmico na África do Sul nomeando a espécie de Eperythrozoon felis. Flint & Moss, em 1953, através de um método experimental, descreveram nos EUA, um organismo similar causando anemia infecciosa em gatos. Em 1955, Flint e Mc Kelvie sugeriram que esse organismo fosse nomeado de Haemobartonella felis, pois ao contrário da espécie Eperythrozoon, ele não era visto livremente no plasma, além de serem identificadas formas anelares do parasito. A H. felis foi então descrita mundialmente (Anderson & Charleston 1967, Bedford1970, Bobade & Akinyemi 1981, Clark 1942, Espada et al 1991, Flagstad & Larsen 1969, Hatakka 1972, Maede et al 1974, Manusu 1961, Mrljak et al 1995, Prieur 1960, Seamer & Douglas 1959, Théry 1966) embora estudos descrevendo a prevalência da infecção em gatos de diferentes partes do mundo sejam escassas. A descrição em gatos domésticos no Brasil foi relatada pela primeira vez em 1976 (Massard et al). Em 1993, o microorganismo foi classificado na família Anaplasmataceae, na ordem Rickettsiales (Carney e England). Posteriormente, achados moleculares provaram que a H. felis era a causa da anemia infecciosa felina (Berent et al 1998, Cooper et al 1999). Em 1997, a análise da seqüência do gene 16S rrna demonstrou que alguns membros dos gêneros Hemobartonella e Eperythrozoon pertencem ao gênero Mycoplasma (Neimark e Kogan, Rikihisa et al). Em 1998, alguns estudos também documentaram a existência de diferentes linhagens que podem, em última análise, provar haver espécies diferentes de Haemobartonella (Berent et al 1998, Foley et al 1998, Messick et al 1998, Rikihisa et al 1997). Sendo assim, a Haemobartonella felis foi reclassificada como Mycoplasma haemofelis (Neimark et al 2001). 5

13 Para Sykes et al 2003, a reclassificação desses microorganismos como hemoplasmas pode parecer inapropriado inicialmente, com base na sua associação com eritrócitos, pois outros agentes micoplasmas patogênicos geralmente estão associados com superfícies mucosas dos tratos respiratórios e urogenital causando, ocasionalmente, doenças artríticas. Mas, acredita que a reclassificação das espécies Haemobartonella e Eperythrozoon como Mycoplasma irá ajudar nos estudos desses organismos no futuro. 1.4 EPIDEMIOLOGIA Gatos mais jovens do que 6 anos de idade têm maior risco de desenvolver hemoplasmas hemotrópicos, porém, esse risco declina em gatos idosos (Hayes e Priester 1973, Grindem et al 1990, Harrus et al 2002). Acredita-se não haver predileção por raça ou sexo, contudo, parece que os machos são mais propensos a apresentarem a hemoplasmose, devido aos hábitos mais freqüentes de ambulação e luta, com maior exposição a gatos infectados por M. haemofelis (Harvey 1998). A freqüência pode também ser maior nos meses de primavera e verão, presumivelmente como conseqüência do aumento dos passeios dos gatos para fora de casa (Hayes e Priester 1973). Um resultado positivo no exame de detecção de FeLV e histórico de abscessos também têm sido identificados como fatores de risco (Grindem et al 1990). O Mycoplasma haemofelis pode causar anemia primaria em gatos e também é comumente reconhecido com um patógeno associado às retroviroses, incluindo o vírus da imunodeficiência felina e o vírus da leucemia felina, assim como outras doenças debilitantes (Kociba et al 1983, Bobade et al 1988, Lappin 1995, Grindem et al 1990, Harrus et al 2002, George et al 2002). Estudos indicam o Candidatus Mycoplasma haemominutum como a espécie mais prevalente, seguido pelo Candidatus Mycoplasma turicensis e em seguida M. haemofelis (Willi et al 2006, Sykes et al e Peters at al 2008). Willi et al (2006) detectaram DNA de Mhm e Mhf tanto em gatos saudáveis como em gatos doentes, já o Mtc foi detectado somente em gatos doentes. 6

14 O modo de transmissão ainda não foi completamente elucidado, mas suspeita-se que ocorra através da transferência de sangue de um gato para outro (Norsworthy 2004). Foi demonstrado que as transfusões de sangue infectado são eficazes na transmissão do microorganismo (Gary et al 2006), mas ainda não está provado que parasitas hematófagos, por exemplo, mosquitos e pulgas, são vetores adequados (Norsworthy 2004). A infecção já foi realizada experimentalmente por injeções parenterais de sangue e também por administração de sangue infectado por via oral (Hoskins 1991). Os gatos portadores servem como reservatórios da infecção, uma vez que o M. haemofelis pode ser um organismo comensal em gatos saudáveis e a infecção pode resultar em doença aguda quando os gatos infectados são submetidos a condições de estresse ou acometidos por infecções ou doenças concomitantes, como a infecção pelo vírus da leucemia felina, Diabetes melittus, dentre outras (Harvey 1998). Segundo Messick (2003), o M. haemofelis pode desaparecer e reaparecer ciclicamente na superfície das células vermelhas do sangue dos gatos. Em menos de uma hora, múltiplos organismos detectados em eritrócitos infectados podem transformar-se em não detectáveis, pois é possível que os organismos alterem os antígenos de superfície celular permitindo que eles se separem da célula sanguínea. A perda da capacidade de aderência às células de seus hospedeiros traz vários benefícios para o M. haemofelis, contribuindo para a sua sobrevivência. Ela permite o desenvolvimento de um estado de portador, por mutação ou por sobreposição de certos antígenos superficiais, o que inibe a resposta imune e faz com que o M. haemofelis estabeleça uma infecção em outro tipo de célula. O retorno da aderência nos eritrócitos auxilia em um novo ciclo de infecção, facilitando assim a transmissão do M. haemofelis para um vetor sugador de sangue. Lappin et al (2003), em seu estudo, mostraram que pulgas infectadas com M. haemofelis podem transmitir o parasita e produzir a doença em gatos suscetíveis. Entretanto, a transmissão do M. haemominutum por pulgas não foi bem sucedida e os autores sugeriram que o baixo número de pulgas usado no estudo poderia ser responsável por esses achados negativos. (Lappin et al 2003). Para Woods et al (2005), o vetor em potencial para ambos os hemoplasmas de gatos é a pulga Ctenocephalides felis. Pereita e Santos (1998) acreditam que, por serem encontradas 7

15 comumente nos gatos brasileiros, as pulgas podem servir como vetores da doença na América do Sul. 1.5 PATOGÊNESE A hemoplasmose causa um distúrbio hemolítico (Harvey e Gaskin 1978), sendo a hemólise classificada primariamente como extravascular. As células parasitadas são identificadas como anormais pelo sistema imune e retiradas da circulação sanguínea através de eritrofagocitose, a qual é realizada pelos macrófagos no baço, fígado, pulmões e medula óssea (Norsworthy 2004 e Fighera 2001). Os organismos podem ainda ser retirados dos eritrócitos por um processo denominado corrosão ( pitting ). Em alguns casos, desenvolve-se uma anemia hemolítica imune-mediada secundária à infecção, podendo ocorrer hemólise intravascular e, assim, hemoglobinúria (Fighera 2001). Diversos mecanismos estão envolvidos no desenvolvimento da anemia, dentre eles destacam-se: 1) lesão direta das hemácias, causada pela interação de anticorpos e sistema complemento contra os antígenos de M. haemofelis; 2) hemólise imune-mediada pela exposição de antígenos das próprias hemácias que resultam na produção de anticorpos; 3) eritrofagocitose, na qual hemácias parasitadas são fagocitadas por macrófagos e destruídas no baço; 4) seqüestro de hemácias nos pequenos vasos por causa da formação de esferócitos que, por serem menores e pouco deformáveis, são destruídos no sistema mononuclear fagocitário (Harvey 1998). A infecção aguda com M. haemofelis está associada com uma parasitemia massiva dos eritrócitos, causando anemia hemolítica grave e, às vezes, fatal. A anemia associada com a infecção por M. haemofelis é tipicamente regenerativa, mostrando anisocitose e policromasia, com um aumento absoluto do número de reticulócitos. Contudo, a gravidade da anemia depende do estágio da infecção e o hematócrito pode cair para menos de 20% no pico da parasitemia. A PCR tem sido usada para correlacionar a presença da parasitemia com a doença clínica em gatos que foram experimentalmente infectados com M. haemofelis (Berent et al 1998, Messick et al 1998). Os gatos saudáveis que foram infectados experimentalmente com M. haemominutum desenvolveram apenas mínimos sinais clínicos da doença aguda e mudanças hematológicas 8

16 negligenciáveis. O hematócrito dos gatos declinou ao longo de todo o curso da infecção, mas nunca abaixo dos valores de referência para gatos (Foley et al 1998). Foi sugerido que gatos que possuem infecção retroviral pré-existente podem ter um grande risco de se infectarem por hemoplasmas felinos, desenvolvendo sinais de anemia mais graves do que gatos infectados apenas com o parasita (Nash e Bobade 1986, Grindem et al 1990, Lappin 1995, Harrus et al 2002, Hartmann et al 2001, George et al 2002, Inokuma et al 2004). Sendo assim, gatos que estão co-infectados com hemoplasma e retrovírus apresentam risco maior de desenvolver linfoma, leucemia e síndrome da imunodeficiência adquirida (Priester e 1973; Cotter et al 1975; Bobade et al 1988; George et al 2002; Harrus et al 2002). A infecção crônica por M. haemofelis pode promover transformações neoplásicas das células hematopoiéticas em gatos infectados por FeLV (Figura 2). É também importante reconhecer que apesar de uma intensa resposta imunológica ou tratamento com antibiótico, os gatos infectados tanto com M. haemofelis ou M. haemominutum provavelmente ainda serão portadores crônicos do parasita (Messick 2003). Figura 2: Precursores imaturos de células eritróides em um gato portador do vírus para leucemia viral felina. Notar os parasitas epicelulares nos eritrócitos. Fonte: Messick (2003). 9

17 1.6 SINAIS CLÍNICOS Os sinais clínicos observados incluem letargia, anorexia, febre e anemia, tanto em gatos infectados naturalmente e como experimentalmente. Em geral, a temperatura retal é normal, exceto na fase aguda, quando se encontra aumentada e, na fase terminal da doença, pode ainda se apresentar diminuída (Hagiwara 2003). Entretanto, a pirexia normalmente é intermitente e o animal pode apresentar picos febris que ocorrem quando o número de parasitas é maior na circulação periférica. A esplenomegalia e a icterícia são causadas principalmente pela hemólise intravascular e podem ser vistas ocasionalmente (Messick 2003). O exame físico revela mucosas pálidas ou ictéricas, aumento do esforço ventilatório (especialmente em situação de estresse), sopro cardíaco sistólico suave, taquicardia, taquipnéia e esplenomegalia palpável (Norsworthy 2004; Grace 2004). A infecção pode ser assintomática na doença subclínica, de forma que os animais apresentem apenas uma anemia discreta. Os sintomas estão na dependência do estado da doença e da rapidez com que se desenvolve a anemia. Se a anemia se desenvolver gradualmente, o gato pode exibir perda de peso, mas se mantém vivaz e alerta. Ao contrário, a diminuição precoce e acentuada do hematócrito, em associação com a parasitemia grave, pode causar pouca diminuição do peso corporal, mas uma marcante depressão mental (Hagiwara 2003). 1.7 DIAGNÓSTICO Os achados hematológicos são de anemia hemolítica com intensa regeneração, resultando em uma anemia macrocítica hipocrômica. Evidencia-se policromasia e anisocitose excessivas, presença de grande quantidade de corpúsculos de Howell-Jolly e precursores eritróides nucleados (metarrubrícitos e rubrícitos). O plasma mostra-se ictérico, podendo raramente apresentar-se avermelhado, em virtude de eventual hemólise intravascular. Quando 10

18 ocorre o desenvolvimento da anemia hemolítica imune-mediada, podemos encontrar esferócitos em grande quantidade, bem como eritrofagocitose (Fighera (2001). O método mais comumente usado para o diagnóstico definitivo da hemoplasmose é a verificação dos organismos na superfície dos eritrócitos durante o exame microscópico de um esfregaço sanguíneo de bem confeccionado (Butt 1990). O microorganismo é encontrado ao redor da periferia do eritrócito, podendo estar sozinho, em pares ou em cadeias nas infestações graves (Figura 3). Na avaliação da hematoscopia, o parasita encontra-se em forma de anel, bastão ou pequenos pontos formando cadeias. É importante salientar que esses não devem ser confundidos com precipitados de proteína, debris que se depositam no fundo da lâmina ou artefatos (VanSteenhouse et al 1993). Estes se diferenciam dos hemoplasmas por apresentarem bordas irregulares e aparecerem com menor coloração quando os eritrócitos estão focados no microscópio (Tasker e Lappin 2002). Os M. haemofelis também devem ser diferenciados de outras inclusões eritrocitárias, como por exemplo, os corpúsculos de Howell-Jolly, que são encontrados constantemente em qualquer anemia regenerativa (Hahn 1999) e representam resquícios de núcleo eritrocitário, os quais podem ser diferenciados do M. haemofelis simplesmente por apresentarem maior tamanho (Figura 4) (Bobade e Nash 1987, Small e Ristic 1967). Figura 3: Esfregaço sanguíneo demostrando a presença de M. haemofelis em aproximadamente 50% dos eritrócitos. Fonte: Tasker e Lappin (2002). 11

19 Figura 4: Esfregaço sanguíneo demostrando a presença de M. haemofelis em aproximadamente 65% dos eritrócitos. Formas anelares de M. haemofelis são visíveis (setas grandes). Corpúsculos de Howell-Jolly, que se apresentam maiores e mais densos, podem ser vistos para comparação (setas menores). Fonte: Tasker e Lappin (2002). O diagnóstico de hemoplasmose pode ser firmado quando encontrarmos o microorganismo juntamente com sinais clínicos e a presença de anemia regenerativa. O M. haemofelis é observado em muitos gatos assintomáticos, portanto, a simples presença desse microorganismo no esfregaço sanguíneo não deve resultar em um diagnóstico de hemoplasmose. Quando o microorganismo é identificado, além de associar o diagnóstico aos sinais clínicos do paciente, deve-se investigar alguma causa adjacente, pois a hemoplasmose pode ocorrer secundariamente à outra doença ou um evento gerador de estresse (Grace 2004). Os microorganismos se destacam das hemácias quando o sangue é preservado com anticoagulante. Por esta razão, recomenda-se a confecção do esfregaço com sangue fresco, imediatamente após a sua colheita (Hagiwara 2003, Alleman et al 1999). A súbita ausência da parasitemia detectável é atribuída à rápida depuração das hemácias parasitadas por macrófagos no baço, fígado e medula óssea (GAUNT 2000), o que contribui para a anemia progressiva. A menos que os parasitas estejam presentes na circulação sanguínea, é praticamente impossível diferenciar hemoplasmose de anemia hemolítica auto-imune (Harvey 1998), já que o teste de Coomb s pode ser positivo na fase aguda e negativo na fase crônica (Hagiwara 2003). Devemos proceder a contagem de reticulócitos (eritrócitos imaturos) circulantes sempre que o hematócrito estiver menor que 20 %, para que possa ser avaliada a resposta da medula 12

20 óssea à anemia (Grace 2004). A contagem de reticulócitos fica substancialmente aumentada, a menos que ela tenha sido feita imediatamente após uma queda abrupta no volume globular, ou se existe concomitantemente alguma doença supressora da medula óssea. Depois da hemólise, deverão transcorrer quatro a seis dias para que aumente a contagem de reticulócitos (Norsworthy 2004). Podem estar presentes dois tipos de reticulócitos. Os reticulócitos agregados refletem mais uma resposta regenerativa recente, pois contém numerosos aglomerados de ribossomos que se coram intensamente de azul, enquanto que reticulócitos pontilhados contém pequenos aglomerados de material ribossômico (Grace 2004). A presença de reticulócitos agregados é o indicador mais confiável de uma resposta regenerativa recente, sabendo-se que diante de uma anemia grave, que estimule a produção de eritrócitos, há a presença de 0,5% a 5% de reticulócitos agregados (Grace 2004). Eritrócitos nucleados circulantes não indicam resposta regenerativa, a menos que estejam acompanhados por aumento da contagem de reticulócitos. As causas do aparecimento de eritrócitos nucleados circulantes na ausência de anemia regenerativa são neoplasia, lesão hipóxica ou tóxica da medula óssea, intoxicação por chumbo e esplenomegalia (Grace, 2004). Cerca da metade de todos os gatos com hemoplasmose clínica são positivos para FeLV. Embora se saiba que a infecção por FeLV suprime a imunidade e predispõe gatos a diversas doenças infecciosas, o oposto também pode ser verdade. Estudos experimentais demonstram que a hemoplasmose pode predispor gatos à infecção por FeLV (Norsworthy 2004). Na avaliação bioquímica, destacam-se os altos níveis de bilirrubina, principalmente em sua fração não-conjugada (indireta), e o aumento da atividade da alanina aminotransferase, decorrentes da necrose hepática secundária à anemia aguda e hipóxia decorrente. Em casos mais raros, nos quais ocorre um componente hemolítico intravascular, podemos ter aumento da uréia e creatinina, pela ação tóxica que a hemoglobina exerce no néfron (Grauer e Lane 1995). Devido à dificuldade de cultivo do M. haemofelis, até recentemente o diagnóstico da infecção era primariamente baseado na identificação citológica dos organismos na superfície das células sanguíneas vermelhas. Entretanto, há vários fatores que resultam em casos falso-positivos e falso-negativos quando se utiliza esse método de diagnóstico (Tasker e Lappin, 2002). O teste 13

21 da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é conhecido por ser mais sensível do que a citologia para o diagnóstico e permite a diferenciação das duas espécies de hemoplasmas (Berent et al., 1998; Foley et al., 1998; Westfall et al., 2001), sendo atualmente o teste de escolha para o diagnóstico da infecção por M. hemofelis por ser comercialmente viável em muitos laboratórios da América do Norte. A disponibilidade de um teste de diagnóstico sensível tem permitido estudos mais precisos, inclusive para se avaliar a eficácia do tratamento (Tasker e Lappin, 2002). O exame da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica molecular sensível que permite a amplificação de um fragmento particular de DNA de um microorganismo (Messick 2003). A amplificação do gene 16S do DNA ribossômico é a base para todos os ensaios de PCR desenvolvidos até hoje para a detecção de hemoplasmas hemotrópicos (Foley et al 1998, Berent at al 1998, Messick 1998, Jensen et al 2001). Dois ensaios distintos baseados na PCR são utilizados para detectar a infecção no gato: um ensaio detecta M. haemofelis, e outro detecta C. M. haemominutum (Messick 2003). A PCR que foi desenvolvida para a detecção do M. haemofelis (Berent at al 1998) também detecta o parasita canino M. haemocains (Brinson e Messick 2001). Jensen e colaboradores desenvolveram, em 2001, um único teste de PCR para a detecção de ambas as espécies de hemoplasmas hemotrópicos que infectam gatos. Braddock, J.A.; Tasker, S.; Malik R. (2004) relataram pela primeira vez a utilização de uma PCR em tempo real para a confirmação do diagnóstico de infecção por M. haemofelis e para quantificar a resposta a um tratamento em gatos infectados naturalmente. Para chegar-se a um diagnóstico, deve-se associar a visualização de organismos em um esfregaço sanguíneo, a presença de um elevado número de cópias de M. haemofelis quantificados por PCR e a identificação de uma grave anemia regenerativa com uma resposta ao tratamento com doxiciclina, pois resultados positivos da PCR para M. haemofelis têm sido relatados em gatos saudáveis assintomáticos (Tasker et al 2003a). A eficiência do tratamento é obtida com um resultado negativo na PCR obtido 383 dias após o término do tratamento de 42 dias com doxiciclina. Existe a possibilidade de um resultado falso-negativo quando os microorganismos são seqüestrados em órgãos como o baço e os pulmões, pois desse modo, a PCR do sangue periférico produz um resultado negativo (Tasker et al 2003b). 14

22 Recentemente, um estudo realizado por Peters et al (2008) mostrou que é possível desenvolver um teste de PCR espécie-específico para hemoplasmas felinos, baseado na seqüência 16S do DNA ribossômico do microorganismo, duplicado com um ensaio de controle interno baseado no 28S do DNA ribossômico felino. Essa foi a primeira descrição desse tipo de ensaio para o diagnóstico de infecções por hemoplasmas felinos (Peters et al 2008). Os testes descritos anteriormente (Tasker at al 2003, Willi et al 2005, Willi et al 2006) não tinham incluído uma avaliação de controle interno. A vantagem do uso de um ensaio de controle interno é que ele permite a confirmação de que a amostra contém DNA amplificado e que os fatores inibitórios da PCR não estão presentes. Além disso, a utilização de um teste de controle interno em uma duplicação permite a confirmação de que a amostra foi adicionada à reação. O sangue contém uma série de potenciais inibidores de PCR (Al-Soud and Radstrom 2001) e embora alguns, como a hemoglobina, possam ser visíveis no DNA extraído, outros poderão ser incolores e sua presença impossível de detectar sem a utilização de um teste de controle interno (Peters et al 2008). 1.8 TRATAMENTO As medicações recomendadas pela literatura incluem tetraciclina 1 na dosagem de 20 mg/kg a cada 8 horas, por via oral, durante 21 dias (Harvey 1998), cujos efeitos colaterais incluem principalmente febre. A tetraciclina não elimina totalmente o microorganismo, e desta maneira, os animais recuperados permanecem infectados de forma crônica, o que pode ser verificado pela PCR (Berent et al 1997, Gaunt 2000). Outra medicação de escolha é a doxiciclina 2, na dosagem de 5 a 10 mg/kg a cada 12 ou 24 horas, por via oral, durante 21 dias (Berent et al 1998, Foley et al 1998). O efeito colateral mais observado foi irritação da mucosa gastrointestinal, resultando em desconforto abdominal, vômito e anorexia em gatos e cães (Melendez et al 2000). Foram relatados casos de formação de estenose esofágica após a administração oral de comprimidos de doxiciclina. (McGrotty e Knottenbelt 2002, Melendez et al 2000), devido à esofagite e posterior fibrose que o medicamento causa no local. Para minimizar esse efeito, sugere-se a administração da medicação antes de uma 1 Tetraciclina Schering-Plough, Cotia São Paulo 2 Doxiciclina Univet, São Paulo SP 15

23 refeição ou seguida por um pequeno volume de água dado através de uma seringa, por via oral, para encorajar o felino a engolir completamente o comprimido. Vários gatos infectados experimentalmente tiveram episódios recorrentes dos sinais clínicos e apresentaram resultados laboratoriais anormais, incluindo parasitemia e anemia após o tratamento com doxiciclina (Foley et al 1998). Outros antibióticos anti-hemoplasmas, incluindo enrofloxacina 3 e azitromicina 4, têm sido propostos para o tratamento da hemoplasmose (Winter 1993, Westfall et al 2001). O uso da enrofloxacina, na dosagem de 5 a 10 mg/kg a cada 24 horas, por via oral, durante 14 dias, foi considerado igual ou superior à doxiciclina no tratamento de infecções por hemoplasmas em gatos (Dowers et al 2002). A sua freqüência de utilização de uma vez ao dia e a baixa incidência de efeitos adversos tornam seu uso atrativo (Dowers et al 2002). Cegueira aguda e irreversível e degeneração de retina têm sido relatadas em gatos tratados com enrofloxacina, entretanto, a prevalência dessa toxicidade é desconhecida (VanSteenhouse et al 1993). Tem sido demonstrado que a azitromicina controla surtos de infecções no trato respiratório por hemoplasmas em humanos, mas foi ineficaz como tratamento os parasitas de eritrócitos na dosagem de 15 mg/kg, por via oral, com intervalos de 12 horas (Wesfall et al 2001). Estudos também demonstraram que a administração de diproprionato de imidocarb 5 na dose de 5 mg/kg, por via intramuscular, duas vezes por semana, tanto em gatos com M. haemofelis como em gatos com M. haemominutum não é efetiva em deixar o animal livre da infecção. (Lappin et al 2002). Deste modo, o tratamento com doxiciclina ou enrofloxacina pode controlar efetivamente a infecção aguda nos gatos, mas nenhum dos antibióticos testados até hoje conseguem curar o paciente de forma consiste (Messick 2003). Norsworthy (2004) preconiza ainda o confinamento em gaiolas para minimizar o estresse em gatos anêmicos e a transfusão de sangue total em gatos que apresentam volumes globulares abaixo de 15%, lembrando apenas que os eritrócitos transfundidos também estão sujeitos ao 3 Baytril Bayer, São Paulo - SP 4 Zitrex Cepav, São Paulo - SP 5 Imizol - Schering-Plough, Cotia São Paulo 16

24 parasitismo. O autor sugere ainda o uso de prednisolona 6 na dose de 1 a 2 mg/kg, por via oral, a cada 8 ou 12 horas, para reduzir a eritrofagocitose, estimular a medula óssea e aumentar o apetite, não esquecendo do apoio nutricional com alimentação por sonda orogástrica ou nasogástrica A administração de sangue total, na dosagem de 2 a 3 ml/kg por hora, com dose máxima de 30 ml/kg pode ser uma medida útil em gatos com anemia intensa. Contudo, apenas o uso do hematócrito como indicador da necessidade de transfusão pode ser errôneo, pois muitos gatos com anemia crônica grave mostram-se relativamente estáveis. A presença de hemólise ou hemorragia aguda justifica uma transfusão sangüínea se o hematócrito estiver menor que 20% (Grace 2004) PROGNÓSTICO O prognóstico para a hemoplasmose felina geralmente é bom se a crise anêmica puder ser rapidamente revertida. Porém, alguns gatos sofrem anemias fatais em decorrência de baixíssimos volumes globulares. O estado de portador que freqüentemente ocorre deixa o gato susceptível à recidiva. Esse gato não deve doar de sangue, mas é considerado como nãocontagioso para outros gatos, mesmo sendo portador (Norsworthy 2004). 6 Predi-Medrol União Química, Pouso Alegre MG 17

25 18

26 2. RELATO DE CASO Um animal da espécie felina, sem raça definida, fêmea, com aproximadamente seis anos de idade, pesando 2,3 Kg foi atendido na Clínica Veterinária A Casa do Snoopy, em Porto Alegre - Rio Grande do Sul. O animal apresentava anorexia, emagrecimento e apatia há cerca de dois meses. Ela era proveniente de um sítio que abrigava cerca de 60 gatos, todos recolhidos da rua, castrados, alimentados com alimento super Premium e tratados há nove meses contra endo e ectoparasitas. O exame clínico revelou mucosas pálidas. desidratação, desnutrição, fraqueza, taquipnéia e esplenomegalia. O animal foi submetido à oxigênio-terapia por vinte minutos por causa da dificuldade respiratória e recebeu fluidoterapia intravenosa com 150 ml durante 2 horas de Solução de cloreto de sódio a 0,9% 7 como tratamento emergencial. Após este período, a gata já estava um pouco mais ativa e respirava melhor, demonstrando inclusive aumento do apetite. Os exames hematológicos mostraram grave anemia regenerativa macrocítica normocrômica, leucocitose com desvio à esquerda, trombocitopenia, plasma ictérico e presença de Mycoplasma haemofelis na avaliação da hematoscopia (ANEXO 1). O exame ultra-sonográfico evidenciou esplenomegalia, presença de gás no estômago, linfonodos mesentéricos hipoecogênicos e aumentados, hepatomegalia e presença de líquido abdominal livre. O proprietário declinou em realizar a pesquisa de anticorpos para o vírus da imunodeficiência felina e antígenos para o vírus da leucemia viral felina por razões financeiras. Devido ao resultado do eritrograma, o paciente foi hospitalizado e submetido a uma transfusão sanguínea de 40 ml de sangue. Durante os quinze dias seguintes, o paciente recebeu 50 ml/kg/dia de fluidoterapia endovenosa com Solução de cloreto de sódio a 0,9% adicionada de 0,2 ml/kg/dia de um complexo vitamínico 8 a base de cianocobalamina, cloridrato de tiamina, cloridrato de piridoxina, nicotinamida, pantotenato de cálcio, frutose, cloridrato de L-arginina, acetil metionina, aspartato de potássio, aspartato de magnésio e selenito de sódio, até começar a se alimentar sozinha. 7 Cloreto de Sódio 0,9% - Basa Indústria Farmacêutica, Caxias do Sul - RS 8 Bionew - Vetnil, Louveira - SP 19

27 Como tratamento específico foi utilizado doxiciclina, na dosagem de 5 mg/kg a cada 12 horas, por via oral, durante 15 dias, quando então a formulação injetável foi substituída pela oral na mesma dosagem, durante mais 7 dias. Também foi instituída terapia com acetato de metilprednisolona, na dose de 40 mg/gato, por via via intra-muscular, em dose única. Foi realizado novo hemograma para acompanhamento do paciente, no qual ainda se observou anemia regenerativa e plasma ictérico, mas não havia mais hemoparasitas visíveis na hematoscopia e o leucograma se encontrava dentro dos valores de normalidade para a espécie (ANEXO 2). Após este resultado, a gata recebeu alta hospitalar para a manutenção do tratamento em casa. Após 31 dias foi trazida para revisão. Apresentava-se mais disposta, com mucosas rosadas, bom apetite, mostrando-nos que o tratamento surtiu efeito. 20

28 3.0. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO Os sinais clínicos apresentados pelo animal relatado neste trabalho estão de acordo com os descritos em literatura (Hagiwara 2003, Norsworthy 2004, Grace 2004). Através deles e dos resultados dos exames laboratoriais, que demonstraram uma anemia regenerativa e a presença do hemoplasma no esfregaço sanguíneo, podemos concluir o diagnóstico definitivo de hemoplasmose, o que nos fez optar pelo tratamento indicado pelos autores, com doxicilcina e prednisolona, além do tratamento de suporte (Berent et al 1998, Foley et al 1998). Entretanto, não foi verificado aumento de temperatura corporal no paciente, provavelmente porque a pirexia é intermitente e o animal pode apresentar picos febris, os quais ocorrem quando há um alto número de parasitas na circulação periférica (Messick 2003). Apesar da PCR ser mais específica para a identificação do microorganismo causador da hemoplasmose felina (Messick 2003, Tasker et al 2003a), há restrição do acesso a este exame na cidade em que ocorreu o caso relatado. O diagnóstico foi então realizado com base na identificação do hemoplasma no esfregaço sanguíneo, juntamente com os sinais clínicos e histórico do animal (Grace 2004, ). A PCR seria indicada para confirmar a infecção e identificar a espécie envolvida (Brinson e Messick 2001, Peters et al 2008). O teste imunoenzimático para a detecção dos vírus da imunodeficiência felina e da leucemia viral felina também são indicados nestes casos para verificar se não havia doença imunodepressora concomitante (Norsworthy 2004), mas infelizmente este não foi realizado, pois a proprietária declinou por questões financeiras. O tratamento do paciente foi baseado nos achados clínicos e laboratoriais. Não foram identificados efeitos colaterais, como esofagite, por exemplo, mesmo após o tratamento oral (Melendez et al 2000). O uso da metilprednisolona objetivou evitar a eritrofagocitose conforme indicação de Norsworthy (2004). 21

29 Após o acompanhamento clínico da paciente, concluímos que o tratamento escolhido foi eficaz, visto que o animal apresentou-se clinicamente saudável após 21 dias de tratamento. Devido à elevada casuística de animais portadores de anemias serem atendidos na clínica médica de pequenos animais, torna-se imprescindível a melhor compreensão dos aspectos epidemiológicos desta enfermidade, assim como seus métodos diagnósticos e formas de tratamento. Embora o modo de transmissão da hemoplasmose ainda não esteja completamente elucidado, a infestão por pulgas deve ser prevenida em gatos por causa da grande suspeita de seu envolvimento como vetor da doença. Como esta infecção é bastante frequente em felinos e seu tratamento é eficaz, a hemoplasmose deve ser sempre lembrada como diagnóstico diferencial nos casos de anemia nesta espécie. 22

30 ANEXO 1 Hemograma: Valores de Referência Eritrócitos 1,95 milhões/mm3 5,0 9,5 Hemoglobina 3,8 g/mm Hematrócito(VG) 10% VGM 51,28 U CHGM 38% Leucócitos mm Neutrófilos - Núcleo em bastão 1% - 236/mm Neutrófilos - Núcleo Segmentado 82% /mm Eosinófilos 3% - 708/mm Linfócitos 8% /mm Monócitos 6% /mm3 1 5 ALT (TGP) 26,1 U/l Fosfatase Alcalina 40 U/l Creatinina 0,48 GGT 6 (1,3-5,1) Contagem de plaquetas 107,250 ( ) Fonte: Laboratório Petlab Observações : Plasma ictérico Pesquiza de hemocitozoários: presença de Mycoplasma haemofelis ANEXO 2 Hemograma: Eritrócitos 3,89 milhões/mm3 Hemoglobina 6,6 g/mm3 Hematrócito(VG) 17% VGM 43,7 U CHGM 38,82% Leucócitos mm3 Neutrófilos - Núcleo em bastão - Neutrófilos - Núcleo Segmentado 80% /mm3 Eosinófilos 3% - 417/mm3 Linfócitos 14% - 417/mm3 Monócitos 3% - 417/mm3 Observações : Plasma ictérico. Pesquisa de hemocitozoários: Não foram observados hemoparasitas na amostra enviada. 23

31 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. ALLEMAN, A.R. et al. Western immunoblot analysis of the antigens of Haemobartonella felis with sera from experimentally infected cats. Journal of Clinical Microbiology, Florida, v. 37, n. 5, p , may ANDERSON, D.C.; CHARLESTON, W.A.G. Haemobartonella felis. Veterinary Journal, New Zealand, v.15, n. 3, p.47, mar BEDFORD, P.G. Feline infectious anaemia in the London area. Vererinary Record, London, v.87, n. 11, p , sep BERENT, L.M.; MESSICK, J.B.; COOPER, S.K. Use of a PCR test to detect a fragment of the 16SrRNA of Haemobartonella felis in the blood of acutely parasitic and steroid challenged cats. (abstract). Veterinary Pathology, Illinois, v.34, n.6, p BERENT, L.M.; MESSICK, J.B.; COOPER, S.K. Detection of Haemobartonella felis in cats with experimentally induced acute and chronic infections, using a polymerase chain reaction assay. American Journal of Veterinary Research, Illinois, v. 59, n.10, p , oct BERENT, L.M. et al. Specific in situ hybridization of Haemobartonella felis with a DNA probe and tyramide signal amplification. Veterinary Pathology, Illinois, v. 37, n.1, p , jan BIRKENHEUER, A.J. et al. Differentiation of Haemobartonella canis and Mycoplasma haemofelis on the basis of comparative analysis of gene sequences. American Journal Veterinary Researsh, North Carolina, v.63, n. 10, p , oct BOBADE, P.A.; AKINYEMI, J.O. A case of haemobartonellosis in a cat in Ibadan. Nigerian Veterinary Journal, v. 10,p BOBADE, P.A.; NASH, A.S. A comparative study of the efficiency of acridine orange and some Romanowsky staining procedures in the demonstration of Haemobartonella felis in feline blood. Veterinary Parasitology, Gt. Britain, v.26, n.1-2, p , dec BOBADE, P.A.; NASH, A.S.; ROGERSON, P. Feline haemobartonellosis: clinical, haematological and pathological studies in natural infections and the relationship to infection with feline leukaemia virus. Veterinary Record, Bearsden, v. 122, n. 2, p.32-6, jan BRADDOCK, J.A.; TASKER, S.; MALIK, R. The use of real-time PCR in the diagnosis and monitoring of Mycoplasma haemofelis copy number in a naturally infected cat. Journal of Feline Medicine and Surgery, Australia, v. 6, n. 3, p , jun BRAUER, N.; BALZER., H.J.; THÜRE,S.; MORITZ, A. Prevalence of feline haemotropic mycoplasmas in convenience samples of cats in Germany. Journal of Feline Medicine and Surgery, Germany, v. 10, n.3, p , jul

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