IATF: DESAFIOS E SOLUÇÕES PARA MAXIMIZAR A EFICIÊNCIA DA TÉCNICA

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1 Acta Scientiae Veterinariae 36(Supl. 2): s155-s160, IATF: DESAFIOS E SOLUÇÕES PARA MAXIMIZAR A EFICIÊNCIA DA TÉCNICA Marques, M.O. 1 ; Barreiros, T.R.R. 2 ; Max, M.C. 3 ; Silva, K.C.F. 3 ; Gomes, R.G. 3 ; Seneda, M.M. 3 ISSN (Print) ISSN (Online) 1 Geraembryo Reprodução Bovina, Cornélio Procópio, Paraná. 2 Laboratório de Reprodução Animal Universidade Estadual do Norte do Paraná. 3 Laboratório de Reprodução Animal, DCV-CCA-UEL, Londrina, PR Resumo Os aspectos práticos e operacionais para a realização de programas de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) desde o manejo e da estrutura física da propriedade, até os protocolos de sincronização e qualidade de sêmen utilizado são comentados para se obter a maximização da taxa de prenhez. Palavras-chave Bovinos, inseminação artificial, sincronização, IATF. Introdução Estima-se que o rebanho bovino brasileiro seja composto por mais de 200 milhões de animais (MAPA, 2006), em sua maioria (80%) por animais descentes ou puros da raça Nelore, constituindo o maior rebanho comercial do mundo. Entretanto, os índices produtivos são muito baixos em virtude da baixa eficiência reprodutiva dos rebanhos. A alta proporção de vacas em anestro, no início da estação de monta, é uma condição comum em vacas de corte Bos taurus indicus e afeta negativamente a eficiência reprodutiva, causando sérios prejuízos na pecuária brasileira (BARUSELLI et al., 2004). A baixa produção de forragens, coincidente com períodos de alta exigência nutricional, como o último trimestre da gestação e o início do período pós-parto, são alguns fatores relacionados ao anestro (DODE et al., 1989). Isto dificulta a obtenção de gestações nos primeiros 75 dias pós-parto, inviabilizando um intervalo entre partos de 12 meses (SHORT et al., 1990). O objetivo deste trabalho é discutir os principais aspectos práticos relacionados com a implantação e eficiência da IATF em bovinos. IA convencional A inseminação artificial (IA) apresenta como uma de suas principais vantagens o melhoramento genético dos rebanhos comerciais, promovendo melhor retorno econômico na pecuária. Entretanto, existem limitações nos programas convencionais de IA que resultam em taxas de serviço de 20 a 30% na primeira metade da estação monta (BARUSELLI et al., 2002). Dentre os fatores relacionados às baixas taxas de serviço e conseqüente redução da eficiência reprodutiva, destacam-se as falhas de detecção de cio e o anestro pós-parto (BARUSELLI et al., 2004; MARQUES et al., 2003a). Vários estudos demonstraram que as vacas da raça Nelore manifestaram estro predominantemente no período noturno (30%) e com duração mais curta (11 horas) em relação a fêmeas Bos taurus (PINHEIRO et al., 1998; MIZUTA, 2003). Diversas estratégias foram apresentadas na literatura para diminuir os fatores relacionados ao anestro pós-parto, incluindo a manutenção da condição corporal no período pré-parto, protocolos de sincronização da ovulação e a remoção dos efeitos da amamentação (SHORT et al., 1990; YAVAS e WALTHON, 2000). Os protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) visam controlar o crescimento das ondas foliculares, regular a função do corpo lúteo e o momento da ovulação (MACMILLAN e BURKE, 1996). Atualmente no Brasil, empregam-se principalmente hormônios como os progestágenos, as prostaglandinas e seus análogos e o estradiol, além da gonadotrofina coriônica eqüina (ecg). Organização de propriedades para implantação de programas de sincronização A organização de propriedades para aplicação de programas de IATF deve atender a alguns requisitos básicos como manejo sanitário e nutricional adequados, infra-estrutura para fácil acesso aos currais e troncos, nitidez na identificação dos animais e principalmente funcionários responsáveis e qualificados para realização dos trabalhos. Foram realizados alguns experimentos com objetivo de analisar as taxas de concepção de acordo com algumas variáveis nas etapas dos protocolos de IATF. O escore de condição corporal (ECC) é utilizado para mensurar as reservas energéticas de vacas de corte em diferentes fases do ciclo de produção. (SHORT et al., 1990). Os efeitos do escore de condição corporal sobre as taxas de concepção na IATF de vacas durante no período pós-parto foram amplamente estudas. Baruselli et al., (2004) obtiveram baixas taxas de concepção (< 50%) em animais com ECC 3,0. Ainda neste mesmo estudo observou-se aumento da taxa de concepção com uso de ecg em animais com ECC entre 2,5 e 3,0. Recentemente Ayres et al., (2007) verificaram as interações do ECC e do período pós-parto sobre as taxas de concepção em 887 fêmeas submetidas a IATF. Estes autores observaram necessidade da aplicação de ecg em vacas com 30 a 59 dias pós-parto, independente da condição corporal (2< ECC >3,5). s155

2 Marques M.O., Barreiros T.R.R., Max M.C., Silva K.C.F., Gomes R.G. & Seneda M.M IATF: Desafios e soluções para maximizar a eficiência... Timed fixed insemination: challenges and solutions to improve... Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s155-s160. Em um trabalho conduzido no município de Brasilândia-MS, com 2279 vacas Nelore lactantes, foram comparadas as taxas de perdas de dispositivos auriculares impregnados com Norgestomet (Tabela 1). Verificou-se a diferença de 7%, entre 3 técnicos responsáveis pela colocação dos implantes, demonstrando a importância de treinamento e seleção dos recursos humanos envolvidos nos serviços de sincronização para IATF. A qualidade do sêmen congelado pode interferir sobremaneira na eficiência da taxa de concepção da IATF. Objetivando avaliar o efeito do sêmen nas taxas de concepção a IATF, Marques et al (2004) realizaram um experimento comparando as taxas de concepção de 585 vacas Nelore lactantes submetidas a IATF com três touros (Tabela 2). Observou-se neste estudo que a qualidade do sêmen pode comprometer as taxas de concepção, pois houve diferença de 13 a 25% nas taxas de concepção. Outro aspecto avaliado foi a taxa de concepção em 434 vacas submetidas IATF de acordo com a partida de congelação do referido sêmen (tabela 3). Portanto, além da avaliação do sêmen prévia à IATF, deve-se contemplar a qualidade do sêmen de diferentes touros e partidas de congelação. Em outro trabalho, foi avaliado o efeito do inseminador nas taxas de concepção de 2954 vacas Nelore lactantes, submetidas IATF na região de Brasilândia-MS (Tabela 4). Considerações finais A partir dos dados expostos podemos considerar que a assistência profissional, a infra-estrutura e o manejo da propriedade adequados são pontos cruciais para a eficiência dos protocolos de IATF. Assim, apenas com a correta realização de todos os passos, desde a formação dos lotes de vacas paridas até o diagnóstico de gestação, que esta biotécnica pode ser uma alternativa viável para encurtar o intervalo parto-concepção e incrementar a eficiência reprodutiva na propriedade. s156

3 Marques M.O., Barreiros T.R.R., Max M.C., Silva K.C.F., Gomes R.G. & Seneda M.M IATF: Desafios e soluções para maximizar a eficiência... Timed fixed insemination: challenges and solutions to improve... Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s155-s160. References AYRES, H.; MARQUES, M.O.; SILVA, R.CP.; RODRIGUES, C.A.; FERREIRA, R.M.; BARUSELLI, P.S. Influência do uso do ecg em diferentes períodos pos-parto e do escore de condição corporal na taxa de prenhez de vacas Nelore inseminadas em tempo fixo. Acta Scientiae Veterinariae, v.35 (suplemento), p.1113, 2007 (resumo). BARUSELLI, P.S.; REIS, E.L.; MARQUES, M.O.; NASSER L.F.; BÓ, G.A. The use of hormonal treatments to improve reproductive performance of anestrous beef cattle in tropical climates. Animal Reproduction Science. v.82, p , BARUSELLI, P.S.; MARQUES, M.O.; CARVALHO, N.A.T.; MADUREIRA, E.H.; CAMPOS FILHO, E.P. Efeito de diferentes protocolos de inseminação artificial em tempo fixo na eficiência reprodutiva de vacas de corte lactantes. Revista Brasileira de Reprodução Animal. v. 26, p , DODE, M.A.M.; VALLE, E.R.; ROSA, G.O. Efeito da interrupção temporária do aleitamento sobre a fertilidade de vacas de corte. Revista Brasileira de Reprodução Animal. v.13, p MACMILLAN,K.L.; BURKE,C.R. Effects of oestrous control on reproductive efficiency. Animal Reproduction Science. v.42, p , MARQUES, M.O., REIS, E.L., CAMPOS FILHO, E.P., BARUSELLI, P.S. Efeitos da administração de ecg e de benzoato de estradiol para sincronização da ovulação em vacas zebu 1 nas no período pós-parto. In: Anais do 5º Simposio Internacional de Reproducción Animal, Córdoba, Argentina, p. 392, (resumo). MIZUTA, K. Estudo comparativo dos aspectos comportamentais do estro e dos teores plasmáticos de LH, FSH, progesterona e estradiol que precedem a ovulação em fêmeas bovinas Nelore (Bos taurus taurus), Angus (Bos taurus taurus) e Nelore (Bos taurus taurus x Bos taurus taurus) f. Tese (Doutorado em Reprodução Animal) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, PINHEIRO,O.L.; BARROS, C.M.; FIGUEIREDO, R.A.; VALLE, E.R. DO; ENCARNAÇÃO, R.O.; PADOVANI, C.R. Estrus behavior and the to ovulation interval in Nelore cattle (Bos indicus) with natural estrus or estrus induced with prostaglandin F2α or norgestomet and estradiol valerate. Theriogenology. v.49, p , 1998a. SHORT,R.E., BELLOWS,R.A.; STAIGMILLER,R.B., BERARDINELLI,J.G.; CUSTER,E.E. Physiological mechanisms controlling anestrous and infertility in postpartum beef cattle. Journal of Animal Science.v.68, p , WILTBANK,M.C.; GÜMEN,A.; SARTORI,R. Physiological classification of anovulatory conditions in cattle. Theriogenology. v.57. p , YAVAS,Y.; WALTHON,J.S. Postpartum acyclicity in suckled beef cows: A review. Theriogenology. v.54, p.1-23, 2000a. s157

4 Marques M.O., Barreiros T.R.R., Max M.C., Silva K.C.F., Gomes R.G. & Seneda M.M IATF: Desafios e soluções para maximizar a eficiência... Timed fixed insemination: challenges and solutions to improve... Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s155-s160. TIMED FIXED INSEMINATION: CHALLENGES AND SOLUTIONS TO IMPROVE THE EFFICIENCY Marques, M.O. 1 ; Barreiros, T.R.R. 2 ; Max, M.C. 3 ; Silva, K.C.F. 3 ; Gomes, R.G. 3 ; Seneda, M.M. 3 1 Geraembryo Reprodução Bovina, Cornélio Procópio, Paraná. 2 Laboratório de Reprodução Animal Universidade Estadual do Norte do Paraná. 3 Laboratório de Reprodução Animal, DCV-CCA-UEL, Londrina, PR. Abstract The aim of this study was to consider practical and operational aspects for the correct implementation of programs of time fixed artificial insemination, emphasizing aspects such as organizational structure in the property and recently described pharmacological resources. Key-words Bovine, artificial insemination, fixed-time Introduction The Brazilian cattle herd has more than 200 million animals (MAPA, 2006), mainly (80%) from Nelore or crossed with this breed, being the largest commercial herd in the world. Meanwhile, the rates of production are low because of low results of reproductive efficiency. The high proportion of cows in anoestrus at the beginning of the breeding season is a common condition in Bos taurus indicus and it hardly affects the reproductive efficiency, causing serious losses in Brazilian herd (BARUSELLI et al., 2004). The low production of pasture coincide with periods of high nutritional requirement, as the last trimester of pregnancy and the beginning of the postpartum period, making conditions to anoestrus (DODE et al., 1989). This situation does not allow the obtainment of pregnancies in the first 75 days of postpartum, making impossible an interval of 12 months between births (SHORT et al., 1990). The purpose of this review is to discuss the main practical aspects related to implementation and efficiency of the TFAI in cattle. Conventional artificial insemination (AI) The main advantages of artificial insemination (AI) are the genetic improvement of commercial livestock, promoting better economic results. However, there are limitations in conventional AI programs that result in conception rates from 20 to 30% in the first half of the breeding season (BARUSELLI et al., 2002). Among the factors related to low conception we should emphasize estrus detection at postpartum (BARUSELLI et al., 2004; MARQUES et al., 2003a). Several studies have shown that Nelore cows expressed estrus predominantly at night (30%) and with shorter duration (11 hours) regarding females Bos taurus (PINHEIRO et al., 1998; MIZUTA, 2003). Several strategies have been reported in the literature to reduce factors related to postpartum anoestrus, including the maintenance of body condition in the pre-partum, protocols for synchronization of ovulation and removal of breast feeding effects (SHORT et al., 1990; YAVAS and WALTHON, 2000). Protocols of fixed time artificial insemination tend to control the growth of follicular waves, regulate the corpus luteum function and the time of ovulation (MACMILLAN and BURKE, 1996). Currently in Brazil, the mainly hormones used are progesterone, prostaglandins and its analogues and estradiol, in addition to the equine chorionic gonadotropin (ecg). Organization of properties to implement synchronization programs Organization of farms for using FTAI programs needs some basic requirements such as adequate health and nutritional management, appropriate facilities, accuracy on animal identification and, very important, good employees. Some experiments have been conducted with the aim of analyzing the pregnancy rates according to some variables in the steps of the FTAI protocols. The body condition score (BCS) is used to measure the energy reserves of beef cows in different stages of production (SHORT et al., 1990). The effects of body condition score on the pregnancy rates in FTAI of cows during the post-partum period were extensively studied. Baruselli et al., (2004) obtained low pregnancy rates (< 50%) in animals with BCS 3.0. This same study noted an increase in the pregnancy rate using ecg in animals with BCS between 2.5 and 3.0. Recently Ayres et al., (2007) found the interactions of BCS and the post-partum period on pregnancy rates in 887 cows submitted to IATF. These authors observed that the ecg application is needed in cows with 30 to 59 days post-partum, independent of body condition score (2<ECC>3.5). In a work conducted in the city of Brasilandia-MS with 2279 lactating Nelore cows, there were compared the rates of losses of ear implant impregnated with Norgestomet (Table 1). There was a difference of 7%, demonstrating the importance of well prepared employees in FTAI services. s158

5 Marques M.O., Barreiros T.R.R., Max M.C., Silva K.C.F., Gomes R.G. & Seneda M.M IATF: Desafios e soluções para maximizar a eficiência... Timed fixed insemination: challenges and solutions to improve... Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s155-s160. The quality of frozen semen may highly interfere with the efficiency of biotechnologies as the FTAI. Aiming to evaluate the effect of semen on the FTAI pregnancy rates, Marques et al (2004) conducted a study comparing the pregnancy rates 585 lactating Nelore cows submitted to FTAI with three bulls (Table 2). It was observed in this study that the quality of semen may compromise the pregnancy rates, because there was a difference of 13 to 25%. Other evaluated aspects were the conception rates of 434 cows that were submitted to IATF with different sets frozen of semen from the same bull (Table 3). Therefore, besides the previous semen evaluation, the IATF must contemplate the semen quality not only of different bulls, but different sets as well. In another experiment it was analyzed the effect of the inseminator on the conception rates of 2954 Nellore lactating cows, submitted to FTAI in the region of Brasilândia, Mato Grosso do Sul (Table 4). : Final Considerations With the data exposed above it is necessary to consider the assistance of an expert technician, appropriate facilities and good management requirements for the adoption and effective use of FTAI. This biotechnology is largely presented as a feasible alternative to increase the conception rates in the first half of the breeding season and consequently raise the reproductive efficiency. References AYRES, H.; MARQUES, M.O.; SILVA, R.CP.; RODRIGUES, C.A.; FERREIRA, R.M.; BARUSELLI, P.S. Influência do uso do ecg em diferentes períodos pos-parto e do escore de condição corporal na taxa de prenhez de vacas Nelore inseminadas em tempo fixo. Acta Scientiae Veterinariae, v.35 (suplemento), p.1113, 2007 (resumo). s159

6 Marques M.O., Barreiros T.R.R., Max M.C., Silva K.C.F., Gomes R.G. & Seneda M.M IATF: Desafios e soluções para maximizar a eficiência... Timed fixed insemination: challenges and solutions to improve... Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s155-s160. BARUSELLI, P.S.; REIS, E.L.; MARQUES, M.O.; NASSER L.F.; BÓ, G.A. The use of hormonal treatments to improve reproductive performance of anestrous beef cattle in tropical climates. Animal Reproduction Science. v.82, p , BARUSELLI, P.S.; MARQUES, M.O.; CARVALHO, N.A.T.; MADUREIRA, E.H.; CAMPOS FILHO, E.P. Efeito de diferentes protocolos de inseminação artificial em tempo fixo na eficiência reprodutiva de vacas de corte lactantes. Revista Brasileira de Reprodução Animal. v. 26, p , DODE, M.A.M.; VALLE, E.R.; ROSA, G.O. Efeito da interrupção temporária do aleitamento sobre a fertilidade de vacas de corte. Revista Brasileira de Reprodução Animal. v.13, p MACMILLAN,K.L.; BURKE,C.R. Effects of oestrous control on reproductive efficiency. Animal Reproduction Science. v.42, p , MARQUES, M.O., REIS, E.L., CAMPOS FILHO, E.P., BARUSELLI, P.S. Efeitos da administração de ecg e de benzoato de estradiol para sincronização da ovulação em vacas zebu 1 nas no período pós-parto. In: Anais do 5º Simposio Internacional de Reproducción Animal, Córdoba, Argentina, p. 392, (resumo). MIZUTA, K. Estudo comparativo dos aspectos comportamentais do estro e dos teores plasmáticos de LH, FSH, progesterona e estradiol que precedem a ovulação em fêmeas bovinas Nelore (Bos taurus taurus), Angus (Bos taurus taurus) e Nelore (Bos taurus taurus x Bos taurus taurus) f. Tese (Doutorado em Reprodução Animal) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, PINHEIRO,O.L.; BARROS, C.M.; FIGUEIREDO, R.A.; VALLE, E.R. DO; ENCARNAÇÃO, R.O.; PADOVANI, C.R. Estrus behavior and the to ovulation interval in Nelore cattle (Bos indicus) with natural estrus or estrus induced with prostaglandin F2α or norgestomet and estradiol valerate. Theriogenology. v.49, p , 1998a. SHORT,R.E., BELLOWS,R.A.; STAIGMILLER,R.B., BERARDINELLI,J.G.; CUSTER,E.E. Physiological mechanisms controlling anestrous and infertility in postpartum beef cattle. Journal of Animal Science.v.68, p , WILTBANK,M.C.; GÜMEN,A.; SARTORI,R. Physiological classification of anovulatory conditions in cattle. Theriogenology. v.57. p , YAVAS,Y.; WALTHON,J.S. Postpartum acyclicity in suckled beef cows: A review. Theriogenology. v.54, p.1-23, 2000a. s160

7 Acta Scientiae Veterinariae 36(Supl. 2): s161-s164, PRINCIPAIS ESTRATÉGIAS PARA O INCREMENTO DA TE EM BOVINOS Marques, M.O. 1 ; Silva, K.C.F. 2 ; Max, M.C. 2 ; Gomes, R.G. 2 ; Seneda, M.M. 2 1 Geraembyo Reprodução Bovina, Cornélio Procópio, Paraná; 2 Laboratório de Reprodução Animal, DCV-CCA- UEL, Londrina, Paraná Resumo A biotecnologia de transferência de embriões é uma importante ferramenta para acelerar o melhoramento genético em rebanhos de alto valor. Entretanto, alguns aspectos devem ser avaliados para que esta biotécnica ofereça seus melhores resultados. Dentre os fatores que podem interferir em um programa de transferência de embriões podemos citar a nutrição e mineralização dos animais, a sanidade do rebanho, o manejo dos animais (prenhes, vazias, em sincronização, transferidas, feto sexado, paridas, descarte), a estrutura e organização da propriedade e a mão de obra envolvida no trabalho. É importante também realizar uma avaliação precisa das doadoras e receptoras, previamente aos programas de sincronização para transferência de embriões, atentando-se para a condição corporal, sanidade, habilidade materna, status ovariano e uterino, além da exclusão de fêmeas com patologias reprodutivas. Palavras-chave Bovinos, embriões, sincronização, tempo fixo Introdução Cerca de embriões bovinos foram transferidos no Brasil durante o ano de 2002, sendo este número uma quantidade muito superior à realizada em outros países neste mesmo período. Sendo assim este dado demonstra a importância da transferência de embriões no cenário das biotecnologias aplicadas à pecuária nacional. No entanto, inúmeros fatores poderão interferir na transferência de embriões, com destaque especial as receptoras. Desta forma, o incremento das taxas de aproveitamento e de concepção das receptoras é fundamental para maximizar a taxa de prenhez e, com isso, elevar o retorno econômico da transferência de embriões, determinando um maior número de bezerros nascidos e redução dos gastos com fêmeas não gestantes no rebanho. Estratégias para incremento na eficiência da tecnologia de embriões Um dos principais aspectos negativos dos programas comerciais de transferência de embriões continua sendo a grande variabilidade de resposta das doadoras de embriões ao tratamento superovulatório com gondotrofinas (Barros & Nogueira, 2001; Baruselli et al., 2006). Devido a isto, a superovulação de doadoras bovinas tem sido amplamente estudada visando desenvolver protocolos que melhorem a produção de embriões e facilitem o manejo dos animais (Barros & Nogueira, 2001; Baruselli et al., 2006). A detecção de estro também é um outro fator que pode prejudicar o sucesso dos programas de transferência de embriões em virtude da curta duração do mesmo e sua elevada ocorrência em períodos noturnos no caso dos zebuínos (Bó et al., 2003; Baruselli et al., 2006). Através do controle farmacológico do ciclo estral é possível manipular o desenvolvimento folicular objetivando-se minimizar os efeitos descritos anteriormente além de melhorar os programas de superovulação e transferência de embriões bovinos. Desta forma ocorrerá uma sincronia da ovulação entre as doadoras permitindo que a inseminação seja realizada em tempo fixo (IATF) sem a necessidade da detecção do estro (Barros & Nogueira, 2001; Nogueira et al., 2002; Baruselli et al., 2006). Em razão da interferência do folículo dominante no início do tratamento superovulatório, algumas estratégias foram desenvolvidas, como por exemplo, começar a superovulação com FSH no primeiro dia do ciclo estral (Stock et al., 1996), aspiração do folículo dominante ou todos os folículos acima de 5 mm de diâmetro antes da superovulação com gonadotrofinas (Bergfelt et al., 1994) e sincronizar o início das ondas foliculares com a utilização de um implante de progesterona e administração de estrógeno afim de promover a atresia folicular e emergência de uma nova onda (Bó et al., 1995, 2003; Barros et al., 2006). Dentre as gonadotrofinas que são utilizadas para promover a superovulação nas doadoras, destacamse a gonadotrofina coriônica eqüina (ecg ou PMSG) administrada isoladamente (Boland et al., 1978) ou s161 ISSN (Print) ISSN (Online)

8 Marques M.O., Silva K.C.F., Max M.C., Gomes R.G. & Seneda M.M Principais estratégias para o incremento da TE em bovinos. Strategic tools for improving embryo transfer in cattle. Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s161-s164. associada a soro anti-pmsg (Alfuraiji et al., 1993) e o hormônio folículo estimulante (FSH) advindo de extrato de pituitária de suínos, ovinos e equinos (Donaldson, 1989) ou ainda, FSH recombinante bovino (Wilson et al., 1993) e bst (Barros & Nogueira, 2001). Alguns autores demonstraram que as taxas de aproveitamento são maiores em receptoras submetidas a protocolos de transferência de embriões em tempo fixo (TETF) do que naquelas tratadas com uma ou duas administrações de PGF2α e posterior detecção de cio. As taxas de concepção de tais protocolos são similares, no entanto, o resultado final é o aumento das taxas de prenhez nos programas de transferência de embriões em tempo fixo (TETF), além de proporcionar a vantagem de possibilitar a programação do dia da inovulação e de evitar o trabalho com a detecção de cio (Marques et al., 2004). A seleção do programa mais adequado dependerá de outros fatores além dos fisiológicos como a eficiência na detecção de cios, destreza do veterinário na palpação retal e ultra-sonografia, disponibilidade financeira para os tratamentos hormonais, custo das doses de sêmen, disponibilidade de mão de obra qualificada, instalações disponíveis e, finalmente os objetivos do programa de melhoramento genético do estabelecimento (Bó et al., 2004). s162

9 Marques M.O., Silva K.C.F., Max M.C., Gomes R.G. & Seneda M.M Principais estratégias para o incremento da TE em bovinos. Strategic tools for improving embryo transfer in cattle. Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s161-s164. STRATEGIC TOOLS FOR IMPROVING EMBRYO TRANSFER IN CATTLE Marques, M.O. 1 ; Silva, K.C.F. 2 ; Max, M.C. 2 ; Gomes, R.G. 2 ; Seneda, M.M. 2 1 Geraembyo Reprodução Bovina, Cornélio Procópio, Paraná; 2 Laboratório de Reprodução Animal, DCV- CCA- UEL, Londrina, Paraná Abstract Biotechnology of embryo transfer is an important tool for increasing genetic improvement of livestock with high value. However, some aspects should be evaluated for achieving the best results. Considering factors capable to interfere on the embryo transfer program, we can mention the mineralization and appropriate nutrition of animals, health of herd, management of animals (pregnant, non pregnant, under synchronization, transferred, sexed fetuses, discard), structure and organization of farm, and workers. It is also important to conduct an assessment of donor and recipient prior to the embryo transfer programs, according to body condition, health, maternal ability (mainly in receiving), uterine and ovarian status and diagnosis of reproductive diseases. Key words Cattle, embryo transfer, synchronization, fixed time Introduction About 110,000 cattle embryos were transferred in Brazil during 2002, an expressive amount, which is higher than many other countries in the same period. It is clear the importance of embryo industry on biotechnology scenario of Brazilian livestock. However, many factors may interfere in the embryo transfer program, with special emphasis on the recipients. Thus, increasing rates of conception in recipients is essential to maximize the pregnancy rate and thereby raise the economic return, determining a greater number of calves born and reduction of spending on non-pregnant females in the herd. Improving the efficiency of embryos transfer technologies A major negative aspect of commercial embryo transfer programs remains the great variability in superovulatory responses after gonadotropins treatments (Barros and Nogueira, 2001; Baruselli et al., 2006). Because of that, donor superovulation has been widely studied to develop protocols for improving embryo production, as well as easier ways of animals handling (Barros and Nogueira, 2001; Baruselli et al., 2006). Estrus detection is another important aspect on the success of embryo transfer programs, especially due to the short duration estrous period and its night occurrence in zebu cattle (Bó et al., 2003; Baruselli et al., 2006). The estrus cycle control allows the manipulation of follicular development, aiming to minimize the effects described above, plus the improving of superovulation programs and embryo transfer in cattle. Synchronized ovulation will occur between donors submitted to fixed timed artificial insemination (FTAI) without estrus detection (Barros and Nogueira, 2001; Nogueira et al., 2002; Baruselli et al., 2006). Due to the interference of the dominant follicle at the beginning of superovulatory treatment, some strategies have been developed, for example, beginning superovulation with FSH on the first day of the estrous cycle (Stock et al., 1996), aspiration of dominant follicle or all follicles greater than 5 mm before superovulation (Bergfelt et al., 1994), and synchronize the beginning of follicular wave by using an implant of progesterone and administration of estradiol to promote follicular atresia and emergence of a new wave (Bó et al., 1995, 2003; Barros et al., 2006). Gonadotropins commonly used to promote superovulation are equine chorionic gonadotropin (ecg or PMSG) administered alone (Boland et al., 1978) or associated with serum anti-pmsg (Alfuraiji et al., 1993), and follicle stimulating hormone (FSH) from pigs, sheep and horses (Donaldson, 1989) or, recombinant bovine FSH (Wilson et al., 1993) and bst (Barros and Nogueira, 2001). Some authors have shown higher means of embryos per flushing when donors are submitted to protocols of embryo transfer in fixed time if compared with animals treated with one or two administrations of PGF2α and subsequent detection of estrus. Conception rates of such protocols are similar, however, final result may s163

10 Marques M.O., Silva K.C.F., Max M.C., Gomes R.G. & Seneda M.M Principais estratégias para o incremento da TE em bovinos. Strategic tools for improving embryo transfer in cattle. Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s161-s164. be considered better if we included aspects as programming day of embryo transfer and a much better organization of workers. (Marques et al., 2004). Selecting the most appropriate program will depend on other factors like physiological beyond the efficiency in the estrus detection, Veterinarian ability on rectal palpation, financial funds available for hormone treatment, cost of doses of semen, availability of qualified workers, appropriate facilities and, finally, the objectives of the program of genetic improvement of the establishment (Bó et al., 2004). References Alfuraiji MM, Atkinson T, Broadbent PJ, Hutchinson JSM. Superovulation in cattle using PMSG followed by PMSG-monoclonal antibodies. Animal Reproduction Science. 1993; 33: Barros CM, Barcelos ACZ, Nogueira MFG. Superovulação com inseminação artificial em tempo fixo. In: Anais 2 o Simpósio Internacional de Reprodução Animal Aplicada. 2006; Baruselli PS, De Sá Filho MF, Martins CM, Nasser LF, Nogueira MFG, Barros CM, Bó GA. Superovulation and embryo transfer in Bos indicus cattle. Theriogenology. 2006; 5: Bergfelt DR, Lightfoot KC, Adams GP. Ovariam synchronization following ultrasound-guieded transvaginal follicle ablation in heifers. Theriogenology. 1994; 42: Bó GA, Adams GP, Caccia M, Martinez M, Pierson RA, Mapletoft RJ. Ovarian follicular wave emergence after treatment with progestogen and estradiol in cattle. Animal Reproduction Science. 1995; Bó GA, Baruselli PS, Martinez MF. Pattern and manipulation of follicular development in Bos indicus cattle. Animal Reproduction Science. 2003; Bó GA, Cutaia I, Baruselli PS. Programas de inseminacion artificial y transferência de embriones a tiempo fijo. Anais 1 o Simpósio Internacional de Reprodução Animal Aplicada Boland MP, Crosby TF, Gordon I. Morphological normality of cattle embryos following superovulation using PMSG. Theriogenology. 1978; 175. Donaldson LE. Porcine, equine and ovine FSH in the superovulation of cattle. Theriogenology. 1989; 31:183. Marques MO, Reis, EL, Baruselli, PS. Sincronização de receptoras para inovulação em tempo fixo. Anais 1 o Simpósio Internacional de Reprodução Animal Aplicada Nogueira MFG, Barros BJP, Teixeira AB, Trinca LA, D occhio MJ, Barros CM. Embryo recovery and pregnancy rates after the delay of ovulation and fixed time insemination in superstimulated beef cows. Theriogenology. 2002; 57: Stock AE, Ellington JE, Fortune JE. A dominant follicle does not affect follicular recruitment by superovulatory doses of FSH in cattle but can inhibit ovulation. Theriogenology. 1996; 45: Wilson JM, Jones AL, Moore K, Looney CR, Bondioli KR. Superovulation of cattle with a recombinant- DNA bovine follicle stimulating hormones. Animal Reproduction Science. 1993; 33: s164

11 Acta Scientiae Veterinariae 36(Supl. 2): s165-s178, ATUALIDADES EM BIOTECNOLOGIA REPRODUTIVA EM CÃES ISSN (Print) ISSN (Online) Lúcia Daniel Machado da Silva 1* ; Alexandre Rodrigues Silva 2 ; Rita de Cássia Soares Cardoso 3 ¹FAVET-UECE, ²FAVET-UFERSA, ³FAVET-UFPI, *autor para correspondência: Av. Paranjana, 1700 Campus do Itaperi , Fortaleza-CE, Brasil lucia.daniel.machado@hotmail.com Resumo As biotécnicas de reprodução são importantes não somente para preservar a biodiversidade, mas também para a pesquisa básica. Nos últimos anos, tem-se observado um crescente interesse em desenvolver e aplicar rotineiramente essas biotécnicas na criação de cães. Além disso, devido às similaridades filogenéticas existentes entre os canídeos domésticos e os selvagens, os estudos realizados nos primeiros têm servido como base para a aplicação de biotécnicas, visando a conservação de canídeos selvagens ameaçados de extinção. Nesse sentido, o presente trabalho tem por objetivo apresentar as principais biotécnicas utilizadas na reprodução de cães domésticos. O avanço no desenvolvimento dessas biotécnicas contribuirá não somente para o alavancamento da reprodução de cães, mas também para a aplicação dessas em canídeos selvagens. Palavras-chaves: cão, reprodução, biotécnicas, sêmen, espermatozóide, oócito. Introdução As biotécnicas de reprodução são importantes não somente para preservar a biodiversidade, mas também para a pesquisa básica. Apesar dos primeiros estudos acerca do uso de biotécnicas da reprodução terem sido realizados em cães ao final do século XVIII, a reprodução de pequenos animais passou por um grande vazio concernente ao desenvolvimento e à difusão de novas biotécnicas reprodutivas. Apenas nos últimos anos tem-se observado um crescente interesse em desenvolver e aplicar rotineiramente essas biotécnicas na criação de cães. Além disso, devido às similaridades filogenéticas existentes entre os canídeos domésticos e os selvagens, os estudos realizados nos primeiros têm servido como base para a aplicação de biotécnicas, visando a conservação de canídeos selvagens ameaçados de extinção. Nesse sentido, o presente trabalho tem por objetivo apresentar as principais biotécnicas utilizadas na reprodução de cães domésticos. Tecnologia de sêmen O sêmen é facilmente colhido de cães. No entanto, a presença de uma cadela em estro melhora a qualidade do ejaculado. Pode-se ainda congelar swabs impregnados de secreções vaginais de cadelas em estro (54) ou impregnados com o feromônio sintético metil-r-benzoato (43). A eletroejaculação fica reservada à coleta daqueles cães que não permitem ser coletados por manipulação digital. A qualidade do ejaculado não difere da do colhido por manipulação vaginal (36). O sêmen epididimário pode ser coletado de cães orquiectomizados, seguida de dissecação do epidídimo e da manutenção deste sob refrigeração a 4ºC por até 8 dias (76). Os espermatozóides podem também ser coletados de epidídimos mantidos em temperaturas entre 15 e 25ºC por até 20 h (14). A coleta pode ser realizada por meio da inserção de uma agulha fina no ducto deferente, seguida da injeção de soro fetal bovino, TCM 199 ou tampão Tris (57). Espermatogônias de cães foram recuperadas por meio de dissociação enzimática e, posteriormente, transplantadas para camundongos severamente imunodeprimidos. A eficiência da técnica foi acompanhada por imunohistoquímica, que detectou a presença de células germinativas caninas em divisão nos camundongos receptores. Apesar das divisões e transformações celulares terem sido observadas, o desenvolvimento das espermatogônias até espermatozóides não foi ainda descrito (10). A viabilidade do sêmen é prolongada através da refrigeração e da adição de diluentes, como o leite desnatado (9), a glicina-gema (9), o Tris-gema (60) e a água de coco in natura (19) ou na forma de pó (32). O sêmen refrigerado pode ser transportado em diferentes tipos de container e manter-se viável por um a cinco dias, desde que a temperatura seja mantida entre 4 e 5 C (12). A troca do meio diluidor promove a manutenção da viabilidade do sêmen canino por mais de 20 dias, visto que possibilita uma renovação de substrato energético para as células s165

12 Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive biotechnology in dogs Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s165-s178. espermáticas (23). Além disso, a suplementação do tampão Tris com o açúcar frutose, ao invés da glicose, oferece melhor preservação da motilidade espermática por até 23 dias, sob refrigeração a 5 ºC (42). Diversos diluentes são utilizados para a congelação do sêmen canino, como a lactose (48), o Tris (1), o Bes-lactose (64), o Triladyl (35), o Tes/Tris (3), Biociphos W482 (53), o Laiciphos 478 (53), o diluente comercializado pelo Cryogenetics Laboratory of New England - CLONE (61), o leite desnatado (46) e um diluente à base de água de coco in natura (5) ou na forma de pó (4). A gema de ovo de galinha é adicionada ao diluente, geralmente na proporção de 20% (51). Entretanto, sendo a gema de ovo de origem biológica, esta apresenta a possibilidade de transmissão de doenças. Por isto, foi sugerida a sua substituição por outros lipídios sintéticos e purificados, como os análogos do hidroxitoluenobutilado (15). Tem sido proposta a utilização apenas das lipoproteínas de baixa densidade presentes na gema de ovo, para a conservação do sêmen (69). Crioprotetores como o glicerol (41), o dimetilsulfóxido (37), o metanol (26), o etileno-glicol (58) e a dimetil-formamida (38) já foram utilizados na congelação do sêmen canino. No entanto, o glicerol permanece como o crioprotetor mais empregado em concentrações que variam entre 2 e 8% (43). As pastas Equex STM (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA) ou Orvus ES (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA) são aditivos comerciais que contêm uma substância detergente, o dodecil-sulfato de sódio (SDS), que possibilita um aumento na resistência aos danos oriundos da congelação. Alguns autores sugerem que a adição isolada do princípio ativo SDS (0.25%) aos diluentes proporciona resultados similares àqueles obtidos com uso das pastas comerciais (40,46). Para a congelação do sêmen, são utilizadas concentrações que variam de 10 x 10 6 (3,67) a 8 x 10 8 de espermatozóides/ml (39). Já outros pesquisadores utilizam uma diluição fixa, com base no volume de sêmen a ser congelado, variando desde uma parte de sêmen para uma parte de diluidor (4,5,51) até uma parte de sêmen para quatro partes de diluidor (12). O método mais usual para a congelação do sêmen canino foi descrito em 1972 (1) O referido método serve como base para inúmeros estudos em que têm sido realizadas pequenas modificações. A descongelação do sêmen é realizada de 37 o C (121) a 75 o C (37). A armazenagem do sêmen pode ser realizada em pastilhas (24,64), tubos de alumínio de 5mL (24) ou, preferencialmente, em palhetas de 0,25mL (4) ou de 0.5mL (64). Existe ainda a possibilidade de manutenção do sêmen congelado/descongelado sob refrigeração a 4ºC por até três dias após a descongelação (70). Inseminação artificial Para a IA intra-vaginal (IAIV), pode-se utilizar uma sonda rígida (49) ou a sonda de Osíris (53). Uma das possíveis técnicas a serem utilizadas para a IA por via intra-uterina (IAIU) consiste no cateterismo transcervical (1). Para sua execução, são utilizadas bainhas plásticas acopladas ao catéter escandinavo, o qual é transpassado através da cérvice. A endoscopia vaginal é um método utilizado para a sondagem da cérvice na cadela (73). Para sua utilização é utilizado um endoscópio fibro-óptico rígido e um catéter urinário. A IAIU por laparotomia (65) foi desenvolvida no sentido de tentar contornar as dificuldades do cateterismo cervical. (54). A IAIU por laparoscopia, apesar de também ser uma técnica cirúrgica, tem caráter pouco invasivo e é de rápida execução. Os resultados obtidos após IAIU por laparoscopia, tanto com sêmen fresco (56), como com sêmen congelado (55) têm sido satisfatórios. Inseminações bem sucedidas têm sido realizadas em cadelas, utilizando-se um grande número de espermatozóides, inseminações freqüentes ou ambos. Foi sugerido que 100 x 10 6 espermatozóides proporcionam taxas de concepção e tamanho de ninhada aceitáveis (17). Com relação à eficiência da IA, ambas as vias assemelham-se quando se trata de sêmen fresco, atingindo resultados similares àqueles descritos para a monta natural (50). Com sêmen refrigerado, geralmente têm sido obtidas taxas de concepção superiores a 70% (52). As taxas de concepção observadas após IA com sêmen congelado são inferiores às obtidas com sêmen fresco (28). Controle do ciclo estral Dentre os diferentes protocolos utilizados para esse propósito, podem ser citados: administração intravenosa de GnRH (6); FSH ou ecg para indução do desenvolvimento folicular e manifestação do proestro (74); FSH ou ecg seguida de aplicação de LH ou hcg para promover a ovulação dos folículos desenvolvidos (74); administração s166

13 Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive biotechnology in dogs Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s165-s178. de estrógenos (7) ou da gonadotrofina da menopausa humana (hmg - 72) para sensibilizar o eixo hipotalâmicohipofisário, previamente à administração das drogas já citadas. O protocolo mais eficiente e que apresenta maior segurança para a vida reprodutiva da cadela consiste na administração de drogas anti-prolactínicas, como a bromocriptina (77), a metergolina (62) e a cabergolina (25), as quais proporcionam um encurtamento no intervalo entre estros. Estudos vêm sendo conduzidos no intuito de desenvolver protocolos de indução de estro em cadelas por meio da administração de agonistas do GnRH, tais como: a aplicação subcutânea de acetato de busserelina, cujos resultados não têm sido satisfatórios quando comparados àqueles obtidos com a cabergolina (47); e a colocação de implantes subcutâneos para a liberação contínua de lutrelina (8) ou de deslorelina (71), os quais têm proporcionado resultados promissores. Manipulação de oócitos Os ovários de cadelas podem ser coletados por ovariosalpingohisterectomia. Os procedimentos adotados para a recuperação dos oócitos, usualmente, são a aspiração, fatiamento do córtex ovariano e dissecação folicular (45). Esses oócitos podem ser imediatamente utilizados em procedimentos de fertilização in vitro (FIV), ou serem submetidos à congelação a 18ºC (22). Oócitos caninos de boa qualidade apresentam pigmentação escura e citoplasma homogêneo, diâmetro superior a 100 µm, estando completamente circundado por duas ou mais camadas de células do cumullus (31). Alguns autores sugerem o uso de uma digestão enzimática associada ao isolamento mecânico para a obtenção de folículos ovarianos pré-antrais (FOPA - 11). Já foi também verificado que após o isolamento enzimático utilizando colagenase e DNAse, os FOPA caninos poderiam ser cultivados in vitro e os oócitos seriam capazes de reiniciar suas divisões meióticas (2). Oócitos caninos podem ser transportados por até 4 horas, em solução salina a 4 C, sem que os mesmos tenham sua capacidade de maturação comprometida, podendo chegar ao estágio de metáfase II (63). Cultivo e maturação in vitro de oócitos A maturação e fertilização oocitária na espécie canina são únicas entre todos os mamíferos. A cadela ovula naturalmente um oócito imaturo em estágio de vesícula germinativa, necessitando de cerca de 48 horas para concluir sua maturação (52). O tempo de cultivo reportado para a MIV de oócitos caninos varia enormemente (acima de 120 h), mas os resultados de completa maturação são ainda controversos e insatisfatórios. Assim, a avaliação da retomada da meiose assume grande importância para avaliar a progressão da maturação nuclear ao longo de todo o tempo de cultivo (30). Meios suplementados com estradiol, progesterona, FSH, LH, ecg, L- cisteína e ácido araquidônico já foram utilizados, porém nenhum desses mostrou um efeito positivo significativo sobre as taxas maturação de oócitos caninos quando comparados aos grupos controles (18). Por outro lado, foi demonstrado que o uso de FSH recombinante melhora significativamente as taxas de MIV (18). O meio TCM- 199 adicionado de BSA e somatotrofina humana possibilita a retomada da meiose em oócitos caninos até o estágio de metáfase II (78). Alguns fatores como a idade da doadora, o tamanho do oócito e a morfologia nuclear e das células do cumulus influenciam as taxas de sucesso na MIV (21). O tamanho do folículo do qual o oócito foi recuperado pode também influenciar diretamente a MIV (59). Por outro lado, a MIV de oócitos caninos não sofre influência do status reprodutivo in vivo da fêmea (45). Já foi também demonstrado que o uso de células do oviduto, ou ainda de um ambiente sintético de composição similar ao do fluido produzido por estas células, com altas concentrações de proteínas, poderia melhorar as taxas de MIV (10). A superovulação tem sido estudada em cadelas no sentido de optimizar a recuperação oocitária. Entretanto, tanto os protocolos de MIV, quanto os de superovulação têm sido pouco eficientes (18). Produção in vitro de embriões A produção in vitro de embriões (PIV) e transferência de embriões (TE) são as mais poderosas ferramentas atualmente disponíveis para estudar a fertilização e preservar o material genético de espécies raras, bem como valiosas (29). s167

14 Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive biotechnology in dogs Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s165-s178. Oócitos caninos podem retomar a meiose espontaneamente in vitro, utilizando-se adaptações das técnicas de maturação in vitro (MIV) para bovinos e suínos, embora em uma taxa e eficiência mais baixa do que outras espécies (30). Dessa forma, o uso da FIV na espécie canina ainda não foi de grande sucesso (16). Para a FIV, após a obtenção dos oócitos, os mesmos são cultivados, objetivando a MIV, por um período que varia de 24 a 72 horas. Paralelamente, os espermatozóides são diluídos em um meio de capacitação, geralmente o meio de capacitação canina (CCM). É realizada então a incubação de espermatozóides e oócitos por aproximadamente 12h em estufa de CO 2 e, posteriormente, os complexos cúmulos-oócitos (COCs) são transferidos para um meio fresco, avaliados e somente os de boa qualidade são transferidos para as receptoras (13). O primeiro sucesso na FIV na espécie canina foi relatado em 1991 (44), em que foi observado o desenvolvimento até mórula. Embriões de oito células 72 horas após a inseminação foram obtidos, embora ainda em uma taxa de 4,8% (75). Posteriormente, foi conseguido desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto. Da mesma forma que o trabalho anterior, ainda em uma baixa eficiência (0,5%). O resultado mais surpreendente foi o obtido em 2001, em que os autores conseguiram uma gestação após FIV de oócitos caninos (13). Em ultra-sonografia realizada aos 20 dias após a TE, foram observados três conceptos. Entretanto, dois dias após, os mesmos não foram mais observados, tendo sofrido reabsorção. Injeção intracitoplasmática de espermatozóide A injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) consiste na injeção de um espermatozóide dentro do citoplasma de um oócito maduro. A fertilização terá sucesso quando o DNA espermático estiver intacto e em uma forma condensada e estável. Este procedimento é útil não só em casos de espermatozóides imóveis, mas também para espermatozóides epididimários de animais que tenham que ser submetidos a uma orquiectomia e sejam de raro valor (21). Em um experimento de ICSI na espécie canina foram utilizados 82 oócitos, os quais foram submetidos à injeção de espermatozóides caninos refrigerados. Dentre os oócitos, apenas seis (7,8%) atingiram a formação dos pró-núcleos, o que foi considerado como um indicativo do sucesso na fertilização. Entretanto, nenhuma gestação foi obtida (20). Transferência de embriões Em 1989, foi realizada a transferência de embriões caninos produzidos in vivo no estágio de mórula para uma cadela receptora, resultando no nascimento de dois filhotes (66). Em 2001, esses mesmos autores demonstraram que podem ser alcançadas gestações em cadelas, a partir da TE produzidos in vivo, desde o estágio de oito células até blastocisto, coletados por ovariohisterectomia ou por lavagem uterina (68). Em adição, conforme citado no tópico referente à FIV, já foi descrito na espécie canina a ocorrência de gestação a partir da transferência de embriões produzidos in vitro, a qual, no entanto, não resultou em nascimento (13). Xenotransplante Os protocolos de xenotransplante envolvem a coleta do córtex ovariano de um indivíduo seguido de um posterior transplante para um indivíduo de uma espécie totalmente diferente (18). O transplante de tecido ovariano canino para a cápsula renal de camundongos inférteis severamente imunodeprimidos já foi realizado. Tais camundongos foram submetidos à necropsia após 56 dias, quando se confirmou que estava acontecendo o desenvolvimento folicular, porém não foi visualizada a formação de antro (33). Clonagem Em 2005, foi descrito o primeiro sucesso na clonagem de cães (27). Segundo os autores, foram utilizados como carioplastos, os fibroblastos oriundos da orelha de um cão macho da raça Afghanhound. Além disso, foi realizada a coleta de oócitos maturados in vivo, no estágio de metáfase II, 72h após a ovulação, através da técnica de lavagem dos ovidutos. Esses oócitos foram enucleados e, em seguida, fundidos e ativados com os núcleos s168

15 Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive biotechnology in dogs Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s165-s178. oriundos dos fibroblastos. Um total de embriões reconstituídos foram transferidos para 123 cadelas receptoras. A partir desse procedimento, três gestações foram confirmadas por ultra-sonografia, entretanto apenas dois fetos vieram a termo. Um dos filhotes faleceu aos 22 dias após o nascimento, devido a problemas respiratórios. O segundo filhote nasceu por cesariana aos 60 dias de gestação e foi submetido à análise de DNA que confirmou que o mesmo consistia no primeiro clone canino da história. A clonagem por transferência nuclear interespécies surge como uma alternativa para aquelas espécies onde os sistemas de produção embrionária in vitro são ainda deficiente, como nos cães. Assim, foi demonstrado ser possível o desenvolvimendo de embriões reconstituídos a partir de oócitos bovinos enucleados fundidos com material genético oriundo de células do cumulus de cadelas, até a fase de blastocisto, mas a ocorrência de gestação através desse procedimento não foi ainda descrita (34). Considerações finais Após a revisão de diversas biotécnicas existentes para auxílio à reprodução de cães, observa-se que há uma discrepância entre os graus de evolução de umas comparadas a outras. As biotécnicas de tecnologia de sêmen e IA estão mais avançadas do que as demais. O que se espera é que à medida que o interesse na reprodução de cães aumente, o desenvolvimento e aperfeiçoamento das diferentes biotécnicas cresçam junto. O avanço no desenvolvimento dessas biotécnicas contribuirá não somente para o alavancamento da reprodução de cães, mas também para a aplicação dessas biotécnicas reprodutivas para canídeos selvagens. Referências bibliográficas 1) ANDERSEN K. Insemination with frozen dog sêmen based on a new insemination technique. Zuchtygiene 1975;10:1-4. 2) BOLAMBA D, BORDEN-KUSS K.D, DURRANT BS. In vitro maturation of domestic dog oocytes cultured in advanced preantral and early antral follicles. Theriogenology 1998;49: ) BUENO R et al., Qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães Efeito do meio diluidor. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia 2001;53: ) CARDOSO RCS. Características in vitro do espermatozóide canino criopreservado em água de coco. Fortaleza, 2005, 196p. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) Universidade Estadual do Ceará, ) CARDOSO RCS, SILVA AR, UCHOA DC, SILVA LDM. Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with egg yolk and three different glycerol concentrations. Theriogenology 2003;59: ) CONCANNON P, LASLEY P, VANDERLIP S. LH release, estrous induction and fertile ovulations in response to pulsatile administration of GnRH in anestrous dog. J Reprod Fert 1997;51: ) CONCANNON PW. Methods of rapid induction of fertile estrous in dogs. In: KIRK, R.W. Current Veterinary Therapy XI, Philadelphia: W.B. Saunders, p , ) CONCANNON P, TEMPLE M, MONTENEZ A, NEWTON L. Effect of dose and duration of continuous GNRH-agonist treatment on induction of estrus in beagle bitches: Competing and concurrent up-regulation and down-regulation of LH release. Theriogenology 2006;66: ) CUNHA ICN, LOPES MD. Estudo da viabilidade do processo de refrigeração do sêmen canino, utilizando-se diluidores à base de leite e glicina gema. Rev Bras Reprod Anim 1997;21: ) DOBRINSKY I, AVARBOCK M, BRINSTER R. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biol Reprod 1999;61: ) DURRANT BS et al., Isolation and characterization of canine advanced preantral and early antral follicles. Theriogenology 1998;49: ) ENGLAND GCW, PONZIO P. Comparison of the quality of frozen-thawed and cooled-rewarmed dog semen. Theriogenology 1996;46: ) ENGLAND GCW, VERSTEGEN JP, HEWITT DA. Pregnancy following in vitro fertilization of canine oocytes. Vet Rec 2001;148: ) FAHRING BM. Cryopreservation by pellet freezing of epididymal and ejaculated spermatozoa from male dogs. Louisiana, 2003, 116p. Tese (Doutorado) - Louisiana State University, ) FARSTAD W. Semen cryopreservation in dogs and foxes. Anim Reprod Sc 1996;42: ) FARSTAD W. Current state in biotechnology in canine and feline reproduction. An Reprod Sc 2000;60-61: s169

16 Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive biotechnology in dogs Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s165-s ) FARSTAD W, ANDERSEN-BERG K. Factors influencing the success rate of artificial insemination with frozen semen in the dog. J Reprod Fert 1989;39: ) FAYRER-HOSKEN R. Emerging technologies in small animal theriogenology. In: KUSTRITZ, M.V.R. Small Animal Theriogenology. St. Louis: Elsevier Science USA, 2003, p ) FONTENELE PS et al. Conservação a 5 C do sêmen canino diluído em água de coco. Ci Anim 2002;12: ) FULTON RM et al. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) for the treatment of canine infertility. Theriogenology 1998;49: ) GOBELLO C, CORRADA Y. Biotechnology in canine reproduction: an update. Analecta Vet 2003;23: ) HAY MA. et al. Canine spermatozoa Cryopreservation and evaluation of gamete interaction. Theriogenology 1997;48: ) IGUER-OUADA M. Medically assisted procreation in Canine Species: Analyses and 4 C preservation of semen. Liège, 2001, 219p. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) - Université de Liège, ) IVANOVA-KICHEVA MG, BOBADOV ND, SOMLEV B. Cryopreservation of canine semen in pellets and in 5-mL aluminum tubes using three extenders. Theriogenology 1997;48: ) JEUKENNE P, VERSTEGEN, J. Termination of diestrous and induction of estrous in diestrous non pregnant bitches by the prolactin antagonist cabergoline. J Reprod Fert 1997;51: ) KIM YJ et al. Artificial insemination with frozen semen in the dog simple freezing method using methanol. Korean J Vet Res 1994;34: ) LEE BC et al. Dogs cloned from adult somatic cells. Nature 2005;436: ) LINDE-FORSBERG C, FORSBERG M. Fertility in dogs in relation to semen quality and the time and site of insemination with fresh and frozen semen. J Reprod Fert 1989;39: ) LUVONI GC. Current progress on assisted reproduction in dogs and cats: in vitro embryo production. Reprod, Nutrition and Develop 2000;40: ) LUVONI GC et al. Meiosis resumption of canine oocytes cultured in the isolated oviduct. Reprod Dom An 2003;38: ) LUVONI GC et al. Factors involved in vivo and in vitro maturation of canine oocyte. Theriogenology 2005;63: ) MADEIRA VLH et al. Uso da água de coco em pó na conservação do sêmen de cães a 4ºC. In: VIII SEMANA UNIVERSITÁRIA DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ. Fortaleza, Proceedings... Universidade Estadual do Ceará. Fortaleza, v.1, p.1. 33) METCALF S, SHAW JM, GUNN IM Xenografting of canine ovarian tissue to ovariectomized severe combined immunodeficient (SCID) mice. J Reprod Fert 2001;57: ) MURAKAMI M et al. Development of interspecies cloned embryo in yalk and dog. Cloning Stem Cells 2005;7: ) NÖTHLING JO, GERSTENBERG C, VOLKMANN DH. Success with intravaginal insemination of frozenthawed dog semen a retrospective study. J South Af Vet Assoc 1995;66: ) OHL DA et al. Electroejaculation does not impair sperm motility in the beagle dog - a comparative-study of electroejaculation and collection by artificial vagina. J Urol 1994;152: ) OLAR TT, BOWEN RA, PICKETT BW. Influence of extender, cryopreservative and seminal processing procedures on post-thaw motility of canine spermatozoa frozen in straws. Theriogenology 1989;31: ) OLIVEIRA ECS et al. Viabilidade in vitro do sêmen canino submetido a congelação de diferentes diluidores e crioprotetores. Rev Bras Reprod An 2003;27: ) PEÑA A, LINDE-FORSBERG C. Effects of spermatozoa concentration and post-thaw dilution rate on survival after thawing of dog spermatozoa. Theriogenology 2000;54: ) PEÑA AI et al. Effects of Sodium Dodecyl Sulphate on post-thaw dog semen quality during in vitro incubation at 39ºC and 22ºC. Reprod Dom Anim 1998;33: ) POLGE C., SMITH AU, PARKERS AS. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydratation at low temperature. Nature 1949;164: ) PONGLOWHAPAN S, ESSÉN-GUSTAVSSON B, LINDE-FORSBERG C. Influence of glucose and fructose in the extender during long-term storage of chilled canine semen. Theriogenology 2004;62: ) RAVASZOVA O et al. A study of the properties of dog ejaculate during long-term storage. Folia Vet 1996;40: ) RENTON JP et al. Ovulation, fertilization and early embryonic development in the bitch (Canis familiaris). J Reprod Fert 1991;93: ) RODRIGUES BA, RODRIGUES JL. Influence of reproductive status on in vitro maturation of oocytes in s170

17 Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive biotechnology in dogs Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s165-s178. dogs. Theriogenology 2003;60: ) ROTA A et al. Effect of the inclusion of skimmed milk in freezing extenders on the viability of canine spermatozoa after thawing. J Reprod Fert 2001;57: ) ROTA A et al. Evaluation of cabergoline and busserelin efficacy for oestrus induction in the bitch. Reprod Dom Anim 2003;38: ) SEAGER SWJ. Successful pregnancies utilizing frozen dog semen. Artificial Insemination Digest 1969: ) SEAGER SWJ, FLETCHER WS. Collection, storage and insemination of canine semen. Laboratory Animal Science 1972;22: ) SILVA AR, UCHOA DC, SILVA LDM. Uso da sonda de Osíris na inseminação artificial com sêmen a fresco em cadelas da raça Rottweiler. Rev Bras Reprod Anim 2002;5: ) SILVA AR, CARDOSO RCS, UCHOA DC, SILVA LDM. Quality of canine semen submitted to single or fractioned glycerol addition during the freezing process. Theriogenology 2003;59: ) SILVA AR, CARDOSO RCS, SILVA LDM. Principais aspectos ligados à aplicação da inseminação artificial na espécie canina. Rev Port Ci Vet 2003;98: ) SILVA LDM. Procréation medicalement assistée dans l espèce canine. Investigations morpho-fonctionnelles et optimisation dês techniques permettant d arriver à la maêtrise de la reproduction. Liège, 1995, 173p. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) - Université de Liège, ) SILVA LDM. Avanços da inseminação artificial na espécie canina. Rev Bras Reprod An 2001;25: ) SILVA LDM, VERSTEGEN J. Comparisons between three different extenders for canine intrauterine insemination with frozen thawed spermatozoa. Theriogenology 1995;44: ) SILVA LDM, ONCLIN K, LEJEUNE B, VERSTEGEN J. Comparisons of intravaginal and intrauterine insemination of bitches with fresh or frozen semen. Vet Rec1996;138: ) SIRIVAIDYAPONG S. Motility and viability of canine epididymal sperm collected by different methods. In: PROC. 3 RD EVSSAR EUROPEAN CONGRESS ON REPRODUCTION IN COMPANION, EXOTIC AND LABORATORY ANIMALS. Liège, Proceedings Liège, p ) SOARES MP et al. Etilenoglicol na criopreservação de sêmen canino. Ci Rural 2002;32: ) SONGSASEN N, WILDT DE. Size of the donor follicle, but not stage of reproductive cycle or seasonality, influences meiotic competence of selected domestic dog oocytes. Mol Reprod Develop 2005;72: ) STORNELLI MA et al. Estudio comparativo del efecto de tres diluyentes sobre la supervivencia de semen canino almacenado refrigerado a 4 C. Rev Bras Reprod An 2001;25: ) STRÖM B, ROTA A, LINDE-FORSBERG C. In vitro characteristics of canine spermatozoa subjected to two methods of cryopreservation. Theriogenology 1997;48: ) TAINTURIER T et al. Declenchement des chaleurs chez la chienne par un antiprolactine: la metergoline. Pratique Médical et Chirurgicale Comp.1994;29: ) TAS M et al. Effect of transport and storage temperature of ovaries on in vitro maturation of bitch oocytes. An Rep Sc 2006;96: ) THOMAS PGA et al. A comparison of three packaging techniques using two extenders for the cryopreservation of canine semen. Theriogenology 1993;40: ) TSUTSUI T, KAWAKAMI E, MURAO I, OGASA A. Transport f spermatozoa in the reproductive tract of the bitch: observations through uterine fistula. Jap J Vet Sc 1989;51: ) TSUTSUI T et al. An experimental trial on embryo transfer in the dog. Jap J Vet Sc 1989;51: ) TSUTSUI T et al. Effects of Orvus ES paste on canine spermatozoal longevity after freezing and thawing. J Vet Med Sc 2000;62: ) TSUTSUI T et al. Transfer of canine embryos at various developmental stages recovered by hysterectomy or surgical uterine flushing. J Vet Med Sc 2001;63: ) VARELLA JR AS et al. Effect of low density lipoproteins from hen egg yolk on the quality of canine semen cooled at 5ºC. In. 15 TH INTERNATIONAL CONGRESS OF ANIMAL REPRODUCTION, Porto Seguro, Proceedings Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Porto Seguro, p ) VERSTEGEN J et al. Conservation of canine semen motility parameters assessed using the Hamilton Thorn computer assisted motility analyzer and of acrossome reaction integrity in semen frozen after up to 3 days conservation at 4ºC (Chilled). In: PROC. 3 RD EVSSAR EUROPEAN CONGRESS ON REPRODUCTION IN COMPANION, EXOTIC AND LABORATORY ANIMALS. Liège, Proceedings Liège, p ) VOLKMAN DH et al. The use of deslorelin implants for the synchronization of estrus in diestrous bitches. In: 5 TH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON CANINE AND FELINE REPRODUCTION, 2004, São Paulo, s171

18 Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive biotechnology in dogs Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s165-s178. Brasil. Proceedings São Paulo. Universidade Estadual Paulista. 2004, p ) WANKE M et al. Induction of oestrus in bitches with normal and persistent anestrous using human menopausal gonadotropin (hmg). Theriogenology 1997;47: ) WILSON MS. Non-surgical intrauterine artificial insemination in bitches using frozen semen. J Reprod Fert1993;47: ) WRIGHT PJ. The induction of estrous and ovulation in the bitch using PMSG and HCG. Australian Vet J1980;56: ) YAMADA S et al. Maturation, fertilization and development of dog oocytes in vitro. Biol Reprod1992;46: ) YU I, LEIBO SP. Recovery of motile, membrane-intact spermatozoa from canine epididymides stored for 8 days at 4 degrees C. Theriogenology 2002;57: ) ZOLDÁG L et al. Fertile estrus induced by bromocryptine, a dopamine agonist: a clinical trial. Theriogenology 2001;55: ) RODRIGUES BA, RODRIGUES JL. Meiotic response of in vitro matured canine oocytes under different proteins and heterologous hormone supplementation. Reprod Dom An 2003;38: s172

19 Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive biotechnology in dogs Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s165-s178. Abstract UPDATE IN REPRODUCTIVE BIOTECHNOLOGY IN DOG Lúcia Daniel Machado da Silva 1* ; Alexandre Rodrigues Silva 2 ; Rita de Cássia Soares Cardoso 3 ¹FAVET-UECE, ²FAVET-UFERSA, ³FAVET-UFPI, *autor para correspondência: Av. Paranjana, 1700 Campus do Itaperi , Fortaleza-CE, Brasil lucia.daniel.machado@hotmail.com Reproductive biotechniques are important for biodiversity preservation and for basic research. The interest for development and application of such biotechniques in dog breeding is steadily increasing and filogenetic similarities enable extrapolation of studies in domestic canidae to wild canidae at risk of extinction, for conservation purposes. This work provides an overview of the main biotechniques employed in domestic dog reproduction. The advances in the development of such biotechniques will contribute to improve dog reproduction and for their application in wild canidae. Keywords: dogs, reproduction, biotechniques, semen, sperm cell, oocyte. Introduction Reproduction biotechniques are important for biodiversity preservation and for basic research. Although the first studies on the use of these biotechniques in dogs date from the late XVIIIth century, small animal reproduction has not seen much development since. Only in recent years has the development and routine application of such biotechniques in dog breeding gained attention. Filogenetic similarities enable extrapolation of studies in domestic canidae to wild canidae at risk of extinction, for conservation purposes. This work provides an overview of the main biotechniques employed in domestic dog reproduction. Semen technology Semen collection is easily performed in dogs, but the presence of a female in estrus can improve the quality of the ejaculate. Frozen swabs impregnated with vaginal secretion from estrus females (54) or the synthetic pherhormone methyl-r-benzoate (43) can also be used. Electroejaculation is restricted to collection of dogs that will not allow digital manipulation and has been compared to the employment of artificial vagina, with no differences concerning the quality of the ejaculate (36). Epididymal sperm can be retrieved from dogs submitted to orchiectomy and dissection of the epididymus and stored at 4ºC for up to 8 days (76). Sperm cells can also be retrieved from epididymus and kept between 15 and 25ºC for up to 20h (14). Epididymal semen collection can be performed inserting a thin needle in the vas deferens and injecting fetal bovine serum, TCM 199 or Tris buffer for lavage of the epididymus tail and retrieval of sperm cells (57). Spermatogoniae have been retrieved from dogs by enzymatic dissociation and transplanted into severely immunodrepressed mice. The efficacy of the technique was monitored immunohistochemically and the presence of canine germinative cell division was observed in the receptor mice. Despite observation of cell division and transformation, the development of espermatogoniae into sperm cells has not been described to date (10). When semen is collected for posterior use, sperm viability can be improved by cooling and adding extenders such as skimmed milk (9), egg yolk glycine (9), egg yolk Tris (60) and coconut water, both in natura (19) and in powder (32). Cooled semen can be transported in different types of containers and is viable for one to five days, as long as temperature is kept between 4 and 5 C (12). Changing the extender promotes viability of canine semen for another 20 days, once the energetic substrate available for the sperm cells is renewed (23). Also, supplementation of the Tris buffer with fructose instead of glucose improves preservation of sperm cell motility for up to 23 days under 5 ºC (42). Several extenders can be used for canine semen freezing, such as lactose (48), Tris (1), Bes-lactose (64), Triladyl (35), Tes/Tris (3), Biociphos W482 (53), Laiciphos 478 (53), the Cryogenetics Laboratory of New England extender- CLONE (61), skimmed milk (46) and a coconut water extender, in natura (5) or in powder (4). However, the Tris buffer remains the most commonly used extender by most research groups, with excellent in vitro and in vivo results (120). Egg yolk is added to the extender usually at 20% (51) but is at risk of disease transmission because of its biological origin. Thus, replacement by other synthetic and purified lipids like the hydroxytoluene butilate analogues (15) has been suggested. The use only of the low density lipoproteins in the egg yolk for semen conservation has been proposed (69). Cryoprotectors such as glycerol (41), dimethylsulfoxide (37), methanol (26), ethyleneglycol (58) and dimethylformamide (38) have been employed in canine semen freezing procedures, but glycerol still is the most commonly used, in concentrations between 2 and 8%. The Equex STM (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA - 93) and the Orvus ES (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA - 67) pastes are commercial additives containing a detergent substance (sodium s173

20 Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive biotechnology in dogs Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s165-s178. dodecyl sulphate SDS) that increases resistance to freezing hazards, improving sperm cell post-thaw survival time. Some authors suggest that similar results can be achieved by the addition of the SDS active ingredient alone (0.25%) to extenders (40,46). Concentrations employed for sperm freezing vary from 10 x 10 6 (3,67) to 8 x 10 8 sperm cells/ml (39). Other researchers employ a fixed dilution based on the volume of sperm to be frozen and varying between one part of semen to one part of extender and one part of semen (4,5,51) to four parts of extender (12). The most usual method for canine sperm freezing was described in 1972 (1) and is the base for several studies, with minor changes. Sperm thawing is performed at 37 o C (121) to 75 o C (37) and storage can be in tablets (24,64), 5mL alluminium canes (24) or preferably 0.25mL (4,120) or 0.5mL (64) straws. Frozen/thawed semen can also be maintained at 4ºC for up to three days post-thawing (70). Artificial insemination For intravaginal AI, a rigid catheter (49) or an Osiris catheter (53) can be used. One of the techniques for intrauterine AI is the transcervical catheterism (1), where a scandinavian AI catheter covered with two plastic sheaths is advanced through the cervix. Vaginal endoscopy is performed with a rigid fiberoptic endoscope and a urinary catheter and is used for catheterization of the cervix (73). Intrauterine artificial insemination via laparotomy (65) was developed to overcome the difficulties of cervical catheterism, but has the disadvantage of the inherent risks to any surgical procedure (54). Laparoscopic intrauterine artificial insemination, albeit surgical, is less invasive and faster. Regardless of the use of fresh (56) or frozen semen (55), results with this technique have been satisfactory so far. Successful inseminations of bitches are being achieved with a large number of sperm cells, frequent inseminations or both. It has been suggested that 100 x 10 6 sperm cells give acceptable whelping rates and litter size (17). Both methods are similarly efficient when fresh semen is employed, with results close to natural breeding (50). When cooled semen is used, whelping rates are usually above 70%, but success depends on a good timing between sending the semen and performing IA (52). Whelping rates following AI with frozen semen are inferior to those obtained with fresh semen (28). Control of the estrous cycle Some of the different protocols employed for this purpose are: intravenous administration of high doses of GnRH every 90 minutes (6); FSH or ecg administration to induce follicular development and manifestation of proestrous (74), FSH or ecg administration followed by application of LH or hcg to promote ovulation of developed follicles (74) and estrogen (7) or human menopausal gonadotrophin (hmg - 72) administration for previous sensitization of the hypothalamic-pituitary axis previous to administration of the forementioned drugs. The more efficient and safer protocol for the bitch s reproductive life is the administration of antiprolactinic drugs such as bromocriptine (77), metergoline (62) and carbegoline (25), that promote shortening of the interval between estrus. Studies are under way to develop estrus induction protocols for bitches based on administration of GnRH agonists. Results obtained with subcutaneous administration of busereline acetate are inferior to carbegoline (47); promising results are being observed with subcutaneous implants for continuous release of lutreline (8) or desloreline (71). Oocyte manipulation The ovaries of bitches can be obtained by ovariosalpingohisterectomy. Oocytes within the antral follicles are usually retrieved by aspiration, slicing of the ovary and follicular dissection (45). These oocytes can be immediately employed for in vitro fertilization (IVF) or frozen at 18ºC (22). The good quality of canine oocytes is according to the following morphological standard: dark pigmentation and homogeneous cytoplasm, diameter over 100 µm, surrounded by two or more layers of cumullus cells (31). Some authors suggest the use of enzymatic digestion associated to mechanical isolation for retrieval of preantral ovarian follicles (11). It was also reported that canine preantral ovarian follicles could be cultured in vitro following enzymatic isolation with colagenase and DNAse and oocytes would capable of resuming meiotic divisions (2). Canine oocytes can be transported for up to 4 hours in saline solution at 4 C without loss of maturation capacity and possible development to the metaphasis II stage (63). In vitro oocyte culture and maturation Oocyte maturation and fertilization are unique in the canine species. The bitch ovullates an immature oocyte in the germinative vesicle stage requiring 48 hours to complete maturity (52). The culturing times reported for IVM of canine oocytes varies enourmously (above 120h), but results of complete maturation are still controversial and s174