PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE GOMA DE ANGICO E QUITOSANA CONTENDO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia sidoides

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1 PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE GOMA DE ANGICO E QUITOSANA CONTENDO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia sidoides Haroldo C. B. Paula 1*, Fernanda M. Sombra 1, Flávia O. M. S Abreu 1, Regina C. M. de Paula 2 1* Departamento de Analítica e Físico-Química, Universidade Federal do Ceará - UFC, Fortaleza-CE hpaula@ufc.br 2 Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará - UFC, Fortaleza-CE Nanopartículas (NP) à base de quitosana (QT) e goma de angico (GA) foram preparadas e dopadas com óleo essencial com atividade larvicida (Lippia sidoides-ls). As nanopartículas foram caracterizadas quanto ao seu tamanho, grau de dopagem e cinética de liberação in vitro e in vivo. As NPs apresentaram tamanho médio de partícula entre 10 e 60 nm com dopagem máxima de 5,3 ± 0,3%, sendo similar para as amostras com razão Ls:GA =1:2, 1:4 e 1:10. A dopagem não alterou significativamente o tamanho e a distribuição de volume das NPs. Os perfis de liberação in vitro para as amostras com diferentes graus de dopagem revelaram que a amostra com Ls:GA = 1:10 apresentou cinética de liberação mais prolongada do que a amostra com Ls:GA 1:20. A taxa de mortalidade de larvas de Aedes aegypti foi proporcional ao grau de dopagem das nanopartículas. A amostra com Ls:GA 1:10 apresentou um efeito larvicida eficaz prolongado, com 85 ± 3% de mortalidade após 24h enquanto que a amostra com razão Ls:GA 1:20 apresentou 55 ± 1,5% de mortalidade, provavelmente devido à menor dopagem de larvicida. Palavras-chave: Óleo essencial, nanopartículas, quitosana, goma de angico, sistema de liberação controlada. Preparation and characterization of nanoparticles of Chitosan/Angico Gum loaded with Lippia sidoides essential oil Nanoparticles of chitosan (QT) and angico gum (GA) were prepared and loaded with an essential oil with larvicide activity (Lippia sidoides -Ls). The nanoparticles (NP) were characterized with respect to their size, larvicide loading, swelling and in vitro and in vivo release kinetics. The different formulations presented particle size ranging from 10 to 60 nm, and the loading efficiency varied from 3.3 to 5.3 %. In vitro release profiles for nanoparticles showed that the sample having higher loading values presented a more prolonged release. The in vivo tests showed that the mortality rate was related to nanoparticle loading, where the sample produced with Ls:GA = 1:10 showed an effective larvicide effect, with 85± 3% % of mortality after 24h. The sample produced with Ls:GA 1:20 showed a lower mortality rate for the same period (55 ± 1,5% ), likely due to the lower Ls loading. Keywords: Essential oil, nanoparticles, chitosan, Angico Gum, drug delivery. Introdução A quitosana é um conhecido polissacarídeo composto de unidades glucosaminas e acetilglucosaminas unidas por ligações -D-(1,4) [1], cuja biocompatibilidade, biodegradabilidade e facilidade de bioabsorção no organismo têm despertado crescente interesse nos últimos anos para aplicações médicas e farmacêuticas, em especial para produção de hidrogéis carreadores de princípios ativos [2]. Complexos polieletrolíticos (PEC) a base de quitosana podem ser formados pela combinação com polímeros que contém grupos carboxílicos, como o poli(ácido acrílico) [3], ou com polissacarídeos como xantana [4], pectina [5] e alginato [6, 7]. A goma de angico, oriunda da (Anadenanthera macrocarpa Benth) é um polissacarídeo composto por arabinose (67,8%), galactose (24,1%), ácido urônico (5,9%) e traços de ramnose, cuja abundância de grupos carboxílicos possibilita a formação de um complexo com a quitosana [8]. Sistemas particulados a

2 base de quitosana [9] tem sido produzidos e testados para liberação de vários princípios ativos, como a ampicilina [10] diclofenaco de sódio [11], hemoglobina [12] e proteínas como insulina e BSA [13]. Nanopartículas de quitosana foram usadas no encapsulamento de clotrimazol e econazol [14], quando reticuladas com politrifosfato e genipina [15] encapsularam indometacina e quando reticuladas com sulfato de sódio e revestidas com alginato [16] foram usadas para adsorção de antígenos para uso em vacinas. Apesar do uso extensivo de nanopartículas na produção de sistemas de liberação controlada de substancias nas áreas médica e farmacêutica, poucas publicações reportaram o uso de tais sistemas no campo da agricultura, particularmente como veículos de pesticidas [17-20]. Guan e colaboradores [20] desenvolveram uma nova formulação encapsulando um pesticida biodegradável em nanopartículas de quitosana e alginato, com resultados promissores. Em trabalho anterior, o pesticida diclorovinila dimetilfosfato (DDVP) foi usado como molécula modelo de pesticida dosado em esferas de quitosana com goma do cajueiro (QT/GC) [19]. Lippia sidoides (Ls) é uma planta presente no Nordeste brasileiro que produz um óleo essencial rico em timol e de potente ação antimicrobiana contra fungos e bactérias. Estudos recentes apontaram que o timol pode apresentar promissora atividade larvicida contra as larvas do A. aegypti [21,22]. Neste trabalho é reportada a preparação e caracterização de nanopartículas de QT/GA contendo Ls, onde os perfis de liberação in vitro e in vivo do larvicida foram investigados de forma a avaliar a potencialidade do sistema para uso como uma nova ferramenta no controle da dengue. Experimental Materiais Foram utilizados os polímeros quitosana (75% de grau de desacetilação, MW =1,8 x10 5 g/mol), fornecido pela Polymar e goma de angico nativa do Ceará (Anadenanthera macrocarpa Benth), purificada conforme descrito em trabalho anterior [22]. Óleo essencial de Lippia sidoides (Produtos Naturais LTDA Pronat Horizonte, CE) e Tween 80 (Vetec) foram usados sem qualquer tipo de preparação prévia. Produção das nanopartículas de GA/QT Foram preparadas soluções de goma do angico 0,25 % em meio aquoso e de quitosana 0,075 % em ácido acético, na proporção GA:QT = 10:1 (m/m) [8]. A solução de GA foi gotejada na solução de QT sob agitação através da bomba peristáltica, e o complexo formado ficou em repouso por 24 horas. Uma emulsão foi preparada com Lippia sidoides (Ls) e Tween, usando diferentes proporções (m/m) de óleo:ga (1:2, 1:4, 1:10, 1:15 e 1:20). A emulsão foi adicionada lentamente ao complexo sob agitação, seguida por secagem por spray drying em um equipamento da Buchi, modelo B290, operando com a temperatura de entrada 160 ºC e saída 70 ºC, vazão de alimentação de 6 ml/min, aspiração a 35 m 3 /h e rotâmetro a 84 l/h.

3 Caracterização das nanopartículas As nanopartículas foram analisadas por espectroscopia na região do Infravermelho, utilizando equipamento SHIMADZU 8300 em pastilhas de KBr. O tamanho de partícula, a distribuição de tamanho e o potencial zeta foram determinados em um equipamento Zeta sizer, da Malvern. Dopagem O teor de Lippia sidoides nas nanopartículas foi determinado através de maceração de cerca de 10 mg de nanopartículas em etanol, seguida por análise em espectrofotômetro de absorção UV-Visível, no comprimento de onda de 260 nm, tendo a concentração e o teor sendo calculada através da curva de calibração. As análises foram feitas em triplicata. Estudos cinéticos da liberação in vitro A cinética in vitro do larvicida liberado das nanopartículas foi monitorada através de espectroscopia de ultravioleta (UV). Para isto, pesou-se cerca de 100 mg da amostra, solubilizou-se em 10ml de água deionizada. Após agitação, transferiu-se a solução para uma membrana de diálise, a qual foi hermeticamente lacrada e colocada em um béquer com 100 ml de água. Todo o sistema foi mantido sob agitação, a temperatura constante. Alíquotas de 0,5 ml foram retiradas em determinados intervalos de tempo e analisadas em espectrofotômetro de UV. As medidas foram feitas em triplicata. Testes in vivo Os testes in vivo foram realizados para observar a eficácia da liberação controlada de Ls. As nanopartículas dopadas com diferentes teores de L S foram colocadas em béqueres com 50 ml, no qual foi colocada uma população de vinte larvas de St. Aegypti no Estágio Três. A população de larvas vivas foi determinada através de contagem e retirada das larvas mortas após 24 h, 48 h e 72 h de exposição ao princípio ativo. Cada teste foi feito em duplicata, usando um controle sem larvicida. Resultados e Discussão Nanopartículas de QT/GA foram produzidas com diferente razão Ls:GA, a fim de otimizar a dopagem e avaliar a eficiência do sistema na mortalidade das larvas do A. aegypti. As nanopartículas QT/GA tiveram o rendimento reacional e o grau de dopagem determinado, conforme expresso na Tabela I. Pode-se observar que o rendimento reacional para produção das nanopartículas foi em média de 50%, o que pode ser atribuído a não-otimização dos parâmetros operacionais do Spray Dryer. A dopagem de Ls nas nanopartículas foi maior para as formulações Am 1, Am 2 e Am 3. A formulação com razão Ls:GA =1:10 foi a que apresentou melhor eficiência, com um maior rendimento (61%) e

4 com maior dopagem de Ls (5,2 ± 0,3%). O tamanho médio das partículas dopadas e não-dopada (branco), bem como a variação do tamanho das nanopartículas foi avaliado em um zeta sizer Malvern (Figura I). Observa-se na Figura I (a) e (b) que em geral, as amostras apresentaram um tamanho de partícula médio que variou de 10 a 60 nm, com índice de polidispersão na faixa de 0,3 a 1. As amostras Am 1 e Am 3 (Fig. I (b)) exibiram um maior grau de polidispersão, com uma pequena fração de partículas com diâmetros na faixa de 200nm. Observa-se que a amostra não-dopada (branco) apresenta tamanho de partícula similar às amostras com Ls, de forma que a dopagem não alterou significativamente no tamanho das nanopartículas. Tabela I - Rendimento e dopagem das nanopartículas QT/GA obtidas com diferentes razões Ls:GA Razão Ls:GA Rendimento experimental (%) Dopagem de Ls (%) Am 1 (1:2) 42,2 5,3 ± 0,3 Am 2 (1:4) 30,4 5,2 ± 0,3 Am 3 (1:10) 61,1 5,2 ± 0,2 Am 5 (1:20) 52,6 3,3 ± 0,1 Figura I Perfis de distribuição de tamanho de partícula para as nanopartículas QT/GA não-dopadas e dopadas com diferentes razões Ls:GA.

5 Absorbância As nanopartículas de QT/GA dopadas e não-dopadas com Ls foram caracterizadas através da análise de seus principais grupamentos funcionais por espectroscopia de infravermelho (FT-IR), conforme ilustrado na Figura II. Observa-se que todas as nanopartículas apresentaram bandas de absorção em 1412 cm -1 e 1610 cm -1, correspondentes respectivamente aos estiramentos assimétrico e simétrico do íon carboxilato (C-O-O - ). Os picos de absorção em 1597 cm -1 e 1655 cm -1 são atribuídos respectivamente ao estiramento do grupo amino e amida da QT, de acordo com o reportado por Lawrie [23]. Ocorre superposição dos sinais devido ao timol, principal constituinte do óleo da Lippia, no qual as nanopartículas de GA/QT dopadas com Ls apresentaram como principais alterações frente às nanopartículas não-dopadas, a presença de novos sinais na região entre 2810 e 2940 cm -1 correspondentes aos grupos metileno e metila de Ls, de 810 a 870 cm -1 dos grupamentos metileno, além de alterações perceptíveis na região de 3300 a 3700 cm -1, região das hidroxilas Am 5 Am 3 Am Número de onda (cm -1 ) Am 1 branco Figura II - Espectro de infravermelho das nanopartículas de QT/GA não dopadas (branco) e dopadas com Ls em diferentes razões Ls:GA= 1:2 (Am 1), 1:4 (Am 2), 1:10 (Am 3) e 1:20 (Am 5).

6 Cinética da liberação de Ls A dopagem de Ls nas nanopartículas (3,3% a 5,3%) foi determinada pelos teores reais de Ls contidos nas nanopartículas e no meio de liberação através da construção de uma curva de calibração de absorbância (Abs.) versus concentração (conc.), dada pela Equação 1: Abs.= 0, ,00179 conc. R 2 =0,992 (1) A liberação de princípios ativos contidos em matrizes poliméricas é governada pela Equação 2, conforme descrito em trabalho anterior [18,19]: M t /M = Kt n (2) Nesta equação M t /M denota a fração de Ls liberada, t é o tempo de liberação e k representa uma constante característica do sistema. O coeficiente difusional (n) é um indicativo do mecanismo de liberação e assumem valores dependentes da geometria apresentada pelo sistema de liberação. A difusão de Fick tipo I é aplicada quando o sistema apresenta um padrão de liberação difusional, enquanto que a difusão tipo II é caracterizada por uma constante de relaxação. Um sistema de difusão não-fickiano envolve os mecanismos de relaxação e difusionais combinados. O valor do expoente n da difusão assume um valor de 0,43 para amostras esféricas, enquanto assume valores entre 0,43 e 0,85 para transporte fickiano anômalo. Um valor de n igual a 0,85 é característico de transporte tipo II [24]. A partir da Equação 2, usando o modelo de Higuchi, pode-se observar a cinética de liberação de Ls a partir das nanopartículas de QT/GA, e calcular os parâmetros difusionais n e K. A Figura III mostra o perfil cinético de liberação para as nanopartículas de QT/GA em função do tempo. Observa-se que a amostra Am 3 apresentou um perfil de liberação mais prolongado do que a amostra Am 5. A Tabela II mostra os valores de n e K obtidos, bem como o coeficiente de correlação da cinética de liberação de Ls para as nanopartículas de QT/GA. O valor do expoente n para ambas as nanopartículas foi de 1,1, característico de comportamento nãofickiano (Transporte tipo II). Tal comportamento foi observado também esferas de alginato [17], bem como para microesferas de poliacrilamida-g-goma guar [18].

7 % Ls Liberado Tempo (min) Figura III Perfil cinético de liberação in vitro de Ls das nanopartículas Am 3 ( ) e Am 5 ( ) (a) em função do tempo; (b). Tabela II - Parâmetros de Higuchi obtidos da cinética de liberação in vitro Nanopartículas K n R 2 Am 3 Ls:GA (1:10) 0,0620 1,10 0,9996 Am 5 Ls:GA (1:20) 0,0805 1,09 0,9999 Testes in vivo (bioensaios) com nanopartículas de QT-GA: Visando verificar o efeito da razão Ls:GA na mortalidade larval, procederam-se os experimentos com as amostras Am 3 e Am 5. As nanopartículas de QT/GA dopadas com Ls foram avaliadas quanto à cinética de mortalidade das larvas do mosquito A. aegypti, conforme ilustrado na Figura IV. As diferentes formulações tiveram diferente grau de dopagem, que influenciou na mortalidade. O teste com 36 ppm de Ls livre levou a 100% de mortalidade das larvas em 24h. A formulação Am 3 teve o maior grau de dopagem (5,2%) e conseqüentemente teve melhor desempenho, com um índice de mortalidade médio de 85±3% em 24h e de 92±2% após 48 e 72h. A amostra Am 5 apresentou desempenho inferior a este, com 55±3% de mortalidade após 24h, o que pode ser atribuído a menor dopagem do sistema (3,3%). Pode-se concluir que as nanopartículas contendo Ls produzidas na razão Ls:GA 1:10 podem gerar um excelente controle larval por mais de 3 dias.

8 % Mortalidade das larvas 100 Am3 Am h 48h 72h Tempo Figura IV Cinética da mortalidade das larvas com nanopartículas de QT/GA produzidas com diferente razão Ls:GA: (1:10) Am 3 e (1:20) Am 5 Conclusões As diferentes formulações desenvolvidas produziram nanopartículas com tamanho médio de partícula entre 10 e 60 nm. A inserção de óleo de Ls nas NPs não alterou significativamente seus tamanho e distribuição de volume. A análise de infravermelho revelou que a introdução de Ls na nanopartícula levou à presença de novos sinais na região entre 2100 a 2300 cm -1, além de alterações perceptíveis na região de 3300 a 3700 cm -1. A dopagem das nanopartículas não variou para as formulações produzidas com Ls:GA =1:2, 1:4 e 1:10, onde todas tiveram inserido cerca de 5% de óleo nas matrizes. O perfil de liberação in vitro das amostras revelou que a Am 3 apresentou maior teor de dopagem (5,2%) do que a Am 5 (3,3%), cujo perfil cinético apresentou liberação mais prolongada. A liberação pelo modelo de Higuchi revelou que ambas as amostras apresentam comportamento não-fickiano. Os testes in vivo revelaram que as nanopartículas Am 3 foram as mais efetivas, com uma taxa de mortalidade média de 85% em 24h. A amostra Am 5 apresentou desempenho inferior, provavelmente devido ao menor grau de dopagem. Esses resultados apontam que as nanopartículas QT/GA com razão Ls:GA 1:10 mostraram-se particularmente eficientes para o controle das larvas do mosquito Aedes aegypti. Agradecimentos Ao CNPQ pela bolsa PIBIC-UFC e ao CNPQ/ BNB pelo auxílio financeiro.

9 Referências Bibliográficas 1. Berger J. et al. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2004, 57, Krajewska, B. Enzyme and Microbial Technology 2004, 35, De La Torre, P. M.; Torrado, S.; Torrado, S. Biomaterials 2003, 24, Drogoz, A. et al Biomacromolecules, 2008, 9, Zhang, X. Z.; Wu, D.Q.; Chu, C.C. Biomaterials 2004, 25, George, M; Abraham, T. E. Journal of Controlled Release 2006, 114, Becherán-Marón, C.; Peniche, C.; Arguelles-Monal, W. International Journal of Biological Macromolecules 2004, 34, Oliveira, M. A., Ciarlini, P., Feitosa, J., de Paula, R. C. M., de Paula, H. C. B. Materials Science and Engineering 2009, C Schaffazick R., et al. Eur. J. Pharm. Biopharm., 2003, 56, Anal, A. K.; Stevens, W. F. International Journal of Pharmaceutics 2005, 290, Gonzalez-Rodriguez M. L et al. International Journal of Pharmaceutics 2002, 232, Kumar, M.N.V.R. Reative Funcional Polymers 2000, 46, Xu, Y.; Du, Y.International Journal of Pharmaceutics, 2003, 250, Pandey, R. et al. International Journal of Pharmaceutics, 2005, 301, Mi, F. L. et al. Carbohydrate Polymers, 2000, 41, Borges, O. et al. International Journal of Pharmaceutics,2005, 299, Kulkarni, A. R.; Soppimath, K. S.; Aminabhavi, T. M.; Mehta, M. H.; Dave, A. M. J Appl Polym Sci 1999, 73, Soppirmath, K. S.; Aminabhavi, T. M. Eur. J. Pharm. Biopharm, 2002, 53, Paula, H. C. B.; de Paula R. C. M.; Bezerra S.K.F. J. Applied Polymer Science, 2006, 102, Guan H., Chi, D, Yu, J., Li, X. Pesticide Biochemistry and Physiology 2008, 92, Carvalho, Ana Fontenele Urano et al. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2003,98, Vasconcelos, et al. Veterinary Parasitology 2007, 148, Lawrie G. et al. Biomacromolecules 2007, 8, Kosmeyer, RC; Pepas, N A. J. Membrane Science 1981, 9, 211.