Preparação de nanocápsulas de quitosana por geleificação iônica contendo hormônio folículo estimulante

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1 Preparação de nanocápsulas de quitosana por geleificação iônica contendo hormônio folículo estimulante Ana K. E. Torres 1 Angelo R. A. Silva 1*, Marina B. M. V. Damasceno 2, Adriana R. C. Barros 2 1- Universidade de Fortaleza, curso de Farmácia, Fortaleza, CE angelor@unifor.br 2-Universidade de Fortaleza, Mestrado em Ciências Médicas, Fortaleza, CE Resumo: Os polímeros são atualmente parte integrante no desenvolvimento de nanopartículas para liberação de fármacos, proteínas, aminoácidos e peptídeos. Entretanto, existem poucos estudos que permitam a utilização de forma segura e garantindo uniformidade nas propriedades desses sistemas. Alguns polissacarídeos surgem com potencial no desenvolvimento de nanopartículas principalmente por terem baixa toxicidade. O Objetivo desse trabalho foi desenvolver nanocápsulas de quitosana, por geleificação iônica, encapsulando o hormônio folículo estimulante (FSH). A quitosana foi previamente purificada para obtenção da forma neutralizada da quitosana. Foram testadas faixas de concentração do reticulante tripolifosfato (TPP) e da quitosana para garantir o melhor tamanho e polidispersão de nanopartícula, que nesse estudo foram de 160 nm e 0,3 respectivamente. A nanocápsula de quitosana com FSH (QT- FSH) apresentou eficiência de encapsulação do FSH de 60%. Esses resultados demonstram a possibilidade do método e da quitosana na incorporação de peptídeos. Palavras-chave: Nanopartiulas, Nanocápsulas, Quitosana, FSH. Preparation of chitosan nanocapsules by ionic gelation containing follicle stimulating hormone Abstract: Polymers are now an integral part of the development of nanoparticles for delivery of drugs, proteins, amino acids and peptides. However, there are few studies that allow for safe use and ensuring uniformity in the properties of these systems. Some polysaccharides appear to have potential in the development of nanoparticles mainly because they have low toxicity. The objective of this work was to develop chitosan nanocapsules, by ionic gelation, encapsulating follicle stimulating hormone (FSH). The chitosan was previously purified to obtain the neutralized form of chitosan. Concentration ranges of the tripolyphosphate crosslinker (TPP) and chitosan were tested to ensure the best nanoparticle size and polydispersity, which in this study were 160 nm and 0.3 respectively. The chitosan nanocapsule with FSH (QT- FSH) presented 60% FSH encapsulation efficiency. These results demonstrate the possibility of the method and chitosan in the incorporation of peptides. Keywords: Nanoparticles, Nanocapsules, Chitosan, FSH. Introdução A nanotecnologia está hoje na maioria das indústrias como a farmacêutica, eletrônica, entre outras. Na área farmacêutica o desenvolvimento das nanopartículas para a incorporação de fármacos tem se destacado, e hoje vários nanoprodutos estão no mercado. As nanopartículas podem ser obtidas por polímeros naturais, sintéticos e semissintéticos. Os polímeros biodegradáveis como PLGA e quitosana são os mais estudados e utilizados, por serem menos tóxicos ao organismo e adequados para o encapsulamento de muitas substâncias. [1-4] A quitosana é um polissacarídeo semissintético ou biopolímero, hidrofílico, composto por unidades de N-acetil-D-glicosamina e D-glicosamina, obtido pela desacetilação da quitina, que é um constituinte de exoesqueletos de crustáceos e outros animais marinhos. Para a preparação de nanocápsulas de quitosana geralmente o processo utilizado é a geleificação iônica ou ionotrópica.[2-7] Segundo Calvo et al. (1997), as nanopartículas de quitosana, possuem potencial para incorporar proteínas e outras macromoléculas, que tem dificuldade de serem absorvidas por via oral e muitas des- Anais do 14º Congresso Brasileiro de Polímeros Águas de Lindóia, SP 22 a 26 de outubro de

2 sas proteínas e macromoléculas, devido ao ph do estômago são degradadas antes de serem absorvidas pelo organismo. [3,6-8] O FSH é uma glicoproteína utilizada para regular o crescimento, desenvolvimento, puberdade, reprodução e secreção de hormônios, sendo secretado pela glândula pituitária anterior. Por ser uma macromolécula protéica não é indicada sua absorção via administração oral. A incorporação do FSH nas nanopartículas tem o objetivo de garantir uma via alternativa de administração e prolongar o perfil de liberação para maior manutenção do efeito. [8-10] A importância na caracterização desses sistemas de nanopartículas obtidos por métodos simples de obtenção e caracterização, permite maior exequibilidade ao desenvolvimento de nanopartículas de FSH. [9]. Experimental Gelificação iônica A quitosana obtida da Polymar foi previamente purificada pelo método descrito por [6]. As nanopartículas foram preparadas de acordo com o método de gelificação iônica descrito por [3]. Na preparação de nanopartículas sem FSH foi realizado previamente um estudo na variação nos volumes das soluções de quitosana a 0,1% m/v (14-16 ml), TPP a 0,1% m/m (5-7 ml) e ph da solução de TPP, que deve fica entre 8 a 10 para verificação das condições mais adequadas para formar nanopartículas com tamanhos nanométricos e baixo valor de polidispersão (PDI). Com as condições estabelecidas, em solução, previamente preparada, de quitosana a 0,1% m/v em ácido cético 0,17% m/v, sob constante agitação em agitador magnético, foi gotejada cerca de 5,5 ml solução de TPP a 0,1% m/m. No caso da preparação de QT-FSH o hormônio foi dissolvido na solução de TPP. O aparecimento de turvação serviu como indicativo de formação das nanopartículas, sendo interrompido o gotejamento. Caracterização físico-química das partículas de quitosana As nanopartículas de quitosana foram avaliadas quanto ao tamanho, polidispersão e potencial zeta. Para análise as amostras de nanopartículas com FSH e sem FSH foram diluídas com água obtida por osmose reversa (1,3 µs cm -1 ) e lidas em equipamento Zetasize Nano Zs. As amostras foram lidas em triplicata. Determinação de eficiência de encapsulação por ultrafiltração A quantificação do FSH foi realizada por meio do BCA kit assay (Thermofischer). As nanopartículas foram filtradas em tubo com poro de 10 KDa para separação de FSH não encapsulado. Alíquotas do filtrado foram utilizadas para determinação da concentração de FSH livre (não encapsulado), sendo a eficiência determinada pela diferença entre o valor adicionado de FSH, considerado 100%, pela fração livre. Caracterização de quitosana por Infravermelho Aproximadamente 2,0 mg das amostras de quitosana comercial de caranguejo (Polymar) foram secas em estufa a vácuo por 24 horas a 60 C. Após este período, 100mg de KBr foram adicionados e a mistura homogeneizada em almofariz de ágata. As pastilhas foram preparadas e deixadas em dessecador para posterior leitura. Os espectros de IV foram registrados em um espectrofotômetro Shimadzu IRTracer-100 Fourier transform infrared spectrophotometer. Foram feitas amostras de quitosana antes e após a desmineralização. Resultados e Discussão Caracterização físico-química das partículas de quitosana As Fig. 1, 2 e 3 apresentam avaliação do tamanho de partícula e PDI de nanopartículas vazias de quitosana com variação de volumes de TPP. Anais do 14º Congresso Brasileiro de Polímeros Águas de Lindóia, SP 22 a 26 de outubro de

3 Figura 1- apresenta a determinação do tamanho de nanopartículas de quitosana vazia com relação de volume da solução de quitosana/tpp em ml, de 15:5,5 respectivamente. Figura 2- apresenta a determinação do tamanho de nanopartículas de quitosana vazia com relação de volume da solução de quitosana/tpp em ml, de 15:6,0 respectivamente. Figura 3- apresenta a determinação do tamanho de nanopartículas de quitosana vazia com relação de volume da solução de quitosana/tpp em ml, de 15:6,5 respectivamente. As Fig. 1, 2, 3 mostram as três preparações que melhor apresentaram formação de nanopartículas. Entretanto as preparações com 6,0 e 6,5 ml de TPP apresentaram heterogeneidade no tamanho proporcionando PDI de 0,5. No caso da preparação com 5,5 ml de solução de TPP demonstrou PDI de 0,3, valor próximo do ideal para partículas monodispersas. Na Fig. 4 abaixo, observa-se uma manutenção do tamanho (165 nm) da nanopartícula quando encapsulando FSH. O valor de PDI também foi aproximadamente 0,3 demonstrando um comportamento monodisperso. Figura 4- Avaliação do tamanho de partícula e PDI de NC-FSH de quitosana apresentar a determinação do tamanho de nanopartículas de NC-FSH com relação de volume da solução de quitosana/tpp em ml, de 15:5,5 respectivamente, com FSH previamente dissolvido na solução de TPP Anais do 14º Congresso Brasileiro de Polímeros Águas de Lindóia, SP 22 a 26 de outubro de

4 Caracterização de quitosana por Infravermelho Figura 5- Caracterização de quitosana por infravermelho apresenta o espectro de infravermelho de quitosana de caranguejo (Polymar) seca em estufa por 24 h, em pastilha de Kbr. Figura 6- Caracterização de quitosana purificada por infravermelho apresenta o espectro de infravermelho de quitosana purificada após seca em estufa por 24 h, em pastilha de Kbr O espectro de infravermelho da quitosana demonstrou picos característicos de deformações simétricas e assimétricas de amida I e II em 1654 e 1598 cm -1 respectivamente. A região de 2921 cm -1 seria relacionada os grupamentos de hidrocarbonetos e 1324 cm -1 a grupamentos acetilglucosamina [4]. Outros picos observados que caracterizam a quitosana seriam 3490 cm -1 relacionado ao estiramento OH, 2874 cm -1 referente ao estiramento CH, 1420 e 1380 cm -1 referente deformação simétrica CH 3 [5]. Não foi possível a formação de nanopartículas com a quitosana da polymar sem pré-tratamento, sendo necessário purificar a quitosana. Entretanto, o processo não modificou a estrutura principal da quitosana como observado na Fig. 6, mantendo os picos característicos de sua estrutura (2900 cm -1, Anais do 14º Congresso Brasileiro de Polímeros Águas de Lindóia, SP 22 a 26 de outubro de

5 1650 a 1590 cm -1, 1420 cm -1 e 1320 cm -1 ). As pequenas alterações no infravermelho das diferentes quitosanas podem estar relacionadas a frações excluídas de cadeias com grau de acetilação superior a 60% e de massa molar mais elevada [6]. Determinação da eficiência de encapsulação Vimos que após a incubação as amostras foram lidas em espectrofotômetro de fluorescência em comprimento de onda de 595 nm. De acordo com o método BCA para quantificação de proteína a eficiência de encapsulação foi de 64%. Esse valor pode ser considerado alto, para nanoencapsulação de proteínas por serem macromoléculas [7,11-13). Conclusões Pode-se concluir que o desenvolvimento de nanocápsulas de quitosana por geleificação iônica para incorporação de proteínas foi apropriado, proporcionando uma técnica de preparação de nanocápsulas para proteínas hidrossolúveis. Agradecimentos Agradecemos a Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de iniciação científica e tecnológica. Ao Centro de estudos farmacêuticos e cosméticos (CEFAC/UFC). Referências Bibliográficas 1. J. Santos; S. Campana Polímeros: Ciên. e Tecn. 2003, 13, R. A. HASHAD Int. J. Biol. Macromol. 2016, 86, P. Calvo; C. Remuñán-López; J.L. Vila-Jato; M.J. Alonso J. Appl. Polym. Sci. 1997, 63, F. Abreu; L. Cavalcante; P. Doudement; A. Castro; A. Nascimento Polímeros. 2013, I. Ken; P.Thomas Int. J. Biol. Macromol. 2015, 72, R. Signini; F. Sérgio; P. Campana Polímeros. 1998, 8, DE. Rieux; A. Fievez; V. Garinot; M. Schneider; Y. Préat V. J. Control Release 2006, 116, I. Bano; M. Arshad; M. Afzal; T. Yasin; M. Younus Microbial. Drug. Resist. 2017, 30, M. Saraiva; M. Matos R. Brasil. de Reprod. Ani., 2010, 34, G.S. Santos; G. Garrastazu; E. A. Bender; L. Marques Quím. Nov. 2012, 35, P. Severino; M. Santana; S. M. Malmonge Polímeros: Ciên. e Tecn. 2011, 21, I. S. Tavares, Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, H. M. AL-SAIDI Int. J. Biol. Macromol. 2016, 93, 401. Anais do 14º Congresso Brasileiro de Polímeros Águas de Lindóia, SP 22 a 26 de outubro de