Baixos níveis de IL-5 e IL-10 contribuem para o desenvolvimento da periodontite agressiva

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1 17 Baixos níveis de IL-5 e IL-10 contribuem para o desenvolvimento da periodontite agressiva V Mostra de Pesquisa da Pós- Graduação Letícia Grando Mattuella 1, Léder Leal Xavier 1 (orientador) 1 Faculdade de Biociências, PUCRS, 2 Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Resumo Citocinas derivadas de linfócitos Th1/Th2 desempenham um papel crucial na patogênese de doenças inflamatórias, como as periodontites. O objetivo do presente estudo foi comparar os níveis de citocinas plasmáticas Th1/Th2 (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α e IFNγ) em pacientes com periodontite agressiva (n=19), periodontite crônica (n=19) e controles saudáveis (n=18) através de um ensaio multiplex de citometria de fluxo. Médias e desviospadrão foram calculados e comparados pelos testes estatísticos de ANOVA e Tukey. O teste de correlação de Pearson foi utilizado para verificar a relação entre idade e cada citocina individualmente dentro dos três grupos estudados. Os níveis de IL-5 e IL-10 foram significativamente menores em pacientes com periodontite agressiva (0.28±0.57 e 0.55±0.58, respectivamente) quando comparados aos grupos com periodontite crônica (0.86±0.81 e 1.84±2.12, respectivamente) e indivíduos saudáveis (0.68±0.72 e 1.01±1.41, respectivamente) (p=0.04). Nenhuma relação foi observada entre a idade e os níveis de citocinas quando os três grupos estudados foram analisados. Como, as citocinas IL-5 e IL-10 estão envolvidas na regulação das respostas inflamatórias, sugerimos que os baixos níveis destas moléculas, observados entre os pacientes com periodontite agressiva, contribuem para o desenvolvimento de uma manifestação exacerbada da doença. Introdução As periodontites são doenças inflamatórias crônicas, causadas por um grupo de bactérias, principalmente as gram-negativas, que colonizam a área subgengival e podem levar à destruição dos tecidos que suportam os dentes. Apesar de responsáveis pelo início do

2 18 processo, estes microorganismos são insuficientes para causar a doença, sendo essencial a existência de um hospedeiro suscetível (Offenbacher, 1996). Os processos inflamatórios e imunológicos agem nos tecidos periodontais para proteger contra o ataque microbiano. Entretanto, em alguns indivíduos, essas reações de defesa podem ser prejudiciais porque são passíveis de danificar as células e as estruturas vizinhas do tecido conjuntivo. A severidade e a progressão das periodontites são determinadas por fatores ligados à resposta do hospederio, além da presença e da virulência das bactérias (Page, Kornman, 1997). Segundo a Academia Americana de Periodontia (1999), a periodontite crônica é caracterizada como uma doença de progressão lenta, associada ao acúmulo de biofilme bacteriano, que acomete geralmente indivíduos acima de 30/40 anos de idade. Na periodontite agressiva, há rápida destruição periodontal e ocorre, em sua maior parte, em indivíduos jovens saudáveis sistemicamente. Sabe-se que a periodontite, através da inflamação e da destruição dos tecidos periodontais produz diversos sinais, sintomas e sequelas clínicas que acabam por impactar consideravelmente a qualidade de vida dos indivíduos. O maior impacto é, sem dúvida, a perda dos dentes (Ng, Leung, 2006). Uma observação marcante no estudo de Susin e Albandar (2005) foi que o número de dentes perdidos nos portadores de periodontite agressiva foi duas vezes maior que em controles sem periodontite, pareados por sexo e idade. Esta forma de periodontite tende a apresentar uma agregação familiar e, em alguns casos, a gravidade da doença não demonstra compatibilidade com a quantidade de biofilme bacteriano acumulado, sugerindo uma alta susceptibilidade destes indivíduos à doença. Por esta razão, características biológicas, como o perfil de citocinas, tem sido estudado numa tentativa de melhor compreender o comportamento do sistema imune em pacientes susceptíveis. Citocinas, pequenas proteínas solúveis que conduzem informação de uma célula para outra (Callard, George, Stark, 1999), desempenham papéis essenciais nas respostas imune e inflamatória. Além disso, o resultado de uma infecção pode ser atribuído ao balanço entre tais moléculas. Uma definição funcional para citocinas diferencia entre o tipo-1 e tipo-2. Citocinas tipo-1 (IL-2 e IFN-γ) estão envolvidas na ativação de células T citotóxicas e macrófagos, consequentemente, estimulando a imunidade celular e a inflamação. Citocinas tipo-2 (IL-4, IL-5 e IL-10) estão envolvidas na resposta imune Th2 e promovem a imunidade humoral, atuando como moléculas anti-inflamatórias (Belardelli, Ferrantini, 2002; Queiroz et al., 2008).

3 19 A doença periodontal é uma condição complexa. O domínio de uma resposta do tipo humoral é clara em lesões crônicas, mas especula-se que nos estágios iniciais da doença, reações mediadas por células interfiram na sua progressão (Lappin et al., 2001). A análise do perfil de citocinas nos tecidos periodontais tem sido realizada utilizando diferentes estratégias, como hibridização in situ e imunohistoquímica (Lappin et al., 2001), ELISA (Górska et al., 2003; Havemose-Poulsen et al., 2005), RT-PCR (Garlet et al., 2003; Suárez et al., 2004) e CBA (Queiroz et al., 2008). Além disso, padrões de citocinas têm sido avaliados em pacientes com periodontite agressiva (Suárez et al., 2004, Havemose-Poulsen et al., 2005), crônica (Górska et al., 2003, Queiroz et al., 2008) ou ambas apresentações (Lappin et al., 2001; Garlet et al., 2003). Objetivando contribuir com a caracterização do perfil de citocinas apresentado por pacientes com periodontite e considerando a disponibilidade de inúmeros métodos para esta análise, avaliamos o perfil de citocinas Th1/Th2, no plasma de pacientes com periodontite agressiva e crônica, utilizando a técnica de citometria de fluxo. Metodologia Um total de 56 pacientes foram selecionados no Departamento de Periodontia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Brasil. Suas idades variavam entre 13 e 64 anos. Após exame clínico, os pacientes que preenchiam os critérios de inclusão foram convidados a participar da presente pesquisa, a qual foi submetida e aprovada pelo comitê de ética da UFRGS (Processo número 47/05). Todos os pacientes e indivíduos do grupo controle foram informados sobre o propósito e a metodologia do estudo e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido. Os sujeitos foram classificados nos seguintes grupos: periodontite agressiva (n=19), periodontite crônica (n=19) e sem periodontite (n=18). Os pacientes com periodontite agressiva deveriam apresentar 4 ou mais dentes com perda de inserção 4 mm em indivíduos entre 14 e 19 anos de idade e 5 mm em indivíduos entre 20 e 29 anos de idade (Susin, Albandar 2005). Os pacientes com periodontite crônica deveriam ter idade entre 35 e 60 anos e pelo menos 20 dentes, perda de inserção 4 mm em pelo menos 10 dentes, profundidade de sondagem 6 mm em pelo menos 5 dentes e sangramento periodontal em pelo menos 10 dentes. Os controles saudáveis, por sua vez, deveriam ter pelo menos 20 dentes em boca, índice de sangramento gengival menor que 20%, perda de inserção e/ou profundidade de sondagem em sítios proximais 3 mm (Castro et al., 2003).

4 20 Um questionário foi aplicado para todos os participantes em relação ao seu nível educacional, hábito de tabagismo e saúde geral. Para a presente pesquisa, indivíduos diagnosticados com HIV e/ou diabetes, grávidas ou lactantes e que ingeriram medicação imuno-regulatória nos 6 meses prévios ao estudo, foram excluídos. Amostras de sangue (15 ml) foram obtidas por venipunção de cada paciente, utilizando tubos BD Vacutainer TM (BD Diagnostics, NJ, USA), os quais foram imediatamente centrifugados para isolar o plasma. As amostras de plasma, por sua vez, foram aliquotadas e armazenadas em -20ºC até a manipulação. A concentração das citocinas plasmáticas foi determinada por citometria de fluxo utilizando-se o BD TM Cytometric Bead Array (CBA) Human Th1/Th2 Cytokine Kit (BD Biosciences, San Diego, CA), um ensaio multiplex que mensura quantitativamente analitos solúveis com base em suas diferentes intensidades de fluorescência (Queiroz et al., 2008; Brietzke et al., 2009). O kit CBA utilizado permite a distinção das seguintes citocinas: IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α e IFN-γ. O processamento das amostras e a análise dos dados, adquiridos com um citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Bioscences, San Diego, CA), foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Análise Estatística A unidade de análise foi estabelecida como o indivíduo e o nível de significância em 5%. Os dados distribuídos com normalidade foram apresentados como médias e desviospadrão e comparados com os testes estatísticos de ANOVA e Tukey. O teste de correlação de Pearson foi usado para verificar a relação entre idade e cada citocina dentro dos três grupos estudados. O software Statistica 8.0 foi empregado para analisar os dados. Resultados As características gerais dos sujeitos da presente pesquisa estão apresentadas na Tabela 1. A mensuração de citocinas revelou que os níveis de IL-5 e IL-10 foram estatisticamente menores em pacientes com periodontite agressiva em relação aos com periodontite crônica (p=0,04) (Tabela 2). Quando comparados ao controle, pacientes com periodontite agressiva tiveram níveis menores de todas as citocinas. Uma situação semelhante foi encontrada nos pacientes com periodontite crônica, os quais apresentaram menores valores de IFN-γ quando comparados aos sujeitos saudáveis. Não houve diferença estatística nos níveis de IL-2, IL-5, TNF-α and IFN-γ quando os grupos foram comparados.

5 21 A Tabela 3 descreve a frequência (%) de detecção de cada citocina em particular nas amostras de plasma de todos os grupos estudados. Os níveis detectáveis de uma citocina em particular (concentração igual ou acima do menor valor padrão) foram encontrados em, aproximadamente, metade da amostra em todos os grupos, com exceção para o grupo da periodontite agressiva, o qual apresentou uma menor expressão de IL-5 e IL-10. O modelo do perfil de citocinas demonstrou alta variabilidade individual. A análise de correlação de Pearson não detectou qualquer relação entre idade e citocina quando os três grupos estudados foram analisados. Discussão A literatura sugere um recrutamento diferencial de células T na periodontite agressiva e crônica, resultando em diferentes padrões de produção de citocinas, ou seja, uma tendência para o desenvolvimento de uma resposta predominantemente Th1 na primeira e Th2 na segunda (Garlet et al., 2003). Lappin et al. (2001) comparando pacientes com ambas periodontites, observaram um predominante conjunto de células Th2 no grupo com periodontite agressiva e um maior números de células expressando IL-4 e IL-6 do que IL-2 e IFN-γ. Recentemente, foi sugerido que, na periodontite, a alta variabilidade dos níveis de citocinas e a baixa frequência de sua detecção, pode contribuir para determinar a presença e/ou severidade da doença (Queiroz et al., 2008). Embora, Górska et al. (2003) afirmem que os níveis no soro de citocinas não são bons indicadores da doença periodontal e que tais resultados podem conduzir a conclusões controversas, a ocorrência de um aumento no número de células T no sangue periférico e a presença destas células na gengiva estão estabelecidos durante o processo da doença (Lappin et al., 2001). Além disso, o nível de citocinas no plasma pode representar uma possível distribuição para a circulação de citocinas produzidas localmente nos tecidos inflamados (Havemose-Poulsen et al., 2005). No presente estudo, os níveis de IL-5 e IL-10 foram significativamente menores na periodontite agressiva (0.28±0.57 e 0.55±0.58) quando comparados à periodontite crônica (0.86±0.81 e 1.84±2.12) e aos controles saudáveis (0.68±0.72 e 1.01±1.41) (p=0.04). Estes menores níveis de IL-5 and IL-10, os quais são característicos de uma resposta Th2, observados na periodontite agressiva, poderiam sugerir uma deficiência no controle da resposta imune dirigida contra patógenos, consequentemente, resultando em um quadro de inflamação exacerbada. Apesar desta poder conduzir a um aumento nos níveis de citocinas

6 22 Th1, acreditamos que este processo seja restrito ao tecido periodontal e não possa ser observado sistemicamente. Interessantemente, através da análise do mrna de citocinas, Suárez et al. (2004) observaram a expressão de IL-5 e IL-10 em biópsias de pacientes com gengivite e saudáveis, embora a expressão estava ausente no tecido doente obtido de pacientes com periodontite agressiva, confirmando nossos dados. O potencial de quimioatração de citocinas produzidas por células Th1 poderia favorecer a reabsorção óssea e a progressão da doença. Segundo Garlet et al. (2003), as características de quimioatração de células produtoras de IL-4 e IL-10 poderia controlar o potencial destrutivo da resposta Th1. Como a IL-10 está associada com a supressão da reabsorção óssea (Kawashima and Stashenko, 1999; Sasaki et al., 2000), a baixa expressão em pacientes com periodontite agressiva estaria relacionada com a forma mais severa da doença.

7 23 Tabelas Tabela 1 - Características dos sujeitos do estudo. Grupo periodontal Indivíduos saudáveis Periodontite agressiva Periodontite crônica N Gênero masculino/ 12/6 (66.7/33.3) 16/3 (84.2/15.8) 14/5 (73.7/26.3) feminino (%) Idade (média ± DP) 28.8 (4.36) 35.6 (8.48) 49.4 (9.76) Grupo étnico (%) Caucasiano 18(100) 16 (84.2) 16 (84.2) Não Caucasiano 0 (0.0) 3 (15.8) 3 (15.8) Tabagismo (%) Não fumante 14 (77.8) 11 (57.9) 11 (57.9) Fumante 2 (11.1) 5 (26.3) 1 (5.2) Ex fumante 2 (11.1) 3 (15.8) 7 (36.9)

8 24 Tabela 2 - Concentração de citocinas em pg/ml (medias e desvios-padrão) nos grupos com periodontite agressiva e crônica comparados com os controles saudáveis. Grupo periodontal Indivíduos Periodontite Periodontite saudáveis agressiva crônica Valor de p N IL (±1.34) 1.07 (±0.90) 1.41 (±1.17) 0.65 IL (±1.33) 1.31 (±1.06) 1.62 (±1.44) 0.69 IL (±0.72) 0.28 (±0.57) 0.86 (±0.81) 0.04* IL (±1.40) 0.55 (±0.98) 1.84 (±2.12) 0.04* TNF-α 1.43 (±1.57) 1.18 (±1.18) 1.76 (±1.42) 0.44 IFN-γ 1.84 (±1.47) 1.27 (±1.46) 1.71 (±2.11) 0.57

9 25 Tabela 3 - Frequência (%) de detecção das citocinas, individualmente, nas amostras de plasma dos grupos com periodontite agressiva e crônica comparados com os controles saudáveis. Grupo periodontal Indivíduos saudáveis Periodontite agressiva Periodontite crônica N 18 (100) 19 (100) 19 (100) IL-2 9 (50) 12 (63) 12 (63) IL-4 10 (56) 13 (68) 12 (63) IL-5 10 (56) 4 (21) 11 (58) IL-10 7 (39) 5 (26) 10 (53) TNF-α 10 (56) 9 (47) 13 (68) IFN-γ 13 (72) 10 (53) 10 (53) Todas as citocinas acima do menor 5 (28) 3 (16) 6 (32) valor padrão Todas as citocinas abaixo do menor valor padrão 5 (28) 3 (16) 1 (5)

10 26 Conclusão Nossos resultados sugerem que pacientes com periodontite agressiva têm menores valores de citocinas circulantes IL-5 e IL-10 no plasma quando comparados aos pacientes com periodontite crônica e controles saudáveis. Como IL-5 e IL-10 desempenham papéis importantes na regulação da resposta inflamatória, os baixos níveis de tais citocinas observados na periodontite agressiva podem contribuir para a manifestação exacerbada da doença. Referências American Academy of Periodontology. Consensus Report on the Classification of Periodontal Diseases. Ann Periodontol. Vol. 4, Nº 1 (1999), pp Belardelli, F., Ferrantini, M. Cytokines as a link between innate and adaptative antitumor immunity. Trends Immunol. Vol. 23, Nº 4 (2002), pp Brietzke, E., Stertz, L., Fernandes, B.S., Kauer-Sant'Anna, M., Mascarenhas, M., Vargas, A.E., Chies, J.A., Kapczinski, F. Comparison of cytokine levels in depressed, manic and euthymic patients with bipolar disorder. J Affect Disord. Vol. 116, N º 3 (2009), pp Callard, R., George, A.J.T., Stark, J. Cytokines, chaos, and complexity. Immunity. Vol. 11, Nº 5 (1999), pp Castro, G.D.C., Oppermann, R.V., Haas, A.N., Winter, R., Alchieri, J.C. Association between psychosocial factors and periodontitis: a case-control study. J Clin Periodontol. Vol. 33, Nº 2 (2006), pp Garlet, G.P., Martins, Jr.W., Ferreira, B.R., Milanezi, C.M., Silva, J.S. Patterns of chemokines and chemokine receptors expression in different forms of human periodontal disease. J Periodontal Res. Vol. 38, Nº 2 (2003), pp Górska, R., Gregorek, H., Kowalski, J., Laskus-Perendyk, A., Syczewska, M., Madaliński, K. Relationship between clinical parameters and cytokine profiles in inflamed gingival tissue and serum samples from patients with chronic periodontitis. J Clin Periodontol. Vol. 30, Nº 12 (2003), pp Havemose-Poulsen, A., SØrensen, L.K., Stoltze, K., Bendtzen, K., Holmstrup P. Cytokine profiles in peripheral blood and whole blood cell cultures associated with aggressive periodontitis, juvenile idiopathic arthritis, and rheumatoid arthritis. J Periodontol. Vol. 76, Nº 12 (2005), pp Kawashima, N., Stashenko, P. Expression of bone-resorptive and regulatory cytokines in murine periapical inflammation. Arch Oral Biol. Vol. 44, Nº 1 (1999), pp Lappin, D.F., Macleod, C.P, Kerr, A., Mitchell, T. Kinane, D.F. Anti-inflammatory cytokine IL-10 and T cell cytokine profile in periodontitis granulation tissue. Clin Exp Immunol. Vol. 123, Nº 2 (2001), pp Ng, S.K., Leung, W.K., Oral Health-Related Quality of Life and Periodontal Status. Community Dent Oral Epidemiol. Vol. 34, Nº 2 (2006), pp Offenbacher, S. Periodontal Diseases: Pathogenesis. Ann Periodontol. Vol. 1, Nº 1 (1996), pp Page, R.C., Kornman, K.S. The Pathogenesis of Human Periodontitis: an Introduction. Periodontol Vol. 14 (1997), pp

11 27 Queiroz, A.C., Taba, M., O`Connell, P.A., Nóbrega, P.B., Costa, P.P., Kawata, V.K.S., Trevisan, G.L., Novaes, A.B., Souza, S.L.S., Palioto, D.B., Grisi, M.F.M. Inflammation markers in healthy and periodontitis patients. A preliminary data screening. Braz Dent J. Vol. 19, Nº 1 (2008), pp Sasaki, H., Hou, L., Belani, A., Wang, C., Uchiyama, T., Müller, R., Stashenko, P. IL-10, but not IL-4, suppresses infection-stimulated bone resorption in vivo. J Immunol. Vol. 165, Nº 7 (2000), pp Suárez, L.J., Ocampo, A.M., Dueñas, R.E., Rodríguez, A. Relative proportions of T-cell subpopulations and cytokines that mediate and regulate the adaptive immune response in patients with aggressive periodontitis. J Periodontol. Vol. 75, Nº 9 (2004), pp Susin, C., Albandar, J.M. Aggressive Periodontitis in an Urban Population in Southern Brazil. J Periodontol. Vol. 76, Nº 3 (2005), pp