UTILIZAÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS NO TRATAMENTO E NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS
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1 UTILIZAÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS NO TRATAMENTO E NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS APPLICATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES IN THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF DISEASES GOES, Mirela de Abreu 1 SILVA, Jenifer Mattos da 1 VALENTE-FERREIRA, Rita de Cássia 2 RESUMO Os Anticorpos monoclonais (AcM) são produzidos através de um único clone de linfócito B extraído de um camundongo, e cultivado em meio de cultura juntamente com células de mieloma para formação de diversas colônias produtoras de anticorpos específicos para cada epítopo presente no antígeno. Os AcM são utilizados pela indústria farmacêutica na fabricação de novas tecnologias; como é o caso dos biofármacos, que minimiza danos nas demais células saudáveis e também é utilizado em métodos de diagnósticos como; ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) proporcionando a identificação específica do agente infeccioso ou de anticorpos produzidos pelo paciente através da detecção da formação do complexo antígeno-anticorpo, trazendo-se assim benefícios para os pacientes portadoras de diversas patologias. Palavras-chave: AcM; Linfócito B; Antígeno. ABSTRACT Monoclonal antibodies (MAbs) are produced through a single B lymphocyte clone extracted from a mouse, and grown in culture medium, with myeloma cells to form multiple antibody colonies specific for each epitope present on the antigen. MAbs are used by the pharmaceutical industry in the manufacture of new technologies; as in the case of biopharmaceuticals, which minimizes damage to other healthy cells and is also used in diagnostic methods such as the; ENZIMA LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA), providing the specific identification of the infectious agent or antibodies produced by the patient through the detection of antigen-antibody complex formation, thus bringing benefits to patients with different pathologies. Key words: Monoclonal antibodies; Lymphocytes B; Antigen. 1. Aluno Biomedicina Centro Universitário Toledo 2. Doutora em Ciências Biomédicas- ICB/USP Docente UniToledo
2 1. INTRODUÇÃO O sistema biológico humano é capaz de produzir anticorpos contra um determinado corpo estranho que consegue ultrapassar a barreira de defesa do organismo, esses anticorpos são glicoproteínas produzidas pelos plasmócitos, que são derivados de linfócitos B, e são lançados no plasma, lágrimas, saliva e entre outros. Essas glicoproteínas são capazes de reconhecerem e se ligarem de forma específica ao antígeno, possuindo a função de auxiliar o sistema imune a eliminar os microrganismos invasores e patogênicos através da complexação com o antígeno. Os antígenos são moléculas estranhas ao organismo que fazem com que o sistema imune seja ativado e elabore uma resposta de defesa contra ele, o antígeno possui diferentes epítopos encontrados em sua superfície e cada anticorpo produzido pelos linfócitos B se ligará especificamente a um epítopo antigênico (ABBAS et al., 2015; MALE et al., 2014; SEADI, 1988; LEVIMSON, 2016; PARHAM, 2011). Os anticorpos/imunoglobulinas produzidos nessa situação são denominados de anticorpos policlonais, ou seja, quando o sistema imune reconhece um imunógeno, entrará em contato com todos os epítopos presente desse antígeno e isso ativará vários linfócitos B, que irão produzir diferentes anticorpos que se ligarão de forma especifica a cada epítopo presente no antígeno (MALE et al., 2014; SEADI, 1988; ABBAS et al, 2017; LEVIMSON, 2016; PARHAM, 2011). A molécula do anticorpo é composta por quatro cadeias polipeptídicas divididas em: duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, classificação dada pelo tamanho e peso molecular dessas estruturas. Essas cadeias são ligadas através de pontes dissulfeto e na extremidade dessas cadeias há uma região variável, compartilhada de forma similar pela cadeia leve e pela cadeia pesada da imunoglobulina, que é específica para a ligação ao epítopo do antígeno e formará o complexo antígeno-anticorpo (Figura 1) (MALE et al., 2014; NELSON e COX, 2014; SEADI. 1988; LEVIMSON, 2016; PARHAM, 2011). Figura 1: Reconhecimento do antígeno através da região variável do anticorpo. Fonte: MALE, David et al.. Imunologia. 8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, p. Os pesquisadores MILSTEIN e KOHLER (1975) apresentaram os AcM através da técnica de hibridização somática, que consiste na fusão de esplenócitos que foram imunizados
3 com um antígeno específico que produziram anticorpos contra esse imunógeno, com células de mieloma que possuem a característica de se proliferarem rapidamente. Ao final da fusão entre os esplenócitos imunizados e os mielomas, o resultado gerou as células híbridas (hibridomas), produtoras de anticorpos com a capacidade de replicação rápida e contínua (SANTOS et al., 2006; LETCHWORTCH e APPLETON, 1984; CARVALHO, 2008). A descoberta dos anticorpos monoclonais (AcM) produzidos através de células tumorais levantou à hipótese de que, poderia ser possível produzir esses anticorpos, com uma especificidade desejada, através da imortalização de células secretoras de anticorpo isoladas de um animal imunizado por um antígeno conhecido (LETCHWORTCH e APPLETON, 1984;SANTOS et al., 2006). O método representado na figura 2 demonstra, resumidamente, esse processo: a célula esplênica de camundongo imunizado com antígeno conhecido é incubada com células de mieloma na presença de polietilenoglicol (PEG) fundido a 56 ºC, diluído a 30% em meio nutritivo para cultivo celular criado pelo Roswell Park Memorial Institute (RPMI), sem Soro Fetal Bovino (SFB) e contendo 15% de dimetilsulfóxido (DMSO) que facilita a fusão das membranas. Após a fusão, essas células são colocadas em meio RPMI suplementado com hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) e a linhagem celular é selecionada através de dois fatores: 1. Pela ausência da atividade da hipoxantina-fosforribosiltransferase, pois células HPRT negativas não produzem hipoxantina exógena na produção e purinas e não sobrevivem. 2. Pela ausência da produção ou secreção das imunoglobulinas. No fator 1 quando as células fundidas são expostas a aminopterina são impossibilitadas de utilizarem as vias endógenas das purinas tornando-as totalmente dependentes da HPRT causando morte às células do mieloma, e também acarreta na morte dos esplenócitos, visto que estas células não conseguem crescer indefinidamente. Por sua vez, os híbridos possuem essa capacidade de crescimento, multiplicando e formando colônias rapidamente. No fator 2 as células do hibridoma são clonadas e o sobrenadante formado é analisado para a produção de anticorpos através de diversos testes para verificação da especificidade, então um único clone que contem a especificidade adequada e desejada, será selecionado para ser expandido (LETCHWORTCH e APPLETON, 1984; SANTOS et al., 2006).
4 Figura 2: Figura ilustrativa demonstrando a produção de AcM. Fonte: UM POUCO DE BIOLOGIA. Biotecnologia no diagnóstico e na terapêutica de doenças. Disponível em: Acesso em: 19 jun Cada produto clonado é denominado de AcM e cada clone é específico para um único epítopo encontrado no antígeno que é usado para imunizar o animal (ABBAS et al., 2015; SANTOS et al., 2006; LETCHWORTCH e APPLETON, 1984). Embora o descobrimento do anticorpo monoclonal tiver sido descrito em 1975, o seu uso só conseguiu ter início após a sua associação com a engenharia genética, pois os anticorpos presentes no camundongo (anticorpos murinos) quando entram em contato com o sistema imune do humano, acabam induzindo à produção de anticorpos contra os anticorpos do camundongo, esse processo é denominado de Human Anti-mouse Antibody (HAMA). Através da engenharia genética, esse problema foi resolvido através da produção de anticorpos humano-camundongo híbridos, impedindo-se assim a produção de HAMA (SANTOS et al, 2006; CORDEIRO et al, 2014). Esses anticorpos foram denominados de anticorpos quiméricos, que apresentam uma região variável do anticorpo encontrado no camundongo e a região constante do anticorpo humano, e o anticorpo humanizado apresenta regiões hipervariáveis do anticorpo presente no camundongo e o restante da molécula é derivado do anticorpo humano, tendo como resultado uma molécula que consegue obter uma especificidade para o antígeno de interesse, mesmo contendo uma porção mínima de murina na sua molécula (SANTOS et al., 2006).
5 Com o passar dos anos novas aplicações foram desenvolvidas para os AcM, por exemplo: transportadores de fármacos com base na utilização de AcM, os efeitos indesejáveis em outros tecidos são diminuídos, em contrapartida há um aumento da eficiência o que leva uma diminuição da dose empregada. Outra aplicação dos AcM que trouxe importante contribuição à ciência humana: o desenvolvimento de métodos de diagnósticos mais sensíveis e precisos devidos principalmente à especificidade característica desses anticorpos monoclonais humanizados (SANTOS et al, 2006; LETCHWORTCH e APPLETON, 1984; CORDEIRO et al, 2014). 2. OBJETIVO O objetivo desse trabalho é analisar a importância dos AcM a produção de biofármacos que são medicamentos com ação mais direcionada, efetiva e com menores riscos para os pacientes e no desenvolvimento de testes diagnósticos (ELISA- ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) tornando-os mais sensíveis e precisos. 3. METODOLOGIA O trabalho foi realizado através de pesquisa bibliográfica em revistas, artigos de revisão em bases científicas (PubMed, SCielo, Medlline, Bireme) e livros didáticos que trazem um conjunto de informações que ajudarão a desenvolver o artigo. 4. DISCUSSÃO 4.1 Utilização de AcM no tratamento de doenças A indústria farmacêutica progressivamente busca novos métodos para a produção de medicamentos que sejam mais sensíveis, específicos e que tragam a menor incidência de riscos e efeitos adversos ao paciente e isso de comprova com pesquisas orientadas por BANGHAM que em 1965, publicou a caracterização de vesículas fosfolipídicas que foram denominadas de lipossomas, que tem a função de carregar o fármaco ao alvo especifico, induzindo assim a uma maior especificidade medicamentosa e redução dos danos ao tecido do paciente (BANGHAM, 1965, apud SANTOS e CASTANHO, 2002). Em 1971, Gregory Gregoriadis testou a hipótese de utilizar os lipossomas como um sistema transportador de fármacos (GREGORIADIS, 1971 apud SANTOS e CASTANHO, 2002). O muromonabe CD-3, foi aprovado pela Food and Drug Administraton (FDA) sendo o primeiro AcM murino que se tornou disponível para humanos, tendo a função de anti-rejeição de transplante, e o Rituximabe foi o primeiro AcM quimérico aprovado pelo FDA em 1997
6 sendo usada para o tratamento contra recidivas do câncer de linfomas (CORDEIRO et al, 2014; SANTOS et al., 2006; DEBBIO et al, 2007). O AcM consegue se ligar aos antígenos tumorais de interesse poupando as células normais, apresentando um efeito de menor toxicidade do que a quimioterapia tradicional, além de serem efetivos através de vários procedimentos, por exemplo: bloqueando receptores celulares, bloqueando fatores de crescimento essenciais à célula, induzindo apoptose e recrutando funções das células (DEBBIO et al., 2007). A utilização dos AcM tem sido muito explorada atualmente, com o objetivo de buscar novas alternativas de diagnóstico e tratamento para uma gama de doenças como: diversos tipos de cânceres que são direcionados contra antígenos tumorais de diferentes tecidos e órgãos como Linfomas de Células T, tumores sólidos como câncer colorretal, próstata, câncer de ovário, pulmão e entre outros. Essa nova tecnologia traz como vantagem sua especificidade no reconhecimento de antígenos de células tumorais, sendo assim foi possível a fabricação de biofármacos que utilizam em sua fórmula AcM, que são capazes de agir de forma específica diminuindo possíveis danos as células saudáveis (CORDEIRO et al., 2014). Dentre os AcM empregados na terapia do câncer, existem: a. Becacizumabe: Que consiste em AcM contra o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGR), que consegue inibir o crescimento tumoral. b. Rituximabe: AcM contra o antígeno expresso nas células (CD20), o mesmo consegue interagir com o antígeno causando uma lise da célula leucêmica. c. Omalizumabe: É um AcM humanizado anti-ige, possuindo especificidade em bloquear a liberação de histamina, citocinas e leucotrienos por células mediadoras de inflamação tais como, basófilos e mastócitos (SANTOS, 2006). d. Cetuximabe: que é um AcM que se liga na porção extracelular do receptor EGFR, Essa ligação inibe a fosforilação do EGFR e a consequente cadeia de eventos bioquímicos que resultam em estímulo à proliferação celular (VIEIRA e SENA, 2009). e. O Trastuzumabe é um fármaco que se utiliza AcM para o tratamento do câncer de mama. Esse medicamento possuiu função seletiva, tendo como alvo o domínio extracelular do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). O seu uso aumenta significativamente taxas de resposta e o porcentual de sobrevivência (SÁ et al., 2009). LEVIMSON (2016) descreve em seu trabalho que o tratamento com AcM também está relacionado ao efeito da rejeição de enxertos, por exemplo, o muromonabe é um AcM que age contra muitos antígenos linfocitários (p. ex., CD3) e é utilizado contra timócitos
7 humanos em terapias imunossupressoras. Os AcM anti-cd3, estão relacionados às moléculas CD3 que estão presentes na superfície de linfócitos, e são utilizados no tratamento de rejeição de transplantes. A utilização dos AcM é uma importante ferramenta na área da saúde, sendo aplicados no diagnóstico e tratamento de doenças, buscando assim uma melhora na resposta terapêutica e a qualidade de vida dos pacientes. 4.2 Utilização de AcM no diagnóstico de doenças Os AcMs podem ser utilizados em inúmeros diagnósticos laboratoriais como por exemplo o Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) e também pode ser usado nos testes rápidos que usam meio imunocromatográfico (ex. Beta-HCG, HIV, Dengue, etc.). O método de ELISA é capaz de capturar o antígeno ou anticorpo específico de uma doença. O Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) é um método imunoenzimático desenvolvido em uma placa sensibilizada com o antígeno ou com AcMs específicos com a finalidade de detectar uma determinada infecção. Esse teste pode ser desenvolvido através das seguintes técnicas: ELISA direto, indireto, competitivo e sanduíche (SEADI, 1998). No teste de ELISA sanduíche, a placa é sensibilizada com AcM tendo o objetivo de pesquisar o antígeno de interesse. No kit de ELISA sanduíche (figura 3), o antígeno específico presente no soro do paciente, se ligará ao anticorpo presente na placa formando o complexo Ag-AcM, é feito a lavagem com líquido específico de ELISA e ao lavar a placa todos os antígenos que não foram ligados (antígenos inespecíficos) serão retirados na lavagem. Após essa etapa, será adicionado à placa o AcM específico para o antígeno conjugado à enzima peroxidase, e o mesmo se complexará ao antígeno. A visualização do resultado do teste se dará após a adição do substrato e produção de coloração que deverá ser analisada no comprimento de onda adequado através de leitura no espectrofotômetro (SEADI, 1998). Figura 3: Método imunoenzimático sanduíche (ELISA). Fonte: ELISA. Biomedicina padrão. Disponível em: Acesso em: 20 nov
8 No ELISA indireto (figura 4), ao invés dos anticorpos sensibilizarem a placa, como é demonstrado no ELISA sanduíche, o que a sensibiliza é o antígeno de interesse. Quando o soro a ser testado é adicionado e se possuir anticorpos específicos contra esses antígenos, será formado o complexo antígeno-anticorpo e ao lavar a placa todos os anticorpos que não foram ligados (anticorpos inespecíficos) serão retirados na lavagem, permanecendo somente os anticorpos que estarão ligados ao antígeno pesquisado. Após a lavagem é adicionado os AcMs conjugados à enzima peroxidase que ao se complexarem ao anticorpo primário e entrar em contato com o substrato, esse substrato é convertido e irá produzir uma coloração, que será analisada por espectrofotometria indicando a concentração de anticorpos contra o antígeno de interesse encontrada no soro do paciente (SEADI, 1998). Figura 4: Método Imunoenzimático Indireto (ELISA). Fonte: BIOMEDICINA PADRÃO. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Disponível em: < Acesso em: 16 nov Os AcM possuem importância como reagentes de captura por possuírem maior especificidade, pois eles representam uma única linhagem de anticorpos contra um determinado epítopo de um antígeno e que foi selecionado dentro de uma resposta imune policlonal (WILEY, 1989). 5. CONCLUSÃO Com base aos dados obtidos concluímos que a utilização de AcM está presente em inúmeras técnicas de diagnósticos, dentre as quais o teste ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay) sendo de extrema utilidade no diagnóstico de diferentes patologias, podendo trazer como vantagem, sua sensibilidade, especificidade e reconhecimento de antígenos. Além disso, os AcM devido à sua especificidade puderam, além de ser um importante elemento no diagnóstico de doenças, constituírem-se como aliados no tratamento, pois biofármacos que utilizam em sua fórmula os AcMs são capazes de agirem de
9 forma mais específica, efetiva, diminuindo possíveis danos as células saudáveis e proporcionando resultados mais favoráveis ao paciente. 6. REFERÊNCIAS ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia Celular e Molecular. 8 ed. Rio de Janeiro: Elsevier Editora Ltda, p. ABBAS, A.; LICHTMAN, A. H. H.; PILLAI, S. Imunologia básica: Funções e distúrbios do sistema imunológico. 5 ed. Rio de Janeiro: Elsevier Brasil, p. BANGHAM, A. D.; STANDISH, M. M.; WATKINS, J. C.; J. Mol. Biol. 13 ed, 1965, 238papud SANTOS, N.C.; CASTANHO, M.A. R. B. Liposomes: Has The Magic Bullet Hit The Target. Química Nova, São Paulo, n. 6, nov./dez BIOMEDICINA PADRÃO. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Disponível em: < Acesso em: 16 nov CARVALHO, V. A. de; FRANCO, Maria Elena Pereira; KOVÁKS, Maria Júlia. Temas em psicooncologia. São Paulo: Summs Editorial, 2008, 645 p. CORDEIRO, M. L. da S.; SILVA, N.L. F. da; VAZ, Michelle Rossana Ferreira. ACM: IMPLICAÇÕES TERAPÊUTICAS NO CÂNCER. Revista Saúde e Ciência, Campina Grande, v. 3, n. 3, p , set./dez DEBBIO, Carolina Beltrame del; TONON, Lenita Maria; SECOLI, Silvia Regina. TERAPIA COM ANTICORPOS MONOCLONAIS: uma revisão de literatura. Revista Gaúcha de Enfermagem, v. 28, n. 01, p , GREGORIADIS, G., LEATHWOOD, P. D., RYMAN, B. E.: Enzyme entrapment in liposomes. FEBS Lett., 1971, 14: apud SANTOS, N.C.; CASTANHO, M.A. R. B. Liposomes: Has The Magic Bullet Hit The Target. Química Nova, São Paulo, n. 6, nov./dez ELISA. Biomedicina padrão. Disponível em: < Acesso em: 20 nov LETCHWORTCH; III, G. J.; APPLETON, J. A..Métodos para produção de anticorpos monoclonais. Brasília: Iica, p. LEVIMSON, W. Microbiologia Médica e Imunologia. 13. ed.san Francisco: Amgh Editora Ldta, p.
10 MALE, D; BROSTOFF, J; ROTH, DB; ROITT, IM. Imunologia. 8 ed. Rio de Janeiro: Elsevier Brasil, p. NELSON, David L.; COX, Michael M.. Princípios de bioquímica de lehninger. 6 ed. Porto Alegre: Artmed Editora, p. PARHAM, P. O Sistema Imune. 3 ed. Porto Alegre: AMGH Editora, p. SANTOS, N.C.; CASTANHO, M.A. R. B. Liposomes: Has The Magic Bullet Hit The Target. Química Nova, São Paulo, n. 6, nov./dez SANTOS, R. V. Dos; LIMA, P. M. G. De; NITSCHE, A. Aplicações Terapêuticas dos anticorpos monoclonais. Revista Brasileira de Alergia e Imunopatologia, v. 29, n. 2, p , mai./mar SÁ, M. P. B. O; GOMES, R. A. F; SILVA, N. P. C; SÁ, M. V. B. O; FILHO, I. C.et al. Cardiotoxicidade e quimioterapia. Revista Brasileira de Clínica Médica, Recife, Pernambuco, p , SEADI, C. Princípios Básicos da Imunologia. Canoas: Ulbra, p. UM POUCO DE BIOLOGIA. Biotecnologia no diagnóstico e na terapêutica de doenças. Disponível em: Acesso em: 19 jun VIEIRA, F. M. De A. C.; SENA, V. O.Di. Câncer colorretal metastático: papel atual dos AcM e a individualização de seu uso. ABCD. Arquivos Brasileiros de Cirurgia Digestiva, São Paulo, v. 22, n. 1, jan./mar WILEY, J.; SONS, Elisa and other solidy phase immunoassays: Theoredical and Practical Aspects. New York: D.M Kameny, S.J Challacombe, p.
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