TÍTULO: USO DO MALDI-TOF MS NA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES BACTERIANOS EM COELHOS (ORYCTOLAGUS CUNICULUS) COM DOENÇA RESPIRATÓRIA

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1 TÍTULO: USO DO MALDI-TOF MS NA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES BACTERIANOS EM COELHOS (ORYCTOLAGUS CUNICULUS) COM DOENÇA RESPIRATÓRIA CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: Medicina Veterinária INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP, UNIVERSIDADE ANHEMBI MORUMBI - UAM AUTOR(ES): FERNANDA BORGES BARBOSA, TAMARA MANSO VIDIGAL ORIENTADOR(ES): TEREZINHA KNÖBL

2 1. RESUMO A criação de coelhos (Oryctolagus cuniculus) é uma atividade zootécnica que atende as demandas de pesquisa, alimentação e manutenção como animais exóticos de estimação. A saúde desses animais depende da adoção de manejo adequado e têm como principal desafio o controle de doenças respiratórias. Este trabalho avaliou a presença de bactérias em amostras de suabes nasais de 30 animais, procedentes de uma criação comercial com histórico de doença respiratória, utilizando a técnica de MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization e Time-of-fligth), método para detecção do padrão de massa da proteína. Foram identificadas 16 espécies bacterianas, pertencentes a nove gêneros distintos, com destaques para Pasteurella multocida, Bordetella spp. e Staphylococcus spp., reportados na literatura como importantes patógenos associados à doença respiratória em lagomorfos. Outros agentes oportunistas e potencialmente patogênicos e zoonóticos foram identificados pela técnica de MALDI-TOF, revelando a necessidade de novos estudos. 2. INTRODUÇÃO Os coelhos (Oryctolagus cuniculus) apresentam grande susceptibilidade às doenças respiratórias, como rinite e pneumonias, devido à alta demanda de oxigênio e particularidades anatômicas de conformação e distribuição de vias respiratórias, tais como alta localização da laringe, assimetria pulmonar e cavidade torácica estreita (STAN, 2015). Dentre as causas mais comuns de doença respiratória em coelhos destacam-se as infecções bacterianas causadas por Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica e Staphylococcus aureus (ANDRADE, et al., 2002). O diagnóstico destas enfermidades requer suporte laboratorial especializado, uma vez que alguns destes microrganismos (ex. Bordetella spp. e Pasteurella spp.) apresentam necessidades especiais de cultivo e identificação bioquímica. A identificação destes patógenos pode ser mais eficiente com a adoção de sistemas automatizados, como a espectometria de massa pelo sistema MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization e Time-of-fligth), que analisa o material biológico a partir de uma matriz polimérica e analisador de massa que mede o tempo-de-voo das frações proteicas do agente. A identificação é baseada na comparação do 1

3 espectro de massa do agente com espectros de cepas de referência, através do uso de um software (BIER, et al., 2017). MALDI-TOF MS é um método para detecção do padrão de massa da proteína. Bactérias, cultivadas e controladas e/ou enriquecidas com material biológico, são prétratadas por determinados produtos químicos ou aplicadas direto com a matriz MALDI em uma placa de metal alvo. A placa é introduzida em um espectrômetro de massa MALDI. Proteínas ou fragmentos de proteínas são avaliados por espectrometria de massa (Figura 1). Cada espectro de massa fornece atributos específicos, usados para a identificação do agente. Figura 1. Esquema gráfico da técnica de identificação bacteriana por MALDI-TOF. (KLIEM, et al., 2012; Science Slides Suite, 2007) 2

4 3. OBJETIVOS O objetivo deste trabalho foi identificar os gêneros bacterianos presentes na narina de coelhos com histórico de doença respiratória, utilizando a técnica de MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization). 4. METODOLOGIA Amostras. Foram coletados 30 suabes nasais de animais que apresentavam sinais de doença respiratórias em uma granja de Porangaba, São Paulo. Isolamento bacteriano. As amostras foram cultivadas em ágar sangue de carneiro 5% e ágar MacConkey, incubadas a 37 C por 24 horas em aerobiose e anaerobiose. Após o isolamento as colônias foram ressemeadas em ágar TSA para a extração e identificação por MALDI-TOF (Figura 1). MALDI-TOF. Para extração foi feita suspensão de 1 colônia em eppendorf com 300µL de água MilliQ. Foram então adicionados 900µL de etanol absoluto e centrifugado a rpm por 3 minutos. Após isso o sobrenadante foi desprezado e a amostra ficou em repouso à temperatura ambiente até secar completamente. As proteínas foram extraídas com adição de 35µL de ácido fórmico 70%, homogeneização e adição de 35µL de acetonitrila. Foi feita nova centrifugação, em mesma velocidade, por 3 minutos. O sobrenadante foi então retirado e submetido ao MALDI-TOF (Bruker Daltonik). 5. DESENVOLVIMENTO Para identificação através do método MALDI-TOF MS a proteína bacteriana extraída de acordo com o protocolo de extração por etanol/ácido fórmico. A amostra foi co-cristalizada por matriz ácida, sofrendo então processo de ionização e dessorção, por feixe de laser, capaz de decompor a amostra em íons (MELO, 2014). Esses íons são passam por um campo elétrico e analisados por tempo de voo. Para identificação, analisadas pelo software BioTyper 3.0. A avaliação, a partir dos critérios interpretativos padrão de Bruker levou em conta as seguintes pontuações para aceitação: 2.0 foram aceitas para atribuição de espécies e pontuações entre 1.7 e 2.0 para identificação de gêneros. 3

5 6. RESULTADOS O cultivo bacteriano identificou 46 colônias com morfologias distintas. A identificação por MALDI-TOF revelou a presença de 9 gêneros distintos, com 16 espécies diferentes. Das colônias avaliadas, 11 (39,29%) apresentaram resultados inconclusivos ou com baixa especificidade. Estes dados estão apresentados na Tabela 1. Tabela 1. Resultados do MALDI-TOF para a identificação bacteriana de isolados da narina de coelhos (Oryctolagus cuniculus) com histórico de doença respiratória. Os dados levantados a partir da identificação bacteriana com uso do MALDI-TOF se assemelham aos observados em literatura, destacando a Pasteurella multocida como importante causa de doença respiratória. Dentre as amostras analisadas, 8 (17,39%) foram identificadas como P. multocida. O agente foi o mais prevalente deste estudo, colonizando 28,57% dos animais. Pasteurella multocida é uma bactéria gram negativa de grande importância econômica devido à alta morbidade de animais. Transmitida por via aerógena, através do contato direto ou por meio de fômites, causa rinite ou pneumonia, resultando em espirros e secreção nasal mucopurulenta. Em alguns casos pode se manifestar 4

6 disseminar por via sistêmica, causando abscessos, mastite, orquite, otite, conjuntivite e sepse (CUCCO, et al., 2017; LANGAN, et al., 2000). Pode ser encontrada no trato respiratório superior de animais, sendo melhor isolada em amostras coletadas em orofaringe (LARIVIERE, et al., 1993). Sua virulência está relacionada ao tipo capsular (A, B, D, E e F) e a presença de fatores de virulência, tais como adesinas, toxinas, lipossacarídeos e fatores relacionados à captação de ferro (CARTER, 1952; HARPER, et al., 2006; DZIVA, et al., 2008). Outros agentes respiratórios importantes relacionados à doença respiratória em coelhos foram detectados, incluindo Bordetella hinzii (4,35%), B. bronchiseptica (2,17%) e sete espécies distintas de bactérias pertencentes ao gênero Staphylococcus spp. A identificação também revelou a presença de patógenos oportunistas tais como Enterococcus hirae, Escherichia coli e Corynebacterium efficiens. Alguns dos agentes identificados nunca foram reportados em coelhos, como é o caso da Rothia nasimurium, cuja presença tem sido relacionada a quadros de doença humana em indivíduos imunossuprimidos (RAMANAN, et al., 2014). 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS Os resultados encontrados no presente estudo confirmam a participação das espécies Pasteurella multocida, Bordetella spp. e Staphylococcus spp. em processos de doença respiratória em coelhos. O método de MALDI-TOF permitiu a detecção destes agentes de forma precisa e eficaz, além de apontar a presença de outros patógenos oportunistas, cujo risco sanitário e zoonótico precisa ser melhor investigado. 8. FONTES CONSULTADAS ANDRADE, A., PINTO, S. C. e OLIVEIRA, R. S. Animais de Laboratório: criação e experimentação. Rio de Janeiro. Editora FIOCRUZ, BIER, D.; TUTIJA, J. F.; PASQUATTI, T. N.; OLIVEIRA, T. L.; ARAÚJO, F. R.; VERBISCK, N. V. Identificação por espectrometria de massa MALDI-TOF de 5

7 Salmonella spp. e Escherichia coli isolados de carcaças bovinas. Pesquisa Veterinária Brasileira. pp CARBONNELLE, E.; BERETTI, J.L.; COTTYN, S. et al. Rapid identification of Staphylococci isolated in clinical microbiology laboratories by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. Journal of Clinical Microbiology. pp CARTER, G.R The Type Specific Capsular Antigen of Pasteurella multocida. Canadian Journal of Medical Sciences. Vol. 30, pp CUCCO, L. MASSACCI, F. R., et al Molecular characterization and antimicrobial susceptibility of Pasteurella multocida strains isolated from hosts affected by various diseases in Italy. Veterinaria Italiana. Vol. 53, pp DZIVA, F, et al Diagnostic and typing options for investigating diseases. Veterinary Microbiology. Vol. 128, pp FERREIRA, C. R. Técnicas de Ionização. Maldi - Ionização e Dessorção a Laser Assistida por Matriz. Espectrometria de Massas: Princípios e Aplicações. Disponível em: < Acesso em: 30 de agosto de HARPER, M., BOYCE, J.D. e B., ADLER Pasteurella multocida pathogenesis: 125 years after Pasteur. FEMS Microbiol Lett. pp KLIEM, M; SAUER, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. pp LANGAN, G. P., et al Respiratory diseases of rodents and Rabbits. Respiratory Medicine and Surgery. Vol. 30, pp LARIVIERE, S., et al Comparisons of isolation methods for the recovery of Bordetella. Journal of Clinical Microbiology. Vol. 31, pp MELO, L. F. A utilização da espectrometria de massa maldi-tof na identificação de microrganismos no controle de qualidade farmacêutico. Tese (Especialista em Microbiologia Industrial e Ambiental). Universidade Federal de Minas Gerais- MG

8 RAMANAN, P.; BARRETO, J. N.; OSMON, D. R.; TOSH, P. K. Rothia Bacteremia: a 10-Year Experience at Mayo Clinic, Rochester, Minnesota. Journal of Clinical Microbiology. pp