(Evaluation of different techniques and extenders used in the process of swine semen freezing)

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1 VLIÇÃO DE DIFERENTES TÉCNICS E DILUENTES UTILIZDOS NO PROCESSO DE CONGELÇÃO DO SÊMEN DO VRRÃO (Evaluation of different techniques and extenders used in the process of swine semen freezing) Ricardo TONIOLLI 1* ; Gilson Hélio TONIOLLO 2 ; Paulo Henrique FRNCESCHINI 2 ; Fernanda Maria de lmeida Celestino MORTO 2 1 Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará; 2 Faculdade de Ciências grárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista-Campus de Jaboticabal RESUMO O sêmen de oito reprodutores foi coletado utilizando a técnica da mão enluvada. De cada ejaculado foi retirado 10,2 x10 9 sptz. qualidade do sêmen foi avaliada pela concentração (x10 6 sptz/ml), volume (ml), total de espermatozóides (x10 9 sptz), vigor espermático (0 a 5), porcentagem de células móveis (%), morfologia espermática (%) e integridade de membrana (%). O sêmen foi diluído no BTS e no CP. Utilizou-se o teste de Mann Whitney com um intervalo de confiança de p<0,05. Dois tratamentos: diferentes açúcares e diferentes crioprotetores. Com relação às substâncias testadas, a glicose e o glicerol podem continuar a serem utilizados. Em diferentes aspectos, o diluente CP foi melhor do que o BTS. PLVRS-CHVE: Água de coco, sêmen, suíno, açucares, crioprotetores. BSTRCT The semen of eight swine males was collected, being used the total ejaculated. It was separate from each a total of 10.2 x10 9 sptz. The semen quality was evaluated by the concentration (x10 6 sptz/ ml), volume (ml), total of spermatozoids (x10 9 sptz), spermatic vigour (0 to 5), movable cells (%), spermatic morphology (%) and membrane integrity (%).The semen was diluted in BTS and CP. The Mann Whitney s test was used for the analysis, with a trust interval of p<0.05. Two treatments: different sugars and cryoprotectors. The glucose and glycerol, can continue to be used. In different aspects, the CP extender was better than BTS. KEYWORDS: Cocconut water, sêmen, swine, sugars, cryoprotectors. INTRODUÇÃO Os primeiros trabalhos de congelação do ejaculado do varrão datam da década de 70, entretanto, o uso de tal sêmen em escala mundial representa apenas 1% do total de ejaculados usados em processos de inseminação artificial (Saraiva et al., 2005), estando limitado ao uso em trabalhos de melhoramento visando a difusão de material genético (Scheid & Silveira, 2002). O aspecto produtivo é o grande limitante para o uso do sêmen congelado em granjas comerciais (Romero, 2004). utilização do sêmen sob a forma congelada necessita do desenvolvimento *Endereço para correspondência: Faculdade de Veterinária, UECE, v. Paranjana, 1700, Campus Itaperi, Fortaleza-Ce. toniolli@roadnet.com.br 53

2 de uma nova técnica de congelação, devido a grande sensibilidade do espermatozóide suíno ao choque térmico (ntunes, 2007), tendo sido apontado um futuro promissor para a técnica com o aparecimento de novos equipamentos e tecnologias (Wolders & Tem Napel, 2005). Vários autores trabalharam com a finalidade de desenvolver um novo diluente visando a congelação do sêmen, usando o cálcio (Robertson et al., 1988), o leite desnatado e a gema de ovo (Scobey et al., 1995), em diferentes espécies animais e no homem. Mais recentemente, a água de coco, vem sendo trabalhada visando a conservação do sêmen do gato doméstico (Silva et al., 2007), do cão (Barbosa et al., 2007), do carneiro (Salgueiro et al., 2007), do macacoprego (raújo et al., 2007) e do varrão (Toniolli et al., 2007). O presente trabalho teve como objetivo testar a água de coco em pó e desenvolver uma nova tecnologia de congelação do sêmen do varrão, com a finalidade de se obter maior número de espermatozóides viáveis pós descongelação. MTERIL E MÉTODOS Reprodutores e coleta de sêmen O sêmen de oito reprodutores foi coletado durante doze semanas, empregando a técnica da mão enluvada em recipiente coberto por gaze e protegido por copo térmico (n = 40). Utilizouse o ejaculado total com separação da parte gelatinosa. Em seguida à coleta, o ejaculado foi avaliado pela concentração (x10 6 sptz/ml), volume (ml), total de espermatozóides (x10 9 sptz), vigor espermático (0 a 5) e porcentagem de células móveis (%). De cada ejaculado foi retirado um total de 10,2 x10 9 sptz para cada tratamento do sêmen e testes in vitro. Congelação do sêmen pós a coleta, as amostras de sêmen foram 54 diluídas em partes iguais (1:1) em dois diluentes (Beltsville Thawing Solution = BTS e água de coco em pó + gentamicina á 80 mg/100ml = CP-103 ) à temperatura de 30 o C, permanecendo incubada por 2 horas. pós este período, o sêmen foi colocado a 15 o C por mais 2 horas, centrifugado a 800g por 15 minutos e adicionado do diluente de resfriamento. Em seguida, o sêmen foi colocado a 4 o C por mais 1 hora, ao final da qual foi acrescido do diluente de congelação; em seguida foi envazado em palhetas de 0,5 ml, as quais foram colocadas em rampa de congelação, à 5 cm do vapor de nitrogênio por 4 minutos e em seguida mergulhadas e conservadas em nitrogênio liquido. gema de ovo/glicose (Paquignon, 1984) foi o diluente de resfriamento e de congelação (com glicerol a 4%). concentração final de glicerol foi de 2% (Polge et al., 1970). descongelação foi feita a 37 ºC, em aparelho para esta finalidade, no qual se imergiu cada paillete por 30 segundos; em seguida o conteúdo foi ressuspenso, permanecendo incubado por 10 min à mesma temperatura. Para as análises in vitro, após descongelação, ao volume de cada paillete (0,5 ml) foi adicionado 2 ml do diluente de ressuspensão (BTS ou CP) sendo as análises feitas após a incubação. Tratamentos Substituição da glicose: Foi substituída a glicose do diluente gema de ovo/glicose por outros três tipos de açúcares na mesma concentração (5,67g), formando os seguintes tratamentos: T1 = glicose (controle); T2 = frutose; T3 = lactose e T4 = sacarose. Substituição do Crioprotetor: Foram testados diferentes crioprotetores adicionados ao diluente de congelação (concentração final de 2%), formando diferentes tratamentos: a) T1 = glicerol (GLY - Controle); b) T2 = etilenoglicol (EG); c) T3 = propilenoglicol (PG); d) T4 = óleo mineral (OM).

3 Vigor espermático e porcentagem de células móveis De cada amostra descongelada foi avaliado o vigor espermático (Toniolli, 1996) e a porcentagem de células móveis. O sêmen diluído foi reaquecido a uma temperatura de 37 o C sendo as análises feitas após 10 minutos de incubação, colocando-se uma gota de sêmen de 15 µl entre lâmina e lamínula, com leitura em aumento de 200x. Morfologia e vitalidade espermática O exame morfológico foi divididos em 2 tipos: a) morfologia do acrossoma e vitalidade (% de células vivas); b) nálise geral da célula (cabeça, peça intermediária e flagelo). Foi feito um esfregaço de sêmen, corado pela solução de azul de bromo-fenol, contando-se 200 células/ esfregaço em microscopia óptica com lente de imersão, com aumento de 1000x. solução corante foi formada por: azul de bromo-fenol = 0,1 g; citrato de sódio = 0,4 g; água destilada = 10 ml. Juntou-se uma gota de sêmen com outra de corante sendo homogeinizada. pós 30seg procedeu-se o esfregaço, secado a temperatura ambiente. Os espermatozóides foram classificados em 3 categorias: 1) Vivos / acrossoma intacto; 2) Vivos / acrossoma danificado e 3) Mortos. Os exames foram feitos em microscopia óptica de imersão, à um aumento de 1000x. Integridade da membrana plasmática valiada pela coloração fluorescente em microscopia óptica de campo escuro, utilizando uma mistura de corantes biológicos. No preparo do meio de coloração, adicionou-se 20µl da solução estoque de formaldeído, 20µl da solução estoque de diacetato de carboxi fluoresceína (DIC) e 10µl da solução estoque de iodeto de propídio (IP) para cada mililitro (ml) da solução salina estoque. Um total de 10µl da suspensão de sêmen, contendo 10 x10 6 sptz/ml foi diluída em 40µl de meio de coloração. Uma alíquota de 5µl da suspensão foi colocada entre lâmina e lamínula sob aumento de 1000x com iluminação epifluorescente, com filtros de fluoresceína padrão (luz azul) e rodamina padrão (cor verde), alternadamente para os corantes DC e IP, respectivamente. Foram contadas 200 células por alíquota. s células foram classificados em 3 categorias: 1) I = Membrana íntegra; toda a célula acumula a DIC (fluorescência verde) ao longo de sua cabeça e flagelo2) II = Membrana danificada; acúmulo de IP (fluorescência vermelha) ao longo da célula. nálise estatística O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso com a análise estatística feita pela avaliação das médias e desvios padrões, com aplicação de testes de análise de variância. O teste proposto foi o de Mann Whitney para a comparação entre grupos. análise das diferenças entre médias foi feita por variância multifatorial usando-se o General Linear Models do programa Statistical nalysis System (SS 6.03, 1988), com um intervalo de confiança de 5% (p<0,05). RESULTDOS E DISCUSSÃO Vigor espermático e porcentagem de células móveis Para o tratamento, diferentes açúcares, analisando-se o vigor espermático, no sêmen diluído no CP, os melhores resultados foram encontrados em T1 (2,5) e T2 (2,4), que foram significativamente melhores (p<0,05) que os resultados apresentados nos T3 (1,8) e T4 (1,5). Para a porcentagem de células móveis, resultados semelhantes foram obtidos, sendo significativamente melhores T1 e T2 (p>0,05): T1 (44%); T2 (41%); T3 (21%); T4 (16%) (Figs. 1 e 2). Quando o sêmen foi diluído no BTS, a 55

4 5,0 4,5 B T1 T2 T3 T4 4,0 Valores (%) 3,5 3,0 2,5 2,0 B B B BC C B B B 1,5 1,0 2,5 2,4 1,8 1,5 2,7 2,4 2,2 1,7 2,4 2,6 2,2 2,1 2,5 2,5 2,4 1,9 0,5 0,0 CP BTS CP BTS Diferentes açúcares Diferentes crioprotetores Categoria / Diluente Figura 1: Vigor espermático, do sêmen suíno congelado em diferentes açúcares () e crioprotetores (B), adicionados ao diluente gema de ovo/glicose, após descongelação e ressuspensão nos diluentes CP e BTS. análise do vigor espermático, mostrou a glicose (T1 = 2,7) como o melhor tratamento em relação aos outros (T2 = 2,4; T3 = 2,2; T4 = 1,7) (p>0,05). Para a característica porcentagem de espermatozóides móveis, T1 (44%) e T2 (33%) se equivaleram (p>0,05), mas foram melhores do que T3 (24%) e T4 (15%) (p<0,05) (Figs. 1 e 2). Desta forma, a opção pelo açúcar do diluente de congelação poderá ser decidida entre a glicose e a frutose, exceto quando utilizado o BTS e considerado o vigor espermático, a melhor opção seria a glicose. Os melhores resultados com estes dois açúcares, pode estar apoiado no fato de que eles além de criarem um ambiente hiperosmótico fazendo com que a água contida nos espermatozóides saia para o meio extracelular, prevenindo a formação de cristais de gelo no interior das células, eles também fornecem energia durante o armazenamento, fato este que não acontece com a sacarose e a lactose (Bianchi et al., 2006). resultados apresentados em T1 (2,4) e T3 (2,2). mesma tendência foi encontrada na porcentagem de células móveis, que apresentaram os seguintes valores: T1 (28%); T2 (31%); T3 (21%); T4 (19%) (Figs. 1B e 2B). Quando o sêmen foi diluído no BTS, para o vigor espermático, não houve diferenças significativas entre tratamentos (T1 = 2,5; T2 = 2,5; T3 = 2,4; T4 = 1,9) (p>0,05). Para a característica porcentagem de espermatozóides móveis, os resultados foram semelhantes aos do vigor (T1 = 25%; T2 = 24%; T3 = 22%) (p>0,05), sendo estes três tratamentos melhores que T4 (15,0%) (p<0,05) (Figs. 1B e 2B). Desta forma, quando utilizado o diluente CP a opção pelo crioprotetor do diluente de congelação ficará entre o tradicional glicerol e o etilenoglicol, entretanto, com o BTS, devido a não ter apresentado diferenças significativas entre os tratamentos, a escolha poderá ser do glicerol, que já é usado rotineiramente nos protocolos de Para o tratamento, diferentes congelação do sêmen suíno. parentemente crioprotetores, analisando-se o vigor espermático, para o sêmen diluído no CP, o maior valor médio foi encontrado em T2 (2,6), que, entretanto, não foi significativamente melhor (p>0,05) que os houve uma interação entre o CP e estes dois crioprotetores, o que amplia a possibilidade de utilização deste diluente, e proporciona o uso combinado crioprotetores que, segundo alguns 56

5 B T 1 T2 T3 T4 70 Valores (%) B B B B B BC C B CP BTS CP BT S Diferentes açúcares Diferentes crioprotetores Categoria / Diluente Figura 2: Porcentagem de espermatozóides móveis, do sêmen suíno congelado em diferentes açúcares () e crioprotetores (B), adicionados ao diluente gema de ovo/glicose, após descongelação e ressuspensão nos diluentes CP e BTS. autores, favorecem a obtenção de melhores resultados de motilidade espermática (Medeiros et al., 2002; Bianchi et al., 2006). Morfologia e vitalidade espermática Para o tratamento, diferentes açúcares, analisando-se a morfologia acrossomal com o uso do CP, não houve variação significativa entre tratamentos (p>0,05), nas categorias células vivas com acrossoma intacto e células mortas. Para células vivas com acrossoma danificado, o melhor resultado foi em T1 (glicose). O número médio de células vivas com acrossoma intacto ficou abaixo dos 50% (T1 = 41%; T2 = 39%; T3 = 36% e T4 = 39%), valores estes considerados razoáveis em se tratando de sêmen congelado (Fig. 3). pesar de não ter havido diferenças entre tratamentos sobre a característica em questão, estes resultados demonstraram a eficiência da técnica de congelação utilizada em manter um bom número de espermatozóides vivos com acrossoma intacto após a descongelação do sêmen. Uma mesma tendência foi observada quando se utilizou o diluente BTS, ou seja, não houve influência significativa dos tratamentos sobre as diferentes características da qualidade B T1 T2 T3 T Va lores (%) B B B Vivo Intacto Vivo Danificado Morto Vivo Intacto Vivo Danificado Morto CP BTS Categoria / Diluidor Figura 3: Morfologia acrossomal, do sêmen suíno congelado em diferentes açúcares no diluente gema de ovo/glicose, após descongelação e ressuspensão nos diluentes CP e BTS. 57

6 acrossomal. Entretanto, os valores encontrados referentes ao número de espermatozóides vivos com o acrossoma intacto, foram também inferiores aos 50% e abaixo dos obtidos com o uso do diluente CP, apresentando um percentual de queda entre 18 e 33 pontos (T1 = 32%; T2 = 32%; T3 = 29% e T4 = 26%) (Fig. 3B). Estes resultados sugeriram que tanto o diluente CP quanto o BTS ofereceram uma boa condição de conservação do sêmen durante todo o processo. Por outro lado, para a característica qualidade acrossomal, o tipo de açúcar utilizado no diluente de congelação não influenciou nos resultados finais após descongelação do sêmen. Entretanto, quando comparado os resultados obtidos dentro de cada diluente utilizado (CP e BTS), constatou-se valores maiores da característica espermatozóides vivos com acrossoma intacto quando o sêmen foi diluído no CP. Estes resultados da associação da glicose com o CP são muito importantes, uma vez que a diminuição de mudanças estruturais e funcionais nos espermatozóides durante o processo, associadas a um maior número de células viáveis no trato reprodutivo da fêmea suína, podem permitir maiores índices de fertilidade (Ruvalcaba et al., 2003) de machos selecionados para a congelabilidade do sêmen (Gillan et al., 2005; Wabersky et al., 2005; Smith, 2006; ndrade et al., 2007). nálises de comparação destas diferenças são necessárias a fim de se determinar qual diluente seria mais conveniente para a diluição do ejaculado suíno visando a congelação do sêmen. Para o tratamento, diferentes crioprotetores, analisando-se a morfologia acrossomal com o uso do CP, na categoria células vivas com acrossoma intacto, não houve variação significativa entre os diferentes tratamentos (p>0,05). Para a categoria células vivas com acrossoma danificado, mais uma vez repetiu-se a tendência da característica anterior, com exceção para o T3 que apresentou o menor valor médio (24%). Resultado semelhante também foi visto na categoria espermatozóides mortos, com uma menor porcentagem encontrada em T1 (34%) e T2 (34%). O número médio de células vivas com acrossoma intacto ficou abaixo dos 50% (T1 = 35%; T2 = 36%; T3 = 35% e T4 = 30%), valores estes ainda considerados razoáveis em se tratando de sêmen congelado (Fig. 4). pesar de não ter havido diferenças significativas entre tratamentos, estes resultados demonstram a eficiência da técnica de congelação B T 1 T2 T3 T Valores (%) B B B B B B Vivo Intacto Vivo Danificado Morto Vivo Intacto Vivo Danificado Morto CP Figura 4: Morfologia acrossomal, do sêmen suíno congelado em diferentes crioprotetores adicionados ao diluente gema de ovo/glicose, após descongelação e ressuspensão nos diluentes CP e BTS. 58 BTS Categoria / Diluente

7 utilizada em manter um bom número de espermatozóides vivos com acrossoma intacto após a descongelação do sêmen. Resultados semelhantes foram observados quando se utilizou o diluente BTS, ou seja, não houve influência significativa dos tratamentos, sobre as diferentes características da qualidade acrossomal consideradas neste trabalho. qui, mais uma vez os valores encontrados na categoria células vivas com o acrossoma intacto, foram inferiores a 50% e abaixo dos obtidos com o uso do CP, com um percentual de queda entre 25 e 36 pontos (T1 = 24%; T2 = 27%; T3 = 26% e T4 = 19%) (Fig. 4B). Estes resultados sugeriram que tanto o CP quanto o BTS ofereceram uma boa condição de conservação para os espermatozóides durante o processo. Os resultados também demonstraram que para a qualidade acrossomal, o tipo de crioprotetor utilizado não influenciou nos resultados finais após a descongelação do sêmen, apesar do glicerol ser considerado o melhor crioprotetor para o sêmen suíno (ntunes, 2007). Entretanto, quando comparado os resultados obtidos dentro de cada diluente utilizado (CP e BTS), viu-se valores maiores da categoria células vivas com acrossoma intacto quando o sêmen foi diluído no CP. Uma vez que alguns autores recomendam como melhor, uma concentração do glicerol entre 3 e 4% (Holt et al., 2005; Bianchi et al., 2006), esta possível interação e melhores resultados com o uso do CP, poderiam ser mais evidentes. nálises de comparação destas diferenças são necessárias a fim de se determinar qual diluente seria mais conveniente visando a congelação do sêmen. Integridade da membrana plasmática Para o tratamento, diferentes açúcares, na característica integridade de membrana, a maior porcentagem de membrana intacta foi obtida com o T1 (glicose), independente do diluente utilizado (CP = 35% e BTS = 25%), com diferenças significativas (p<0,05) em relação aos demais tratamentos. Na categoria célula com membrana danificada, mais uma vez T1 apresentou os melhores resultados (Fig. 5), tendo como valores no CP = 65% e no BTS = 76%. pesar da porcentagem de células com membrana intacta ter sido relativamente baixa, ainda os valores apresentados nos resultados acima, são compatíveis com um sêmen descongelado com possibilidade de fertilização. Mais uma vez, os resultados obtidos com o uso do diluente CP 100 T1 T2 T 3 T4 B B B B B B B BC B C B Valores (%) B B B B B B B B B CP BTS CP BTS CP BT S CP BTS M. Íntegra M. Danificada M. Íntegra M. Danificada Diferentes açúcares Diferentes crioprotetores Categoria / Diluente Figura 5 Integridade da membrana espermática, do sêmen suíno congelado em diferentes açúcares () e crioprotetores (B), adicionados ao diluente gema de ovo/glicose, após descongelação e ressuspensão nos diluentes CP e BTS. 59

8 foram melhores do que com o BTS, tornando este diluente uma alternativa comercial na conservação do sêmen do varrão e de outras espécies domésticas (Cardoso, 2005; Silva et al., 2007). Para o tratamento, diferentes crioprotetores, os resultados da integridade de membrana, apresentaram uma maior porcentagem de membranas intactas, com os T1, T2 e T3, independente do diluente utilizado CP (T1 = 19%; T2 = 19%; T3 = 16%) ou BTS (T1 = 5,0%; T2 = 2,0%; T3 = 3,0%), sem diferenças significativas (p>0,05), mas melhores do que T4 (CP: T4 = 7,0% e BTS: T4 = 1,0%). Para a categoria células danificadas, mais uma vez T4 apresentou os piores resultados (Fig. 5B), tendo como valores no diluente CP = 94% e no diluente BTS = 95%. pesar da porcentagem de células com membrana intacta ter sido baixa, fato este que pode ser explicado pela maior sensibilidade espermática suína ao choque pelo frio (Lima et al., 2004) e o térmico (ntunes, 2007), os valores apresentados nos resultados acima, são ainda compatíveis com um sêmen descongelado com possibilidade de fertilização. Mais uma vez nesta etapa do trabalho, os valores encontrados nos resultados obtidos com o uso do CP foram melhores do que os obtidos com o BTS. Esta boa ação do diluente CP na conservação espermática, tem sido demonstrada por diversos autores em diferentes espécies domésticas (Nunes, 1998; Braz et al., 2003; Barbosa et al, 2007). CONCLUSÕES Com relação ao tipo de açúcar, o uso da glicose ou da frutose, poderá proporcionar uma melhor qualidade espermática após descongelação, por outro lado, o uso do óleo vegetal como crioprotetor é desaconselhável, podendo ser utilizado o glicerol para o sêmen do 60 varrão. Em diferentes aspectos analisados, o diluente CP, apresentou-se melhor do que o BTS, sugerindo apresentar uma melhor capacidade de conservação da célula espermática durante o processo de congelação. GRDECIMENTOS Os autores agradecem a ajuda do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro, da Granja Suinícola Estiva por ceder os animais e instalações e da Dra Cristiane Clemente de Mello da Universidade Estadual do Ceará pelo fornecimento da CP-103 â, sem as quais esta pesquisa não poderia ter sido realizada. REFERÊNCIS BIBLIOGRÁFICS NDRDE,.F.C.; RRUD, R.P.; CELEGHINI, E.C.C.; NSCIMENTO, J.; MRTIS, S.M.M.K.; MORETTH,.S. Fluorescent stain method for the simultanous determination of mitochondrial potential and integrity of plasma and acrossomal membranes in boar sperm. Reproduction in Domestic nimals, v.42, p , NTUNES, R.C. vanço tecnológico e aplicabilidade da técnica de congelamento de sêmen suíno. Revista Brasileira de Reprodução nimal, Belo Horizonte, v.31, n.1, p.60-63, RÚJO, L.L.; OLIVEIR, K.G.; LIM, J.S.; PNTOJ, P.S.P.; RÚJO, J.B.; DOMINGUES, S.F.S. Preservação de sêmen de Cebus apella (macaco-prego) em diluidor à base de água de coco a 37 o C. In: XVII Congresso Brasileiro de Reprodução nimal, Curitiba. v.17, p.192, BRBOS, C.C.; LOPES-NETO, B.E.; MDEIR, V.L.H.; LIM,.H.R.; UCHO, D.C.; SILV, L.D.M. Criopreservação de sêmen canino com diluidor à base de água de coco em pó (CP- 106): Efeito da concentração de gema de ovo. In: XVII Congresso Brasileiro de Reprodução nimal, Curitiba. v.17, p.177, BINCHI, I.; KÉRLIN, C.; MDEIR, E.M.;

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