EFEITO DA INCUBAÇÃO E TEMPERATURA DE DILUIÇÃO SOBRE O SÊMEN SUÍNO IN NATURA

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1 EFEITO DA INCUBAÇÃO E TEMPERATURA DE DILUIÇÃO SOBRE O SÊMEN SUÍNO IN NATURA (Effect of the incubation and dilution temperature on the in nature swine semen) Ricardo TONIOLLI 1*, Faviano Ricelli da Costa e MOREIRA 2, Roberta Nogueira CHAVES 1, Fabrício Pessoa AIRES, Jorge Luiz FERREIRA 1 & Michelle Costa e SILVA 1 1 Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de SêmenFaculdade de Veterinária/ /Universidade Estadual do Ceará; 2 Universidade Federal Rural do Semi-Árido RESUMO O presente trabalho buscou avaliar a influência da incubação do sêmen in natura sobre a qualidade espermática do ejaculado utilizado no dia de coleta, diluído e conservado à temperatura final de 17ºC durante 6 horas. Foram utilizados 30 ejaculados, de 5 varrões, divididos em 7 tratamentos: A: sêmen diluído a 35ºC (controle); B: sêmen incubado in natura por 1 hora a 35ºC, diluído; C: sêmen incubado in natura por 2 horas a 35ºC, diluído; D: sêmen incubado in natura por 3 horas a 35ºC, E: sêmen incubado in natura por 1 hora a 25ºC; F: sêmen incubado in natura por 2 horas a 25ºC; G: sêmen incubado in natura por 3 horas a 25ºC. Foram analisadas as características de vigor, motilidade e morfologia, pelos testes de Mann-Whitney e T de Student a 5%. Os resultados obtidos mostraram que o vigor e a motilidade apresentaram um comportamento similar, onde o momento da diluição foi crítico para a qualidade seminal. O tratamento E conseguiu minimizar estes efeitos prejudiciais, apresentando os melhores resultados quando comparados com o controle. Para a morfologia, tanto na diluição, quanto na análise às 6 horas, o tratamento E apresentou os melhores resultados em relação ao controle (p<0,05). Concluiu-se que a incubação do sêmen puro no seu próprio plasma seminal a 25ºC por 1 hora traz efeitos positivos, aumentando a resistência da célula espermática ao choque térmico. PALAVRAS-CHAVE: sêmen, in natura, suíno, incubação, refrigeração, plasma seminal. ABSTRACT This work searched to determine in nature, semen incubation influence on the spermatic quality used on the day of collection and diluted and preserved at 17ºC final temperature. 30 ejaculated from 5 boars were used and divided in 7 treatments: A: semen diluted at 35ºC (control); B: semen incubated for 1 hour at 35ºC; C: semen incubated for 2 hours at 35ºC; D: semen incubated for 3 hours at 35ºC; E: semen incubated for 1 hour at 25ºC; F: semen incubated for 2 hours at 25ºC; G: semen incubated for 3 hours at 25 ºC. The vigour, motility and morphology characteristics were analyzed by the Mann-Whitney test and the T Student test at 5%. The results of vigour and motility showed a similar behavior, and the dilution moment was the critical moment for the seminal quality. Therefore the treatment E managed to minimize these harmful dilution effects, showing the best results compared with control. Not only for the morphology but also the dilution in the analysis at the 6 hours, the treatment E showed the best results comparing to control (p<0.05). In conclusion, *Autor para correspondência: Av. Paranjana, Fortaleza, Ceará toniolli@roadnet.com.br 99

2 incubation of pure semen in its own seminal plasma at 25ºC for 1 hour brings positive effects, increasing the resistance to thermo shock of the sperm cell. KEY WORDS: semen, in natura, swine, incubation, cooling, seminal plasma. INTRODUÇÃO O pleno desenvolvimento da inseminação artificial na espécie suína, a exemplo do que já ocorre em outras espécies animais de exploração econômica, dependem basicamente da solução dos problemas relacionados com a conservação do sêmen (MARIANO et al., 1992). Quando os espermatozóides são diluídos com fluídos seminais provenientes das glândulas acessórias do sistema genital, sua motilidade é mantida por poucas horas (JOHNSON et al., 2000). O significado funcional do plasma seminal é bastante questionado no processo de prenhez, uma vez que se consegue gestação com espermatozóides do epidídimo (HAFEZ & HAFEZ, 2000), originando estudos conflitantes sobre a sua real função nos processos in vitro (MAXWELL & JOHNSON, 1999; BARRIUS et al., 2000). Para BARRIUS et al. (2000), o plasma seminal contém uma variedade de componentes bioquímicos, alguns dos quais de relativa especificidade para a regulação espermática e a sua viabilidade. Segundo METZ et al. (1990) apud BARRIUS et al. (2000), o espermatozóide suíno, através de sua membrana plasmática, absorve uma grande quantidade de proteínas do plasma seminal, o que necessariamente interfere nos processos de pré-fecundação. Durante processos como a criopreservação, a utilização da incubação do sêmen in natura no seu próprio plasma, demonstrou resultados favoráveis (PURSEL et al., 1973b), onde para estes autores, um período de pré-congelação, durante 2 a 7 horas, permite ao espermatozóide (sptz) desenvolver uma resistência ao choque térmico. Estes mesmos autores, em 1975, afirmaram que para a utilização do sêmen congelado, o plasma seminal deve ser retirado a fim de evitar efeitos tóxicos. Há evidências de que a remoção do plasma seminal durante os processos de diluição, incubação, refrigeração e congelação/descongelação alteram a função espermática (MAXWELL & JOHNSON, 1999). O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência da incubação do sêmen in natura sobre a qualidade espermática do ejaculado utilizado no dia de coleta e conservado a temperatura final de 17ºC. MATERIAL E MÉTODOS Local do experimento e animais O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen (LRSTS) da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, entre os meses de março e junho, onde foram utilizados 5 reprodutores pertencentes ao LRSTS, sendo 3 reprodutores puros (Duroc = 2 e Landrace = 1) e 2 híbridos (Dalland). Os animais tinham idade variando entre 1,5 e 2,5 anos, eram mantidos em instalações convencionais para a criação de suínos e em sistema de coleta rotineira de sêmen, uma vez por semana. Coleta de sêmen Os ejaculados foram coletados uma vez por semana, durante 6 semanas, pela técnica da mão enluvada (JOHNSON et al., 2000), em copo coletor com capacidade para 500 ml, previamente aquecido à 37ºC. Foi aproveitado o ejaculado total de cada reprodutor após separação da parte gelatinosa. Após as análises do sêmen in natura, apenas os ejaculados com um mínimo de vigor 3,0 e motilidade 70% (CBRA, 1998), foram aproveitados para o experimento. A concentração espermática foi medida em espectrofotômetro Spermacue (Minitub). Tratamentos experimentais Foram utilizados 30 ejaculados, divididos em sete tratamentos. Retirou-se de cada ejaculado um total de 4,9 x10 9 sptz, em volume variado de acordo com a concentração, onde este total foi diluído com diluidor de Beltsville (BTS 100

3 Minitub do Brasil), perfazendo um volume final de 140 ml (o volume de sêmen utilizado variou de acordo com a concentração de cada macho, respeitando-se a concentração final de 35 x10 6 sptz/ml). O sêmen foi conservado em geladeira a 17ºC por até 6 horas após a diluição, durante este período foram realizadas até três análises no sêmen incubado in natura e quatro análises no sêmen diluído (0h, 1h, 3h e 6h) para o vigor e a motilidade espermática. Para as análises morfológicas (alterações acrossomais) foram utilizados os ejaculados provenientes dos momentos 0 e 6h. O ejaculado de cada macho foi repartido nos 7 tratamentos, tratamento A: sêmen foi diluído a temperatura de 35ºC (controle); tratamento B: o sêmen foi mantido a 35ºC durante 1 hora; tratamento C: o sêmen foi mantido a 35ºC durante 2 horas; tratamento D: sêmen foi mantido a 35ºC durante 3 horas; tratamento E: sêmen foi mantido a 25ºC durante 1 hora; tratamento F: sêmen foi mantido a 25ºC durante 2 horas; tratamento G.: o sêmen foi mantido a 25ºC durante 3 horas. Não houve período de estabilização do sêmen após sua diluição, sendo levado a geladeira a 17ºC. Foram realizadas análises seqüenciais em todos os tratamentos, dos quais foram retiradas amostras seminais, colocadas em banho-maria a 39ºC por 5 minutos para avaliação das características do vigor e da motilidade. Estas análises tiveram por finalidade, a mensuração da sensibilidade dos espermatozóides durante o período de incubação do sêmen até a estocagem das doses em geladeira a 17ºC. Para a avaliação das características de vigor espermático (notas de 0 a 5) e motilidade espermática (valores de 0 a 100% - MARTIN RILLO et al., 1996), o sêmen foi incubado em banho-maria a 39 C e as leituras foram feitas após 5 minutos de incubação. A avaliação morfológica foi realizada para cada tratamento, 5 minutos após a incubação a 39ºC com Beltsville Tawing Solution, uma alíquota de 0,1 ml de sêmen e diluída em 0,1 ml de solução salina 0,9% formolizada (formol a uma concentração de 0,1%) (CBRA, 1998), colocada entre lâmina e lamínula e analisada em microscópio óptico com contraste de fase a um aumento de 1000 vezes. Para avaliação das características espermáticas, foram contadas 200 células por amostra (VALE FILHO, 1980), com análises morfológicas dos principais defeitos de acrossomo segundo classificação feita por PURSEL et al. (1972). Foram eleitos dois momentos por tratamento para se retirar amostras para a análise morfológica: 1) logo após a diluição no BTS; 2) após 6 horas de conservação a 17ºC, para cada tratamento. Cada ejaculado foi diluído (35 ou 25ºC) e conservado a temperatura de 17 C (PURSEL et al., 1973a), sendo mantidos em tubos de ensaio fechados com capacidade para 5mL. A cada momento de análise, foram retirados os tubos de ensaio referentes a cada macho e cada tratamento,sendo estes incubados em banhomaria a 39ºC, por 5 minutos, para as análises. Análise estatística Os testes estatísticos (p<0,05) utilizados foram os de Mann-Whitney para o vigor e motilidade, e o teste T de Student para a morfologia. Tendo sido utilizado o programa estatístico STAT VIEW (1998). RESULTADOS E DISCUSSÃO As primeiras observações foram realizadas dentro de cada tratamento, onde para a característica do vigor, como pode ser observado na Tab. 1, houve diferenças significativas entre a análise do sêmen in natura e do sêmen diluído, em todos os tratamentos (p<0,05), Aparentemente um possível efeito positivo do período de incubação dos diferentes tratamentos sobre a célula espermática foi mascarado pela ação momentânea da diluição do sêmen. Com relação às análises no sêmen diluído e as análises efetuadas na primeira hora pósdiluição, encontrou-se que apenas nos tratamentos A e D, houve diferenças significativas entre estas análises (p<0,05). Até 3 horas após a diluição, pode-se observar o efeito do período de incubação do sêmen in natura, que manteve os valores do vigor espermático melhores e estatisticamente significativos em 101

4 Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno no dia de coleta durante 6 horas de conservação. Tratamentos Puro Diluído 1h 3h 6h A 4,4 aa 3,3 ab 2,7 ac 2,6 ac 2,9 ac B 3,9 ba 3,0 ab 3,1 bb 3,1 bb 2,9 ab C 3,8 bca 2,8 abb 2,9 abb 3,0 bb 2,9 ab D 3,5 ca 2,6 bb 3,2 bc 3,0 bbc 2,8 ab E 4,0 ba 3,1 ab 3,1 bb 3,0 bb 3,0 ab F 4,1 ba 3,1 ab 3,0 abb 3,0 bb 2,8 ab G 3,9 bca 3,0 abbc 3,3 bb 3,0 bbc 2,8 ac Letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre linhas (p<0,05); Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre colunas (p<0,05) todos os tratamentos em relação ao controle (p<0,05). Outra consideração a ser feita, com relação às análises efetuadas entre a 1ª e a 6ª hora, é que somente nos TD e TG houve diferenças significativas (p<0,05), o que significa dizer que nos outros tratamentos a condição de vigor espermático foi melhor para o mesmo entrar na fase seguinte de abaixamento de temperatura visando a conservação.. Quando a comparação foi realizada entre os diferentes tratamentos, percebeu-se que na análise do vigor para o sêmen in natura (Tab. 1), o tratamento A ou controle foi estatisticamente superior aos demais tratamentos. Para a análise no sêmen diluído, o tratamento controle (3,3) foi diferente estatisticamente apenas para o tratamento D (2,6) (p<0,05). Na análise do sêmen à primeira hora da diluição, os tratamentos B (3,1), D (3,2), E (3,1) e G (3,3) foram estatisticamente superiores ao tratamento controle (2,7). Na terceira hora de análise pósdiluição, ocorreu uma intensificação deste comportamento, onde o tratamento controle, foi estatisticamente inferior a todos os tratamentos (p<0,05). Na sexta hora, ocorreu estabilização dos resultados, sem diferenças estatísticas (p> 0,05) em todos os tratamentos. Para a motilidade espermática (Tab. 2), o comportamento de todos os tratamentos ocorre de maneira semelhante ao vigor, isto é, existem diferenças entre a análise do sêmen in natura com o momento da diluição em todos os tratamentos. Entre as análises da diluição com a primeira hora subseqüente, com exceção dos tratamentos A e D, não houve diferenças significativas nos valores de motilidade. Entre a primeira e a sexta hora não houve variação nos percentuais de motilidade, com exceção do tratamento G, onde a análise da primeira hora (69%) foi estatisticamente superior à da sexta hora (63%) (p <0,05). Ainda com relação à motilidade, quando a comparação foi realizada entre os tratamentos, percebeu-se mais uma vez que no momento da análise do sêmen in natura, o tratamento controle apresentou os melhores percentuais (p <0,05). Para o momento da diluição, o tratamento A (69%) diferiu estatisticamente apenas para o tratamento D (53%) (p <0,05). Para a análise na primeira hora pós-diluição, o tratamento controle (60%), desta vez, foi o que apresentou os resultados menos favoráveis, porém apenas para os lotes D (66%), E (65%) e G (69%) houve diferenças significativas (p <0,05). Para a terceira hora de análise, o tratamento controle (57%), bem como o tratamento G (64%), apresentaram os resultados menos favoráveis, diferindo estatisticamente de todos os outros tratamentos (p <0,05). Na sexta hora, não houve diferenças estatísticas entre os tratamentos (p <0,05). A motilidade (93%) para o tratamento controle foi muito similar (92%) à encontrada por ZOU & YANG (2000). Os resultados encontrados neste trabalho, tanto em relação ao vigor, quanto à motilidade, principalmente com relação às quedas dos valores entre o momento do sêmen puro e a diluição, vem mostrar como o efeito diluição influencia na qualidade espermática. Esta situação é evidenciada por outros autores (BAMBA & CRAN, 1988, 102

5 Tabela 2. Motilidade espermática do sêmen suíno no dia de coleta durante 6 horas de conservação a 37ºC. Tratamentos Puro Diluído 1h 3h 6h A 93 aa 69 ab 60 ac 57 ac 62 abc B 84 ba 65 ab 64 abb 65 bb 63 ab C 84 ba 57 abb 63 abb 65 bb 63 ab D 76 ca 53 bb 66 bc 67 bc 63 abc E 85 ba 65 ab 65 bb 66 bb 64 ab F 84 ba 64 ab 63 abb 65 bb 63 ab G 82 bca 62 abbc 69 bb 64 abbc 63 ac Letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre linhas (p<0,05); Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre colunas (p<0,05) TONIOLLI et al., 1996, PEREZ MARCOS et al., 1991, JOHNSON et. al., 2000). A utilização de período de incubação antes de se chegar à temperatura final de conservação (17ºC) deveria ser utilizada de maneira rotineira por todas as centrais de inseminação artificial. Apesar de que, segundo MOREIRA et al. (2001), a incubação do sêmen suíno diluído, durante o dia de coleta, não conseguiu aumentar as características de vigor e motilidade do ejaculado, e foi identificado como ponto crítico para a determinação da qualidade seminal, o momento da diluição. Vários autores (PURSEL et al., 1972; WEITZE et al., 1990; BWANGA, 1991; MAXWELL & JOHNSON, 1999; BARRIUS et al., 2000; RODRIGUEZ- MARTINEZ & ERIKSSON, 2000) teceram considerações sobre a importância e utilização do plasma seminal na qualidade espermática, porém, sempre utilizando o processamento do sêmen para a congelação ou para a refrigeração à temperatura de 5ºC. As variações existentes no comportamento do sêmen durante as seis horas de conservação pós-diluição nos diferentes tratamentos demonstrou que a célula espermática necessita de um período de adaptação a um novo ambiente. Para o percentual de alterações acrossomais encontradas (Tab. 3), dentro de cada tratamento houve uma redução significativa no número de acrossomos normais em quase todos os tratamentos entre o momento da diluição e a análise efetuada 6 horas após C (98 vs. 96,5%), D (98 vs. 96,5%), E (98,5 vs. 97%) e F (98,5 vs. 96,5%). Mais uma vez, evidenciou-se o efeito diluição sobre a qualidade espermática. O comparativo entre os tratamentos mostrou que a incubação, no momento da diluição, de 1 (E) e 2 horas (F) a 25ºC foram estatisticamente superiores ao tratamento controle (A). Na análise realizada 6 horas após, apenas o tratamento E (97%) conservou um maior número de células morfologicamente normais com relação ao tratamento controle (95,5%) e ao tratamento B (95%) (p <0,05). A incubação do sêmen in natura aumenta a resistência da célula espermática devido às características do plasma seminal de estar associado com a susceptibilidade ao choque térmico (BWANGA, 1991), provavelmente devido a ligações às proteínas básicas da membrana da célula espermática (MOORE et al., 1976 apud BWANGA, 1991). Tabela 3. Análise morfológica do espermatozóide suíno no dia de coleta durante 6 horas de conservação a 37ºC. Tratamentos Diluído 6h A 96,0% aa 95,5% aa B 96,0% aa 95,0% aa C 98,0% aba 96,5% abb D 98,0% aba 96,5% abb E 98,5% ba 97,0% bb F 98,5% ba 96,5% abb G 97,5% aba 97,0% aba Letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre linhas (p<0,05); Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre colunas (p<0,05) 103

6 RODRIGUEZ-MARTINEZ& ERIKSSON (2000) citam que uma variedade de proteínas do plasma seminal têm sido identificadas como capazes de influenciar a habilidade fecundante dos espermatozóides e, por conseguinte, serem preditoras de fertilidade. Entre estas proteínas, encontram-se as espermoadesinas, que secretadas pelas vesículas seminais, aderem-se à porção rostral do acrossomo durante a ejaculação e seguem o espermatozóide, tanto in vitro, quanto in vivo. Em geral, o plasma seminal contém proteínas específicas que são capazes de inibir a desestabilização inata da membrana fluida do espermatozóide (OLLERO et al.,1998 apud RODRIGUEZ-MARTINEZ & ERIKSSON, 2000). BAMBA & CRAN (1988) através da integridade acrossomal, mostraram que os ejaculados diluídos às temperaturas de 5, 15 ou 25ºC possuem resultados estatisticamente superiores para aqueles ejaculados diluídos a 39ºC, principalmente no momento da análise pós-descongelação. Já ZOU & YANG (2000) utilizando um processo de incubação do sêmen a 39ºC, teve uma queda para 95,6 % e 89,1% de espermatozóides com acrossomo normal por 1 e 4 horas, respectivamente, utilizando o corante azul de commassie. Os dados deste trabalho foram ligeiramente superiores, mesmo com um tempo de 35ºC por 3 horas (98%). Estas diferenças podem ser devido ao método de avaliação utilizado para se aferir esta percentagem de alterações. ZOU & YANG (2000), também testando métodos de avaliação para se aferir a percentagem de alterações espermáticas, encontraram, através da avaliação pela aglutinina de amendoim um percentual de 68,4 e 54,8% de espermatozóides normais para uma temperatura de 39ºC por um tempo de 1 e 4 horas, respectivamente. De qualquer forma, não se pode esquecer do efeito de diferentes temperaturas sobre o metabolismo espermático, baseando-se no fato de que em temperaturas mais baixas diminuem este metabolismo economizando energia para o espermatozóide poder utilizá-la posteriormente, após a sua colocação no genital feminino. Esta dependência da temperatura e do momento de diluição é sugestiva de uma mudança na permeabilidade da membrana acrossomal, onde em temperaturas mais baixas (25ºC) consegue-se diminuir esta permeabilidade e conseqüentemente preservar um maior numero de células espermáticas morfologicamente normais (BAMBA & CRAN, 1988). O que vem de acordo com os dados do nosso trabalho, onde o TE, que utilizou como temperatura de diluição a de 25ºC, foi o que apresentou as menores percentagens de alterações acrossomais com relação ao tratamento controle (P <0,05). A diluição continua sendo um obstáculo à melhoria da qualidade seminal dentro do processamento do sêmen suíno, o que dificulta a expansão da biotécnica da inseminação artificial em regiões como o nordeste brasileiro. Por outro lado, os resultados aqui apresentados com relação à incubação do sêmen in natura mostram que o efeito positivo do contato prolongado do espermatozóide com seu próprio plasma seminal pode fornecer respostas para se aumentar a qualidade dos ejaculados utilizados no dia de coleta. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAMBA, K.; CRAN, D. G. Further studies on rapid dilution and warming of boar semen. Journal of Reproduction and Fertility, v. 82, p , BARRIUS, B.; PÉREZ-PÉ, R.; GALLEGO, M.; TATO, A.; OSADA, J.; MUINÔ-BLANCO, T.; CEBRIÁN-PÉREZ, J. A. Seminal plasma proteins revert the cold-shock damage on ram sperm membrane, Biology of Reproduction, v. 63, p , BWANGA, C. O. Cryopreservation of boar sperm. Acta Veteterinaria Scandinavia, v. 32, p , COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL. Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal., 2 a ed., Belo Horizonte, HAFEZ, E. S. E.; HAFEZ, B. Reproduction in farm animals. 7 th. ed.philadelphia.lippincott Williams & Wilkins p. JOHNSON, L. A.; WEITZE, K. F.; FISER, P.; MAXWELL, W. M. C. Storage of boar semen. Animal Reproduction Science, v.6 2, p , 104

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