QUALIDADE ESPERMÁTICA DO EJACULADO SUÍNO CONSERVADO A 5 O C NO DILUENTE ACP-103 ASSOCIADO À GEMA DE OVO

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1 Ciência Animal 23(2): 45-57, 2013 QUALIDADE ESPERMÁTICA DO EJACULADO SUÍNO CONSERVADO A 5 O C NO DILUENTE ACP-103 ASSOCIADO À GEMA DE OVO (Spermatic quality of the swine semen conserved at 5 o C In ACP-103 extender associate with egg yolk) TONIOLLI, R. 3 ; BARROS, T.B.¹, TONIOLLI, L.S. 2, GUIMARÃES, D.B. 2, DIAS, A.V. 1 ; CANTANHÊDE, L.F. 3 ; ARAÚJO, L.R.S. 1 ; FILHO, I.B.Q. 3 1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias FAVET/UECE, 2 Bolsista IC-LRSTS - Curso de Ciências Biológicas/UECE; 3 Orientador, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen FAVET/UECE, Av. Paranjana, Campus Itaperi, Fortaleza-Ce, CEP: RESUMO O trabalho objetivou testar a associação de diferentes concentrações de gema de ovo ao diluente água de coco em pó (ACP-103 ) e verificar qual delas mantém por mais tempo a viabilidade espermática à temperatura de 5 C. Assim, 36 ejaculados foram diluídos em ACP-103, acrescido de diferentes concentrações de gema de ovo: 0% (controle), 1%, 3%, 5% e 7%. Diariamente (D0 a D4) foram realizadas análises de vigor e motilidade e nos dias D0, D2 e D4 o sêmen foi avaliado quanto sua vitalidade, morfologia e resistência osmótica. Para a análise estatística foram realizados os testes de Kruskal-Wallis e Dunn's para os dados não paramétricos e para os dados paramétricos foram aplicados o teste de ANOVA e Tukey. Durante o período de conservação houve uma queda dos valores de vigor e motilidade. Observou-se que quanto maior a concentração de gema de ovo adicionada ao diluente melhor a manutenção do vigor e motilidade do espermatozoide. A taxa de sobrevivência foi significativamente maior para os tratamentos que continham gema de ovo adicionada ao diluente, em D0 e D1. Não foi observada diferença significativa entre os tratamentos para as análises de vitalidade, morfologia e integridade de membrana. Assim, conclui-se que as concentrações de 3, 5 e 7% de gema de ovo adicionadas ao diluente ACP-103 foram eficientes na manutenção do vigor e motilidade, por até 48 horas de conservação. Palavras-chave: Incubação, diluente alternativo, água de coco em pó, sêmen suíno. ABSTRACT This study aimed to test different concentrations of egg yolk added to the coconut water powdered extender (ACP-103 ) and see which one stays for longer sperm viability at a temperature of 5 C. For this, thirty-six ejaculated was diluted in ACP-103 extender supplemented with different concentrations of egg yolk: 0% (control), 1%, 3%, 5% and 7%. Daily were analyzed force and motility and on days D0, D2 and D4 the semen sample was evaluated for vitality, morphology and osmotic resistance. For the statistical analysis was performed Kruskal-Wallis test for nonparametric data and Dunn s post test, and for parametric data were used ANOVA and post Tukey test. During the storage period there was a decrease in the values of force and motility. It was observed that the higher the concentration of egg yolk added to the ACP-103 extender best the maintaining of the force and motility of sperm cells. The survival rate was significantly higher for treatments containing egg yolk added to the extender, in D0 and D1. There was no significant difference between treatments for the analysis of vitality, morphology and membrane integrity. Thus, we concluded that the concentrations of 3, 5 and 7% egg yolk added to ACP-103 extender were efficient in maintaining the force and motility. Keywords: Incubation, alternative extender, coconut water powdered, boar semen. *Endereço para correspondência: toniolli@roadnet.com.br 45

2 INTRODUÇÃO A inseminação artificial é uma biotécnica amplamente utilizada em diversas espécies domésticas (Bwanga et al. 1992). A eficácia de tal técnica, como em suínos depende basicamente de se conseguir uma conservação prolongada do sêmen, sem que ocorra a perda da capacidade fecundante. Diversos estudos têm sido feitos com o objetivo de aumentar a duração da sobrevivência espermática no sêmen diluído e conservado sob refrigeração (Toniolli et al., 2001), em virtude do espermatozoide desses animais serem muito sensíveis ao choque térmico e à temperaturas mais baixas (Mies Filho, 1987). Dessa forma a temperatura utilizada para a manutenção das doses inseminantes situa-se entre 15 e 18 C (Scheid, 2003), apesar de ser um intervalo que não reduz totalmente o metabolismo espermático e ainda permite a multiplicação de bactérias que são prejudiciais à manutenção da qualidade do sêmen. Isso ocorre em virtude da competição por nutrientes disponíveis no diluente e produção de produtos tóxicos resultantes de seu metabolismo (Weitze, 1991). Embora o sêmen suíno seja sensível a oscilações de temperatura, a possibilidade de sua conservação a 5 C pode proporcionar uma expansão ainda maior da técnica da inseminação artificial, principalmente em regiões onde predominam temperaturas elevadas durante todo o ano. Além disso, essa temperatura mais baixa apresenta como vantagens a possibilidade de utilização de refrigeradores comuns, que facilita uma maior disseminação do uso da técnica, em virtude da redução de custos, uma vez que as máquinas de congelação de sêmen com temperatura controlada, tem um custo de aquisição mais elevado (Corrêa et al., 2001). Um dos pontos críticos da conservação seminal é o uso do diluente adequado. Em busca de novos diluentes a água de coco foi testada em diferentes formas: in natura (ACN) constituída por 50% de água de coco filtrada + 25% de água destilada + 25% de uma solução de citrato de sódio a 5% (Salles, 1989); estabilizada (ACE) esterilizada, envazada, e passada por um processo de ultrafiltração através de uma membrana microporosa e mantida (Salles, 1989) sob refrigeração; liofilizada (ACL), processo de desidratação, onde o produto é congelado e a água é retirada por sublimação; em gel (ACG) e em pó (ACP), obtida através da técnica de spray dry, método de produzir um pó seco a partir de um líquido através da rápida secagem, com um gás quente. Para a espécie suína a água de coco como diluente de sêmen tem sido utilizada com freqüência na região Nordeste do Brasil e os resultados mostram efeitos benéficos, evidenciados in vitro sobre as características de motilidade espermática, e in vivo sobre os parâmetros de fertilidade (Toniolli et al., 1998). Em algumas espécies, tais como caninos e bovinos, alguns diluentes para realizar a conservação do sêmen também são acrescidos de gema de ovo. Contudo, cuidados higiênicos de manipulação devem ser tomados, pois a gema de ovo é um bom meio de cultura microbiano, o que aumenta os riscos à saúde do animal e pode acarretar a chance de uma contaminação uterina (Bencharif et al., 2013). Assim, em virtude da necessidade de desenvolvimento de técnicas e soluções que permitam a utilização do sêmen resfriado a uma temperatura mais baixa sem queda significativa de sua qualidade, este trabalho objetivou testar a eficiência do acréscimo da gema de ovo ao diluente ACP-103, em diferentes concentrações, mantidos à temperatura de 5 C, sobre a conservação 46

3 da célula espermática de ejaculados de suínos. MATERIAL E MÉTODOS ANIMAIS E COLETA DE SÊMEN Para o experimento foram utilizados animais com idade variando entre 12 e 24 meses, em sistema rotineiro de coleta provenientes da Granja Regina, município de Maranguape, Ceará e do Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará. O sêmen de 9 varrões foi coletado (Hancock e Hovell, 1959) uma vez por semana durante 8 semanas (n = 72). Antes de cada coleta, foi realizada uma higienização do prepúcio com água clorada e sabão neutro, seguida de esgotamento prepucial por pressão manual no sentido caudo-craneal e secagem da região com papel toalha descartável. Para a coleta do sêmen foi empregada a técnica da mão enluvada, com o reprodutor saltando em um manequim de coleta. Visando as análises, foi utilizado o ejaculado total, tendo sido separada por uma camada de gase sobre o copo de coleta, a porção gelatinosa do ejaculado. O sêmen coletado em um recipiente plástico (600 ml) e protegido por copo térmico, ambos aquecidos a 37 C. Após a coleta, o ejaculado foi levado ao laboratório para as análises descritas abaixo. Trabalho aprovado pelo Comitê de Ética da UECE, segundo processo no / 63 de 28/01/2011. AVALIAÇÃO DO EJACULADO (SÊMEN IN NATURA) Em seguida à coleta, o ejaculado foi avaliado quanto à concentração (x10 6 sptz/ml em espermiofotômetro), volume (ml em balança digital), o total de espermatozoides (x10 9 sptz, sendo multiplicação entre volume e concentração). Para o exame do vigor espermático (0 a 5 - Toniolli, 1996) e do total de espermatozoides móveis (%) (Martin Rillo, 1996), uma amostra do sêmen (15µL) foi colocada entre lâmina e lamínula e levada ao microscópio óptico em um aumento de 200 vezes. Foram utilizados para o experimento os ejaculados que apresentavam valores 80 % de espermatozoides móveis e 3,5 para o vigor espermático. DILUIÇÃO DO SÊMEN E TRATAMENTOS EXPERIMENTAIS De cada ejaculado foi retirado um total de 8 x10 9 sptz incubados inicialmente a 30 o C por 30 min. (antes da diluição), sendo divididos igualmente entre os diferentes tratamentos à uma concentração fixa de 35 x10 6 sptz/ml (a taxa de diluição variou de acordo com a concentração do ejaculado). O volume final para cada tratamento (25 ml = sêmen + diluente) foi aliquotado em tubos de ensaio, num total de 5 tubos com capacidade de 5 ml (1 tubo/tratamento/dia de análise). De acordo com a concentração de cada ejaculado, volumes diferentes de diluente foram utilizados a fim de completar o volume final de cada tratamento (175 x10 6 sptz/tubo). A diluição do ejaculado foi feita a 30 o C, acrescentando-se o diluente ao sêmen in natura, que em seguida foi mantido incubado a 17 o C por 1 hora, depois passado a outra geladeira a 10 C por mais uma hora e finalmente conservado 5 o C durante 5 dias (dia da coleta = D0 e o último dia = D4). A cada dia de conservação foi retirado um tubo de ensaio de cada ejaculado em cada tratamento, para ser reaquecido em banho maria a 37 C por 10 min. e posterior análises. O diluente utilizado foi a água de coco em pó (ACP-103 ), oriunda da desidratação da água de coco in natura, pela técnica do spray dry (Salgueiro et al., 47

4 2002), sendo reconstituída com água destilada nas seguintes proporções: 24g de ACP mL de água destilada + sulfato de gentamicina a 80mg/100mL. Formaram-se cinco tratamentos de acordo com a concentração de gema de ovo (adquirida no comércio local) associada ao diluente: T1 = ACP-103 (controle); T2 = ACP % gema de ovo; T3 = ACP % gema de ovo; T4 = ACP % gema de ovo; T5 = ACP % gema de ovo. CONSERVAÇÃO E AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA PÓS DILUIÇÃO Em todos os dias de conservação (D0-após três horas da coleta, D1, D2, D3 e D4) (Pursel et al., 1973), foram avaliadas as seguintes características: vigor espermático (0 a 5 - Toniolli 1996); total de espermatozoides móveis (0 a 100%); integridade acrossômica (%), vitalidade espermática (%) e teste hiposmótico (%). Do sêmen diluído e conservado durante 4 dias, alíquotas foram incubadas diariamente em banho maria a 37 C durante 10 minutos e analisadas através de microscópio óptico. ANÁLISES DE VIGOR E MOTILIDADE Para as análises de vigor e motilidade, após aquecimento a 37 C por 10 min., foi retirada uma alíquota de 10µL, colocada entre lâmina e lamínula e levadao ao microscópio óptico em um aumento de 200x. Os critérios utilizados para a análise de vigor espermático, foram os de Toniolli (1996). Já para a motilidade foi feito uma estimativa da porcentagem de células móveis presente em um campo de microscópio em relação ao total de células deste mesmo campo. AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA Os exames morfológicos foram realizados nos dias D0, D2 e D4. As análises foram divididas em: a) Integridade acrossomal (total espermatozoides com acrossomas intactos - Bortolozzo et al., 2005) e b) Vitalidade (total de espermatozoides vivos Medeiros et al., 2006). Para se proceder este exame, foram feitos esfregaços de sêmen corados pela solução de azul de bromofenol. A solução corante foi formada por: azul de bromofenol = 0,1 g; citrato de sódio = 0,4 g; água destilada = 10 ml; medidas a osmolaridade da solução e se necessário ajustada com água destilada até ficar entre 300 e 310 mosm. Para se preparar o esfregaço misturou-se uma gota de sêmen com outra de corante, a solução foi homogeinizada e após 30 segundos retirou-se uma gota (20 µl) desta mistura para confecção da lâmina que foi seca a temperatura ambiente antes da análise morfológica. O sêmen e o corante foram mantidos a mesma temperatura (37 o C). Foram contadas 200 células por amostra, através de microscopia óptica com lente de imersão (óleo de imersão), a um aumento de 1000x. TESTE HIPOSMÓTICO O teste hiposmótico também foi realizado nos dias D0, D2 e D4, e permitiu a avaliação da qualidade da membrana do espermatozoide, por meio de uma prova de resistência ao choque osmótico. A técnica consistiu da adição de 1 ml de sêmen diluído em 15 ml de água destilada e mantidos por 15 min. em banho-maria a 37 C (solução A). Após o período de incubação, em 1 ml da solução A foi adicionado 0,5 ml de formol salino a 1% (solução B). Dessa nova solução (B) foi retirado uma alíquota de 15µL, colocado entre lâmina e lamínula e em seguida levado ao microscópio óptico com um aumento de 400x, sendo contados um total de 200 células (Graham e Mocé, 2005). O espermatozoide com a cauda reta foi indicativo de ruptura de membrana, os que 48

5 permanecerem com membrana íntegra apresentam cauda enrolada. O sêmen com melhor qualidade espermática, deve ter no mínimo 50% de espermatozoides com cauda enrolada (Baril et al., 1993). ANÁLISE ESTATÍSTICA O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso. Os dados foram expressos em média ± desvio-padrão, em que os dados paramétricos foram submetidos a ANOVA seguida pelo teste de Tukey e os dados não-paramétricos foi realizado o teste de Kruska-Wallis e pós teste de Dunn s. As análises foram realizadas através do programa Graphpad prisma 5.0. Foi utilizado um índice de significância estatística de 5% (p<0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO SÊMEN IN NATURA O sêmen in natura dos 36 ejaculados analisados no experimento (ejaculado total), apresentou aspecto normal, coloração branco leitosa, volume médio de 249,4 ml e concentração média de 340,4 x10 9 sptz/ml. Tais características estão dentro da normalidade para a espécie suína (Corrêa et al.,2001). O sêmen de todos os ejaculados in natura, apresentou uma motilidade média de 90%±6,3 e vigor espermático médio de 4,0±0,6, encontrando-se desta forma dentro dos padrões mínimos estipulados pela metodologia para serem utilizados no experimento (CBRA, 2013). SÊMEN PÓS DILUIÇÃO: VIGOR ESPERMÁTICO Durante o período de conservação do sêmen, foram vistos valores decrescentes do vigor espermático em todos os tratamentos, uma vez que o sêmen diluído apresenta um período viável relativamente curto, pois gradativamente os espermatozoides consomem os nutrientes disponíveis no diluente, além de produzirem produtos tóxicos resultantes de seu metabolismo (Corrêa et al., 2001). As análises do vigor e da motilidade espermática, revelaram que a associação da baixa temperatura (5 C) com altas concentrações de gema de ovo adicionada ao meio diluente, proporcionou uma melhor manutenção da qualidade espermática. Este resultado de melhor qualidade espermática, foi verificado até o terceiro dia de conservação do sêmen (D2), nos tratamentos utilizando as três maiores concentrações de gema de ovo (3, 5 e 7%). As concentrações de 1, 3 e 5% de gema de ovo não diferiram entre si em todos os dias de análise (Tabela 1), o mesmo acontecendo entre as concentrações de 3, 5 e 7%. O tratamento controle apresentou os menores valores médios de vigor durante todo o período de conservação, se equivalendo apenas ao T1 (p>0,05) à partir de D1. A partir do quarto dia de conservação (D3), não houve mais diferenças significativas entre todos os tratamentos (p>0,05). A evidência de uma ação protetora externa da gema de ovo, dependendo da espécie animal, parece não estar vinculada à sua concentração no meio diluente, uma vez que em caninos, tratamentos variando de 0 a 20% de gema de ovo no diluente, não apresentaram diferenças significativas entre resultados da característica vigor espermático (Cardoso et al., 2010). Entretanto, este fato não se repetiu resultados deste trabalho, quando as diferenças entre as concentrações da gema de ovo no diluente foram grandes (T4 x T1), colocando em evidência que dependendo da espécie animal em estudo, a concentração da gema de ovo utilizada é importante e apresenta diferenças significativas (p<0,05) entre os resultados. De qualquer maneira, é importante salientar, que de forma bastante evidente, o aumento da concentração da gema de ovo 49

6 no meio diluente, proporcionou um aumento progressivo dos valores médios do vigor espermático, durante todo o período de conservação, à exceção do último dia (D4), fato este que merece ser mais detalhadamente estudado, principalmente quando se trabalha com temperaturas de resfriamento inferiores a 17 C, que é a temperatura mais indicada para a conservação do sêmen do varrão. Por outro lado, considerando a possibilidade de se utilizar tal sêmen refrigerado a 5 C, em programas de inseminação artificial, os tratamentos T1, T2, T3 e T4 conseguiram manter as melhores condições para sua possível utilização apenas em D0. Desta forma se o objetivo for utilizar o sêmen refrigerado sem conservação (coleta, diluição e em seguida inseminação), a presença da gema de ovo no meio diluente poderia proporcionar melhores resultados. Nos demais dias os valores do vigor não foram altos o suficiente para permitir sua utilização com maiores chances de bons resultados de fertilidade. O pequeno tempo de conservação, no qual foi possível manter os melhores valores de vigor das amostras observado nesse trabalho, pode ter sido devido a alterações de ph e osmolaridade do meio. Apesar disso não ter sido analisado neste trabalho, esta possibilidade encontra suporte em trabalhos de outros pesquisadores que detectaram diferenças no ph do meio diluente acrescido de gema de ovo (5 a 20%) após o segundo dia de conservação do sêmen, com valores do vigor espermático significativamente inferiores ao tratamento controle (Cardoso et al., 2010). A acidificação do meio pode trazer efeitos deletérios à célula espermática. Com o objetivo de minimizar tais danos, pesquisadores realizaram a troca do meio diluente durante o período de conservação e observaram uma reativação da motilidade após a sua queda inicial (Verstegen et al., 2005). Além disso, devese salientar que o efeito deletério das baixas temperaturas sobre a célula espermática, provavelmente não poderá ser totalmente eliminado com as concentrações de gema de ovo utilizadas nesse trabalho, o que sugere a necessidade de se testar futuramente outras concentrações. SÊMEN PÓS DILUIÇÃO: MOTILIDADE ESPERMÁTICA Os resultados de motilidade espermática apresentaram uma mesma tendência encontrada para a característica vigor. A porcentagem de células móveis foi significativamente maior (p<0,05) até o segundo dia de conservação do sêmen (D1), nos tratamentos que continham gema de ovo adicionada ao diluente, em relação ao tratamento controle. Essa diferença deixou de ser observada a partir do terceiro dia de análise (D2), como é mostrado na tabela 2. Mais uma vez os maiores valores médios foram encontrados com o uso 7% de gema de ovo, até o quarto dia de conservação do sêmen (D3). Essa ação protetora da gema de ovo sobre a motilidade espermática também já foi observada por outros autores na conservação do sêmen de cervos à mesma temperatura de conservação do sêmen do varrão (Fernández-Santos et al., 2006). Além disso, a redução da motilidade observada em ambos trabalhos, deveu-se também a sensibilidade espermática à redução de temperatura, o que levou a uma progressiva queda da motilidade, em ejaculados submetidos ao processo de refrigeração. Essa característica do sêmen de algumas espécies animais, de forma geral pode ser atribuída à sensibilidade térmica da bomba de sódio potássio- ATPase e subsequente dispersão dos íons, o que acarretaria a entrada de água em excesso, prejudicando dessa forma a motilidade espermática (Ponglowhapan et al., 2004). 50

7 A incubação prévia do sêmen diluído nas temperaturas de 17 e 10 C não proporcionou uma maior porcentagem de células móveis, uma vez que a manutenção desses valores em T1 a T4 foi devido a presença da gema de ovo, que apresentou uma ação protetora já relatada por outros autores em trabalhos de refrigeração (Fernández-Santos et al., 2006) e de criopreservação (Alkmin et al., 2011). Existe ainda uma certa variação de resultados que precisa ser melhor elucidada, um vez que, a conservação do sêmen do varrão a essa mesma temperatura, já apresentou valores superiores a 60% de motilidade por até 72 horas, utilizando o diluente Beltsville Tawing Solution sem qualquer adição de substância protetora (Katzer et al., 2001). Esses resultados podem ser em virtude das diferenças do ACP em relação ao BTS, relacionadas à ação e composição desses meios diluentes, colocando em evidência a pequena proteção do BTS à célula espermática em temperaturas mais baixas, por períodos de tempo mais prolongados. A ação protetora contra os efeitos deletérios da baixa temperatura, proporcionada pela gema de ovo adicionada ao ACP, dependendo da espécie animal na qual o sêmen será conservado, pode não acontecer. Em um trabalho com sêmen canino, conseguiu-se uma conservação por até 72 horas após a diluição (Fontenele et al., 2002), entretanto, neste trabalho, o sêmen suíno em condições semelhantes só se manteve viável para sua utilização em inseminação por 24 horas após a diluição. Este fato demonstrou mais uma vez a sensibilidade da célula espermática na espécie suína às baixas temperaturas associada à escolha do meio diluente para o sêmen. SÊMEN PÓS DILUIÇÃO: VITALIDADE ESPERMÁTICA E INTEGRIDADE ACROSSOMAL Não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos nos resultados das análises de vitalidade e integridade acrossomal (tabelas 3 e 4, respectivamente), mas sim, uma redução na porcentagem de espermatozoides vivos com o decorrer do tempo de conservação. A queda na porcentagem de espermatozoides vivos também foi observada por Matos et al. (2009) ao testar diferentes taxas de diluição do sêmen do cachaço durante o mesmo período de armazenamento (5 dias). Essa redução no número de células vivas pode ser explicada pelo fato de que apesar do espermatozoide apresentar um menor nível metabólico, causado pela baixa temperatura de conservação, ainda acontece consumo de nutrientes do meio e produção de secreções que acabam por alterar a composição química desses diluentes, como ph e osmolalidade. Desta forma com o passar do tempo e o acúmulo desses produtos metabólicos, associados à diminuição da qualidade celular, a viabilidade espermática também pode diminuir. A manutenção da porcentagem de células com acrossoma íntegro pode ser explicada pelo fato de que os diluentes não devem alterar as características particulares de cada sêmen. Além disso, a integridade do acrossoma é indispensável para o processo de fertilização, pois são necessários vários espermatozoides íntegros para garantir uma prenhez (Chan et al., 1996). Contudo, essa análise isolada não assegura bons resultados de fertilidade, já que ao observar as tabelas 1 e 2 verifica-se que os dados de vigor e motilidade são reduzidos drasticamente em D4, ou seja, mesmo apresentando células com acrossoma íntegro, nesse dia já não é possível observar resultados de vigor e 51

8 motilidade, que são características fundamentais para promover a fertilização. Entende-se então, que esta mudança de qualidade do meio durante a conservação do sêmen, foi suficiente para provocar a queda de algumas das caraterísticas seminais, mas não teve influência negativa sobre a integridade acrossomal. Possivelmente um melhor sistema tampão, acrescentado ao diluente ACP, poderia ter impedido uma queda tão drástica dessas características em D4. Este fato precisa ser melhor estudado. SÊMEN PÓS DILUIÇÃO: RESISTÊNCIA HOSMÓTICA O teste hiposmótico avalia a integridade funcional da membrana espermática (Spittaler & Tyler, 1985), sendo ela uma característica importante para o metabolismo espermático. Essa análise consiste em um teste de endosmose que determina as mudanças na membrana espermática, em que o transporte através dessa estrutura é um processo bioquímico importante para a viabilidade espermática e para a capacidade fertilizante (Jeyendran et al., 1984). Neste trabalho, não foram observadas diferenças entre os grupos testados durante o período de refrigeração (tabela 5), ficando basicamente todos os resultados abaixo dos parâmetros considerados bons para utilização do sêmen em programas de inseminação artificial (>50% de cauda enrolada - Baril et al., 1993). Os resultados de espermatozoides com cauda enrolada, podem ser explicados possivelmente devido ao fato de que a porcentagem de gema de ovo adicionada ao diluente não foi suficiente para promover uma proteção eficiente das células contra os efeitos deletérios da baixa temperatura. Fato contrário foi observado por Fernández- Santos et al. (2006), onde ao testarem concentrações entre 0, 5 e 20% de gema de ovo em diluentes comerciais para o sêmen de cervos, observaram que a integridade da membrana aumentou quando a gema de ovo estava presente no meio na mesma temperatura de conservação (5 C). Tabela 1: Vigor espermático do sêmen suíno conservado em ACP-103 a 5 C durante 5 dias, adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo. Tratamentos Dias de conservação D0 D1 D2 D3 D4 T0 0,9±0,9 a 0,3±0,5 a 0,1±0,3 a 0,0±0,2 a 0,0 T1 2,0±0,7 b 1,0±0,9 ab 0,4±0,7 ab 0,1±0,5 a 0,0 T2 2,6±0,9 bc 1,6±0,9 bc 0,8±1,0 b 0,2±0,5 a 0,0 T3 2,6±0,9 bc 1,6±0,9 bc 1,1±1,0 b 0,2±0,5 a 0,0 T4 2,8±0,8 c 1,8±1,0 c 1,2±1,2 b 0,3±1,0 a 0,0 a, b, c, letras diferentes entre linhas indicam diferenças significativas (p<0,05). 52

9 Tabela 2: Porcentagem de espermatozoides móveis (motilidade) do sêmen suíno conservado em ACP-103 a 5 C durante 5 dias, adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo. Tratamentos Dias de conservação D0 D1 D2 D3 D4 T0 22±23 a 3±7 a 1±6 a 0,0 0,0 T1 60±26 b 19±21 b 7±14 a 1±2,0 a 0,0 T2 69±22 b 28±25 bc 13±19 a 2±7,9 a 0,0 T3 70±27 b 31±24 bc 17±22 a 3±9,0 a 0,0 T4 77±18 b 39±28 c 21±26 a 6±15 a 0,0 a, b, c, letras diferentes entre linhas indicam diferenças significativas (p<0,05) Tabela 3: Porcentagem de células vivas (%) do sêmen suíno conservado em ACP-103 a 5 C durante 5 dias, adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo. Tratamentos Dias de Conservação D0 D2 D4 T0 28±26,5 a 9±6,4 a 0,0 T1 51±22,0 a 26±27,0 a 0,0 T2 64±24,6 a 45±22,2 a 0,0 T3 69±12,3 a 54±41,4 a 0,0 T4 71±19,3 a 56±41,0 a 0,0 a, b, c, letras diferentes entre linhas indicam diferenças significativas (p<0,05). 53 2

10 Tabela 4: Porcentagem de células do sêmen suíno com acrossoma intacto (%) conservado em ACP-103 a 5 C durante 5 dias, adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo. Tratamentos Dias de Conservação D0 D2 D4 T0 37±21,3 a 54±24,7 a 54±24,4 a T1 51±24,4 a 60±25,8 a 60±24,8 a T2 51±26,8 a 59±29,8 a 57±27,2 a T3 53±29,1 a 62±25,8 a 62±24,9 a T4 56±26,4 a 63±36,4 a 63±36,4 a a, b, c, letras diferentes entre linhas indicam diferenças significativas (p<0,05). Tabela 5: Espermatozoides reagentes ao teste de resistência osmótica (%) conservados em ACP-103 a 5 C durante 5 dias, adicionado de diferentes concentrações de gema de ovo. Tratamentos Dias de Conservação D0 D2 D4 T0 38±17,3 a 27±16,9 a 20±16,6 a T1 44±17,8 a 35±16,6 a 30±19,4 a T2 49±17,9 a 36±17,1 a 31±15,1 a T3 50±17,2 a 32±15,5 a 35±19,2 a T4 48±17,0 a 36±17,7 a 28±12,6 a a, b, c, letras diferentes entre linhas indicam diferenças significativas (p<0,05). 543

11 CONCLUSÕES Os efeitos deletérios da baixa temperatura de conservação sobre as características de vigor e motilidade foram minimizados durante as primeiras 48 horas de armazenamento, quando ao diluente ACP- 103 foi acrescido a gema de ovo, Já nos demais dias de conservação verificou-se que as diferentes concentrações de gema de ovo usadas neste trabalho, proporcionaram uma proteção parcial da célula espermática contra os demais efeitos deletérios da baixa temperatura. Assim conclui-se que as concentrações de 3, 5 e 7% da gema de ovo acrescentadas ao diluente ACP foram eficientes na manutenção do vigor e motilidade espermática, na conservação do sêmen suíno a 5 o C, por até 48 horas. Os resultados encontrados podem servir como base para futuros testes in vivo que demonstrem a capacidade de fertilização do sêmen suíno refrigerado em temperaturas diferentes da utilizada convencionalmente (17 C), estando diluído em ACP-103. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALKMIN, D.V.; SILVA FILHO, J.M.; PALHARES, M.S.; SIQUEIRA, A.P.; MACHADO, G.S.; SILVA, C.L.A.; TARANTIM, T.C. Efeito da porção do ejaculado e do método de resfriamento sobre as características físicas do sêmen suíno. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.63, n.6, p , BARIL, G.; CHEMINEAU, Y.; COGNIE, Y.; GUÉRIN, Y.; LEBOEUF, B.; ORGEUR, P.; VALLET, J.C. Manuel de formation pour l insémination artificielle chez les ovins et les caprins. 3a ed., Nouzilly, INRA, 137p., BENCHARIF, D.; AMIRAT-BRIAND, L.; LE GUILLOU, J.; GARAND, A.; ANTON, M.; SCHMITT, E.; DESHERCES, S.; DELHOMME, G.; LANGLOIS, M-L.; DESTRUMELLE, S.; VERA- MUNOZ, O.; BARRIÈRE, P.; TAINTURIER, D. Canine-chilled sperm: Study of a semen extender made with low-density lipoproteins from hen egg yolk supplemented with glutamine. Reproduction in Domestic Animals, v. 48, p , BORTOLOZZO, F.P.; WENTZ, I.; BENNEMANN, P.E.; BERNARDI, M.L.; WOLLMANN, E.B.; FERREIRA, F.M.; NETO, G.B. Suinocultura em ação: Inseminação artificial na suinocultura tecnificada. Porto Alegre: Brasil; p. BWANGA C.O.; MWANGA A.; ROFRIGUEZ-MARTINEZ H. Post thaw motility, acrossoma morphology and fertility of deep-frozen boar semen package in plastic puc-bags. In: I Congress Animal Reproduction, The Hagne, p , CARDOSO J.F.S.; PAULA N.R.O.; UCHOA D.C.; SILVA L.D.M.; Diferentes concentrações de gema de ovo na qualidade do sêmen canino diluído em ACP -106 e resfriado a 4 C. Comunicata Scientiae, v.1, n.2, p , CHAN P.J.; CORSELLI J.U.; JACOBSON J.D.; PATTON W.C.; KING, A. Correlation between intact sperm acrosome using the Spermac stain and sperm fertilizing capacity. Archives of Andrology, v. 36, p , Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal., 3ª ed., Belo Horizonte, 37p., CORRÊA M.N.; MEINCKE W.; LUCIA J.R.T.; DESCHAMPS J.C.; INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM SUÍNOS. Copyright. Pelotas, Brasil, 2001, 194p. FERNÁNDEZ-SANTOS M.R.; ESTESO M.C.; SOLER A.J.; MONTORO, V.; 551

12 GARDE J.J. Effects of egg yolk and cooling rate on the survival of refrigerated of red deer (Cervus elaphus hispanicus) epididymal spermatozoa. Reproduction in Domestic Animals, v.41, p , FONTENELE O.S.; CARDOSO J.F.S.; CARDOSO R.C.S.; SILVA A.R.; UCHOA D.C.; SILVA L.D.M. Conservação a 5 C do sêmen canino diluído em água de coco. In: IV Simpósio Cearense de Ciência Animal e II Simpósio Nordestino de Buiatria. Fortaleza, Ceará, n.1, Hancock, J.L.; Hovell, G.J.R. The collection of boar semen. Veterinary Record, v.71, p , JEYENDRAN, R.S.; VAN DER VEN, H.H.; PERZ-PALAEZ, M.; CRABO, B.G.; ZANEVELD, L.J.D. Development of an assay to asses the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. Journal of Reproduction and Fertility, v.70, p , KATZER L.H.; BERNARDI M.L.; PADILHA A.O.; BORTOLOZZO F.P.; WENTZ, I.; COSTI, G.; DIEHL, G.N. Diferentes temperatures e diluentes no resfriamento de sêmen suíno. In: X Congresso Brasileiro de Veterinários Especialistas em Suínos, RILLO, S.M.; MARTINEZ, E.; GARCIA, C.A.; DE ALBA, C. Boar semen evaluation in practise. Reproduction in Domestic Animals. v.31, p , MATOS D.M.; ARAUJO A.A.; DE, ROBERTO, I.G.; TONIOLLI R. Sobrevivência espermática em diferentes taxas de diluição do sêmen do varrão. Rev. Bras. Saúde Prod. An., v. 10, n. 4, p , MEDEIROS, A.A.; ARAÚJO, A.A.; MOURA, A.A.A.; CAVALCANTE, J.M.M.; FIGUEIRÊDO; RODRIGUES, L.F.S. Utilização do azul de bromofenol conservado a 4 o C e 29 o C, como método de coloração vital para a avaliação do espermatozoide ovino. Revista Ciência Agrária, 2006, 46: MIES FILHO. A Inseminação artificial. 6 a ed. Porto Alegre, Sulina, v.2, p. PONGLOWHAPAN, S.; ESSÉN- GUSTAVSSON, B.; LINDE-FORSBERG, C. Influence of glucose and fructose in the extender during long-term storage of chilled canine semen, Theriogenology, v.62, p , PURSEL, V.G.; JOHNSON, L.A.; SCHULMAN, L.L. Effect of dilution, seminal plasma and incubation period on cold shock susceptibility of boar spermatozoa. Journal of Animal Science, v.37, p , SALGUEIRO, C.C.M.; NUNES, J.F.; OLIVEIRA, K.P.L. Utilização de diluentes à base de água de coco in natura e em pó, na inseminação artificial programada de cabras. Revista Brasileira de Reprodução Animal, sup.1, n.5, p.96-98, SALLES, M.G.F. Água de coco (Cocus nucífera L. ) in natura e sob a forma de gel e estabilizada, como diluidor do sêmen caprino. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 1989, 53p. SCHEID, I.R. Transportando e armazenando corretamente as doses de sêmen. Suíno & Cia, n.2, p , SPITTALER, P.J., TYLER, J.P.P. Further evaluation of a simple test for determining the integrity os spermatozoal membrane. Clinic Reproduction Fertility, n.3, p , TONIOLLI, R; MESQUITA, D.S.M.; CAVALCANTE, S.G. Avaliação in vitro do sêmen de suíno diluído em BTS na água de coco in natura e estabilizada. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.22, n.4, p , TONIOLLI, R. Pouvoir fecondant des spermatozoïdes de verrat: amèlioration des conditions de conservation, p. These de Doctorat (Ciences de la Vie)

13 Université François Rabelais de Tours France, (Cópia da Tese na Biblioteca de Universidade Estadual do Ceará). Resumo disponível em t= TONIOLLI, R,; JATAHY P.C.; SILVA M.C.; MOREIRA F.R.C.; Utilização do leite desnatado e do ácido 3-indol acético na conservação do sêmen suíno. Ciência Animal, v.11, p.21-26, VERSTEGEN, J.P.; ONCLIN, K.; IGUER- OUADA, M. Long-term motility and fertility conservation of chilled canine semen using egg yolk added Tris glucose extender: In vitro and in vivo studies. Theriogenology, v. 64, p , WEITZE, K.F. Long-term storage of extender boar sêmen. Reproduction in Domestic Animals, Suppl. 1, p ,