EFEITO DA ADIÇÃO DOS ANTIOXIDANTES TROLOX C E ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE A INTEGRIDADE ACROSSOMAL DE ESPERMATOZOIDES DE OVINOS 1

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1 EFEITO DA ADIÇÃO DOS ANTIOXIDANTES TROLOX C E ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE A INTEGRIDADE ACROSSOMAL DE ESPERMATOZOIDES DE OVINOS 1 EFFECT OF ADDITION OF ANTIOXIDANTS TROLOX C AND ASCORBIC ACID ON INTEGRITY ACROSOMAL OF SHEEP SPERMATOZOA 1 Jonathan Maia da Silva Costa 2*, 2 Wildelfrancys Lima de Souza 3, 3 Elenice Andrade Moraes 4, 4 Vitória Gomes Coelho 5, 5 Laiane Moreira Vianna Magalhães 3 ; 6 Dailli Ingrid de Brito Lima 5 Introdução Dentre as biotecnologias reprodutivas aplicáveis ao gameta masculino, a criopreservação de espermatozoides causa injúrias celular e molecular, as quais resultam em queda na fertilidade em comparação com o uso de sêmen fresco (Bernardini et al., 2011). O espermatozoide possui uma concentração alta de fosfolipídios e, portanto sensível à peroxidação lipídica e devido à relação reduzida entre citoplasma e núcleo, sua reserva antioxidante é baixa, não sendo suficiente para resistir ao estresse oxidativo gerado durante o processo de criopreservação (Bucak et al., 2007). Visando reduzir os efeitos deletérios ocasionados pela criopreservação, o uso de antioxidantes como o Trolox C e ácido ascórbico, tem demostrado efeitos benéficos na manutenção da viabilidade espermática pós descongelamento (MAIA et al., 2009; CASTILHO et al., 2009) Portanto, objetivou-se avaliar se a adição de Trolox C e ácido ascórbico preservam a integridade acrossomal de espermatozoides de ovinos durante o processo de criopreservação. Material e Métodos O experimento foi desenvolvido no Centro de Pesquisa em Suínos, Espécies Nativas e Silvestre (CPSENS), localizado no Campus de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), Petrolina, Pernambuco. Foram utilizados três carneiros, com idade entre 2 a 4 anos. Os animais foram mantidos em baias individuais, com dieta a base de volumoso e concentrado, com fornecimento de água ad libitum. As colheitas foram realizadas duas a três vezes por semana para cada animal com intervalos de 48 horas. Foi utilizada nas colheitas vagina artificial para ovinos (Minitub ; Berlim, Alemanha) com água a 50 C acoplada a tubos de centrífuga de 50 ml, utilizando como manequim uma fêmea ovina. Após a coleta o sêmen foi transportado imediatamente para o CPSENS e colocado em banho-maria a 32 C. Cada ejaculado foi avaliado quanto aos parâmetros seminais (volume, aspecto, concentração e a motilidade espermática). 1 Parte de dissertação do primeiro autor. 2 Doutorando do Curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (FAVET), Universidade Estadual do Ceará. * jonathanmaiacosta@yahoo.com.br 3 Mestrandos do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal (CPGCA), Universidade Federal do Vale do São Francisco (Univasf), Petrolina-PE. 4 Professora do Colegiado de Zootecnia e CPGCA, Univasf, Petrolina-PE. 5 Discente do Curso de Medicina Veterinária, Univasf, Petrolina-PE.

2 Os ejaculados foram distribuídos em cinco tubos de ensaio de 15 ml e diluídos em Tris-gema de ovo, conforme Souza et al., (2015), para concentração final de 200x10 6 espermatozoides/ml, determinado através da análise no fotômetro SDM6 (Minitub ; Berlim, Alemanha), e mantidos em banho maria a 32 C. Em seguida o diluidor foi previamente adicionados ou não com os antioxidantes, considerando os seguintes tratamentos: Grupo 1 (Controle - sem antioxidante); Grupo 2 (adição de 200µM de Trolox C Ácido Ascórbico); Grupo 3 (300µM de Trolox C); Grupo 4 (0,05% de Ácido Ascórbico); Grupo 5 (0,25% de Ácido Ascórbico). Em seguida os tubos de ensaio contendo os tratamentos foram inseridos em becker com 100mL de água a 32 C, e acondicionados sobre rack em câmera fria a 5 C durante 2 horas. Após esse período, as amostras de cada tratamento foram envasadas em palhetas de 0,5 ml e lacradas com seladora UltraSeal (Minitub ; Berlim, Alemanha). As palhetas foram colocadas em rampa de congelação e sobre vapor de nitrogênio líquido (N 2 ) (8 cm da lâmina líquida) durante 15 minutos, quando foram imersas em nitrogênio líquido e armazenadas em botijão criogênico até análise. As amostras foram descongeladas a 37 C, durante 30s utilizando o descongelador automático de palheta (IMV ; São Paulo, Brasil). A integridade do acrossoma foi avaliada pela técnica de coloração de Fluorescein isothiocyonate-conjugated aglutin (FITC- PNA), para isto foram preparados esfregaços com alíquotas de sêmen (10µL), os quais foram secos em temperatura ambiente e armazenados a 4ºC protegidos da luz. Após o intervalo de duas semanas, os esfregaços foram corados com 30 µl de FITC-PNA (concentração de 100 µg/ml), incubados por 20 minutos em câmera úmida a 4ºC, em seguida eram lavados em PBS e secos na ausência da luz. Antes de cada avaliação, 5 µl de meio de montagem (4,5 ml de glicerol, 0,5 ml de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lâmina coberta de lamínula (ROTH et al.1998). Um total de 200 células espermáticas foram avaliadas em microscópio de fluorescência, usando filtro 02 (excitação 365nm e emissão 420nm). Os espermatozoides foram classificados como detentores de acrossomos íntegros, quando apresentavam a região acrossomal corada com sonda fluorescente brilhante. Por outro lado, quando apresentavam uma faixa verde fluorescente na região equatorial da cabeça espermática ou não apresentavam fluorescência verde em toda a região da cabeça eram considerados como reagido e/ou lesionado. As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico SAEG.

3 Resultados e Discussão Os percentuais de espermatozoides com acrossoma intactos após o descongelamento variou de 78,06 a 92,19%, havendo influência positiva das amostras acrescidas com as diferentes concentrações de antioxidantes quando comparado ao tratamento não aditivado dos mesmos (Tabela 1; P<0,05). Os valores percentuais de integridade da membrana acrossomal deste estudo foram superiores aos observados por Arruda et al. (2007), Maia et al. (2009), Azevedo (2006) e Bittencourt et al. (2014), 47,5%, 59,9%, 51,5% e 67,0%, respectivamente, ao avaliarem a membrana acrossomal de espermatozoides de carneiros, através da associação da sonda fluorescente FITCH- PSA. Embora no presente trabalho não tenha sido avaliado os níveis de geração de ERO, quando comparamos os percentuais de integridade da acrossomal deste experimento, com os trabalhos supracitados, podemos presumir que a utilização 100 ou 200 µl de trolox e 0,05% ou 0,25% de ácido ascórbico foi eficiente para proporcionar equilíbrio na produção das espécies reativas de oxigênio durante o processo de criopreservação, onde de maneira eficiente, reduziu os danos iniciais relacionados a criocapacitação (BAILEY et al., 2000) que são suficientes para proporcionar a chamada reação acrossômica precoce. Tais resultados são fundamentais, uma vez que, a integridade de membrana acrossomal é um dos parâmetros que possui maior correlação com a taxa de fecundação in vitro do que com a motilidade e morfologia, fato esse também observado por Januskauskas et al. (2001) quando observaram a ocorrência de correlação positiva entre os espermatozoides com membrana intacta e sua fertilidade in vitro. Conclusão A adição de Trolox C e ácido ascórbico ao diluente promoveu proteção contra os danos no acrossoma dos espermatozoides de carneiros durante o processo de criopreservação. Referências Bibliográficas ARRUDA, R. P. ANDRADE, A. F. C.; PERES, K. R.; RAPHAEL, C. F.; NASCIMENTO, J.; CELEGHINI, E. E. C. Biotécnicas aplicadas à avaliação do potencial de fertilidade do sêmen equino. Revista Brasileira de Reprodução Animal. V. 31, n. 1, p. 8-16, AZEVEDO, H.C. Integridade e funcionalidade dos espermatozóides ovinos submetidos à criopreservação após a incorporação de colesterol, desmosterol, ácido oléico-linoleico e a- lactoalbumina. Botucatu, p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária), Faculdade de Medicina Veterinária e

4 Zootecnia, Universidade Estadual Paulista UNESP, Botucatu. BAILEY, J.L.; BILODEAU, J.F.; CORMIER, N. Semen cryopreservation in domestic animals: a damaging and capacitating phenomenon. Journal of Andrology, v. 21, p. 1-7, BERNARDINI, A.; HOZBOR,F.; SANCHEZ, E.; FORNÉS, M.W. ; ALBERIO, R.H.; CESARI, A. Conserved ram seminal plasma proteins bind to the sperm membrane and repair cryopreservation damage. Theriogenology, 76,p , BITTENCOURT, R. F.; OBA, E.; RIBEIRO FIHO, A. L.; CHALHOUB, M.; VASCONCELHOS, M. F.; BISCARDE, C. A.; BICUDO, S. D. Trehalose and calcium chelator for ram semen cryopreservation. Archives of Veterinary Science, v. 19, p , BUCAK, M.; ATEŞŞAHIN A.; VARIŞLI, O.; YÜCE, A.; TEKIN, N.; AKÇAY, A. The influence of trehalose, taurine, cysteamine and hyaluronan on ram semen: Microscopic and oxidative stress parameters after freeze thawing process. Theriogenology, v.67, n.5, p , CASTILHO, F. E.; GUIMARÃES, D. J.; MARTINS, F. L.; PINHO, O. R.; GUIMARANHÃES, F. E. S.; ESPESCHIT, B. J. C. Uso de própolis e ácido ascórbico na criopreservação do sêmen caprino. Revista Brasileira de Zootecnia, v.38, n.12, p , JANUSKAUSKAS, A.; JOHANNISSON, A.; RODRIGUEZ- MARTINEZ, H. Assessment of soerm chromatin structure assay in relation to field fertility of frozen-thaewd semen from Swedish Al bulls. Theriogenology, v. 55, p , MAIA, M. S.; BICUDO, S. D. Radicais livres, antioxidantes e função espermática em mamíferos: uma revisão. Revista Brasileira de Reprodução Animal. v.33, n.4, p ,2009. ROTH, T.L.; WEISS, R.B.; BUFF, L.M. et al. Heterologous in vitro fertilisation and sperm capacitation in an endangered African antelope, the Scimiltar-Horned Oryx (Oryx dammah). Biology of Reproduction., v. 58, p , SAEG Sistema para análises estatísticas, versão 9.1: Fundação Arthur Bernardes UFV Viçosa, 2007.

5 SOUZA, W. L.; LIMA, D. I. B.; MORAES, E. A.; COSTA, J. M. S.; TORRES, L. R. C.; COELHO, V. G.; MAGALHAES, L. M. V. Adição de diferentes concentrações de crioprotetores e gema de ovo sobre a motilidade espermática progressiva de ovinos após a criopreservação. In: XXV Congresso Brasileiro de Zootecnia- ZOOTEC, 2015, Fortaleza-CE. Anais do XXV Congresso Brasileiro de Zootecnia v. 25. Palavras chave: criopreservação. FITC- PNA. sêmen. sonda fluorescente Key words: cryopreservation. FITC-PNA. semen. fluorescent probe Tabela 1. Percentual de integridade do acrossoma (iac) de espermatozoides de carneiros criopreservados acrescidos ou não de diferentes antioxidantes Parâmetros Grupos experimentais espermáticos Controle TRO 100µL TRO 200µL AA 0,05% AA 0,25% iac 78,06±5,3 c 84,46±5,3 b 86,48±5,3 ab 89,0±5,3 ab 92,19±5,3 a TRO= Trolox C; AA= Ácido ascórbico. Médias com letras diferentes sobrescritas na mesma linha diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05).