CONTROLE DA PROLIFERAÇÃO CELULAR NORMAL E DO CRESCIMENTO TECIDUAL

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1 PROBLEMA 4 1. Objetivo 1: Descrever o processo de reparo tecidual, abrangendo, maturação, diferenciação e mecanismos; 2. Objetivo 2: Diferenciar cicatrização de regeneração celular. A regeneração resulta da restituição completa do tecido perdido ou lesado. O reparo pode restaurar algumas estruturas originais mas pode causas desarranjos estruturais, ocorre praticamente após qualquer insulto que cause destruição tecidual e é essencial à sobrevivência do organismo. Regeneração refere-se à proliferação de células ou tecidos para substituir estruuras perdidas, e o reparo consiste mais frequentemente em uma combinação de regeneração e formação de cicatriz, e depende da habilidade do tecido em regenerar e da extensão da lesão. CONTROLE DA PROLIFERAÇÃO CELULAR NORMAL E DO CRESCIMENTO TECIDUAL Nos tecidos adultos, o tamanho das populações celulares é determinado pelas taxas de proliferação celular, diferenciação e morte por apoptose. As células diferenciadas incapazes de se replicar são denominadas células terminalmente diferenciadas. O impacto da diferenciação depende do tecido onde ela ocorre: em alguns tecidos, as células diferenciadas não são substituídas, enquanto, em outros, elas morrem, mas são continuamente substituídas por novas células geradas a partir das célulastronco. A proliferação celular pode ser estimulada por condições fisiológicas e patológicas. A proliferação das células endometriais sob estimulação do estrogênio, durante o ciclo menstrual é um exemplo de processo fisiológico. A proliferação celular é controlada, em grande parte, por sinais (solúveis ou dependentes de contato) do microambiente que estimulam ou inibem a proliferação. Atividade proliferativa do tecido Os tecidos do corpo são divididos em três grupos com base na atividade proliferativa das suas células: tecidos em divisão contínua (tecidos lábeis epitélio estratificado escamoso da pele, cavidade oral, vagina e colo uterino), quiescentes (tecidos estáveis tem baixo nível de replicação, mas podem sofrer rápida divisão em resposta à estímulos, ex.: células parenquimatosas do fígado, rins e pâncreas) e tecidos que não se dividem (tecidos permanentes neurônios e células musculares cardíacas esqueléticas). Células tronco

2 As células-tronco precisam ser mantidas durante a vida do organismo. Tal manutenção é alcançada através de dois mecanismos: (a) replicação assimétrica obrigatória, na qual em cada divisão da célula-tronco uma das células-filhas retém sua capacidade de autorrenovação, enquanto a outra entra em uma via de diferenciação e (b) diferenciação aleatória, na qual uma população de célula-tronco é mantida pelo equilíbrio entre divisões da célula-tronco que geram duas células-tronco autorrenovadoras ou duas células que vão diferenciar-se. Nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário as células são células tronco embrionárias (células ES), e são pluripotentes. Essas geram as células-tronco multipotentes. As células tronco adultas tem capacidade restrita de gerar células diferentes. As células-tronco somáticas, na sua maioria, residem em microambientes especiais denominados nichos, compostos por células mesenquimais, endoteliais e outros tipos celulares. Acredita-se que os nichos celulares gerem ou transmitam estímulos que regulam a autorrenovação da célula-tronco e a geração de células progenitoras. Novas pesquisas mostram a possibilidade de reprogramar as células pluripotentes através da transdução de genes que codificam os fatores de transcrição da célula ES. Essas células reprogramadas são chamadas de células ips. Célula tronco embrionárias São usadas para estudo de sinais específicos e etapas da diferenciação para desenvolvimento de tecidos, permitiu a produção de camundongos knockout (desenvolvimento de genes de doenças humanas em ratos), futuramente podem ser usadas para repopular órgãos lesados. Reprogramação de células diferenciadas: células-tronco pluripotenciais induzidas

3 As células diferenciadas de tecidos adultos podem ser reprogramadas para tornarem-se pluripotentes transferindo-se seus núcleos para um ovócito cujo núcleo foi retirado. Nessa técnica, o núcleo de um fibroblasto da pele de um paciente é introduzido dentro de um ovócito humano enucleado para gerar células-tronco embrionárias, que são colocadas em cultura, e, então, induzidas a se diferenciarem em vários tipos celulares. Em princípio, essas células podem, então, ser transplantadas para o paciente, ao propósito de repopular órgãos lesados. Além das questões éticas associadas com essa técnica, a clonagem terapêutica, bem como a reprodutiva, é ineficiente e, com frequência, inexata. Uma das principais razões para a inexatidão é a deficiência na metilação da histona nas células ES reprogramadas, que resulta na expressão imprópria de genes. A pluripotência das células-tronco embrionárias de camundongos depende da expressão de quatro fatores de transcrição, Oct3/4, Sox2, c-myc e Klf4, enquanto a proteína homeobox Nanog atua impedindo a diferenciação. As células reprogramadas, conhecidas como células ips, são capazes de gerar células de origem endodérmica, mesodérmica e ectodérmica. Mais recentemente, as células ips pluripotentes foram geradas através de transfecção de hepatócitos, células gástricas e linfócitos B maduros terminalmente diferenciados de camundongo, com genes para os mesmos quatro fatores de transcrição. Portanto, as células ips podem tornar-se uma fonte de células para terapia de células-tronco específicas para o paciente, sem o envolvimento de transferência nuclear para ovócitos. Células tronco adultas (somáticas) A despeito de sua capacidade proliferativa, as células tronco somáticas geram células que se dividem rapidamente, conhecidas como células amplificadoras transitórias. Essas células perdem a capacidade de autoperpetuação e dão origem a células com potencial de desenvolvimento restrito, conhecidas como células progenitoras. Células-tronco adultas células amplificadoras transitórias com a perda da capacidade de autoperpetuação tornam-se células progenitoras. Uma alteração na diferenciação de uma célula de um tipo celular para outro é conhecida como transdiferenciação, e a capacidade da célula de se transdiferenciar em diversas linhagens é referida como plasticidade de desenvolvimento. As HSC (células tronco hematopoiéticas), quando mantidas em cultura, têm mostrado transdiferenciação para outros tipos celulares, como hepatócitos e neurônios. Células tronco na hemostasia tecidual Medula óssea: células HSC. Células-tronco hematopoiéticas: geram todas as linhagens celulares do sangue, podem reconstituir a medula óssea após depleção causada por doença ou irradiação. Células estromais da medula: são multipotentes. Aplicações terapêuticas importantes porque podem originar condrócitos, osteoblastos, adipócitos,

4 mioblastos e precursores de células endoteliais, dependendo do tecido para o qual elas migram. Fígado: contém células-tronco/progenitoras nos canais de Hering. Células localizadas nesse nicho podem originar uma população de células precursoras conhecidas como células ovais, as quais são progenitoras bipotenciais, capazes de se diferenciar em hepatócitos e células biliares. As células-tronco hepáticas funcionam como secundárias ou como compartimento de reserva ativado apenas quando a proliferação dos hepatócitos é bloqueada. Cérebro: as NSC (conhecidas como células precursoras neurais), capazes de originar neurônios, astrócitos e oligodendrócitos, têm sido identificadas no cérebro. Não está esclarecido se os neurônios gerados recentemente são integrados nos circuitos neurais, sob condições fisiológicas ou patológicas, e, mais amplamente, qual deve ser a proposta da neurogênese adulta. Pele: as células-tronco estão localizadas em três diferentes áreas da epiderme: no bulbo do folículo piloso, nas áreas interfoliculares da epiderme superficial e nas glândulas sebáceas. O bulbo do folículo piloso constitui um nicho para as células-tronco que produzem todas as linhagens celulares do folículo piloso. As células-tronco interfoliculares estão dispersas individualmente na epiderme e não estão contidas em nichos. Epitélio intestinal: as criptas são estruturas monoclonais derivadas de células-tronco únicas: o vilo é um compartimento diferenciado que contém células de múltiplas criptas. As células-tronco das criptas do intestino delgado regeneram a cripta em 3 a 5 dias. Musculo esquelético e cardíaco: miócitos da musculatura esquelética não se dividem, mesmo após lesão. A regeneração se dá por migração de células-satélites. Córnea: a transparência da córnea depende da integridade do epitélio corneano, o qual é mantido pelas células-tronco do limbo (LSCs). CICLO CELULAR E A REGULAÇÃO DA REPLICAÇÃO Fatores de crescimento A proliferação de muitos tipos celulares é orientada por polipeptídeos conhecidos como fatores de crescimento. Esses fatores, os quais podem ter múltiplos ou restritos alvos celulares, podem, também, promover a sobrevida celular, locomoção, contratilidade, diferenciação e angiogênese, atividades tão importantes quanto seus efeitos promotores de crescimento. Todos os fatores de crescimento agem como ligantes que se ligam a receptores específicos, os quais liberam sinais para as células-alvo.

5 Fator de crescimento Epidérmico (EGF) e Fator de Crescimento Transformador-alfa (TGF-alfa) Esses dois fatores compartilham o mesmo receptor (EGFR). O EFG é mitogênico para células epiteliais, hepatócitos e fibroblastos e encontra-se amplamente distribuído em secreções e líquidos teciduais. Em cura de feridas da pele, o EGF é produzido por ceratinócitos, macrófagos e outras células inflamatórias que migram para a área. O TGF-α foi originariamente isolado de células transformadas por vírus do sarcoma e está envolvido na proliferação de células epiteliais em embriões e adultos e na transformação maligna de células normais em câncer. Receptores: família EGF que possui 4 receptores EGFR (EGFR1) principal receptor. Mutações e amplificações do EGFR1 foram detectadas em cânceres de pulmão, cabeça e pescoço, mama, glioblastomas e outros cânceres, levando ao desenvolvimento de novos tipos de tratamentos dessas condições. ERB B2 hiperexpressado em câncer de mama.

6 Fator de crescimento do hepatócito (HGF) O HGF tem efeitos mitogênicos sobre os hepatócitos e maioria das células epiteliais, incluindo células do epitélio biliar e células epiteliais dos pulmões, rim, glândula mamária e pele. O HGF atua como morfogene no desenvolvimento embrionário, promove a migração e dispersão celular e aumenta a sobrevivência dos hepatócitos. É produzido por fibroblastos e pela maioria das células mesenquimais, células endoteliais e células hepáticas não parenquimatosas. Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) Todas as isoformas do PDGF exercem seus efeitos através da ligação a dois receptores de superfícies celulares, designados PDGFR-α e -β, que possuem diferentes especificidades ligantes. O PDGF é armazenado nos grânulos das plaquetas e liberado com a ativação plaquetária. É produzido por uma variedade de células, incluindo macrófagos ativados, células endoteliais, células musculares lisas e muitas células tumorais. O PDGF provoca migração e proliferação de fibroblastos, células musculares lisas e monócitos para áreas de inflamação e de cura de feridas da pele. Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) Família de proteínas homodiméricas que incluem VEGF-A (referida sempre como VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e PIGF (fator de crescimento placentário). O VEGF é um potente indutor da formação de vasos sanguíneos no inicio do desenvolvimento (vasculogênese) e exerce um papel central no crescimento de novos vasos sanguíneos (angiogênese) em adultos. Os membros da família VEGF sinalizam através de três receptores tirosinacinases: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. O VEGFR-2, localizado em células endoteliais e em muitos outros tipos celulares, é o principal receptor para os efeitos vasculogênicos e angiogênicos do VEGF. Fator de crescimento dos fibroblastos (FGF) Esta é uma família de fatores de crescimento contendo mais de 20 membros, dos quais o FGF ácido (afgf ou FGF-1) e o FGF básico (bfgf ou FGF-2) são os mais bem caracterizados. Os FGF contribuem para as respostas de cura de feridas, da hematopoiese, da angiogênese, do desenvolvimento e de outros processos, através de várias funções: o Reparo de feridas: FGF-2 e o KGF (FGF-7) contribuem para a reepitelização de feridas da pele. o Formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese): FGF-2 tem a capacidade de induzir a formação de novos vasos sanguíneos. o Hematopoiese: FGF foram implicados na diferenciação de linhagens específicas de células sanguíneas e no desenvolvimento do estroma da medula óssea. o Desenvolvimento: FGF influencia no desenvolvimento da musculatura esquelética e cardíaca, maturação pulmonar e diferenciação do fígado. Fatore de crescimento transformador-beta (TGF-beta)

7 Super-família de 30 membros que inclui 3 isoformas do TGF-β (TGF-β1, TGFβ2 e TGF-β3) e fatores com funções tão amplas como proteínas morfogenéticas do osso, ativinas, inibinas e substancia inibidora mülleriana. Mecanismo: é uma proteína homodimérica, produzida por plaquetas, células endoteliais, linfócitos e macrófagos. O TGF-β nativo é sintetizado como uma proteína precursora que é secretada e, então, clivada proteoliticamente, produzindo um fator de crescimento biologicamente ativo e um segundo componente latente. O TGF-β ativo se liga a dois receptores de superfície celular (tipos I e II), com atividade serina/treoninacinase e desencadeia a fosforilação de fatores de transcrição citoplasmáticos chamados Smads (que existem em várias formas, p. ex., Smad 1, 2, 3, 5 e 8). Esses Smads fosforilados formam, por sua vez, heterodímeros com Smad 4, que entram no núcleo e se associam a outras proteínas de ligação ao DNA para ativar ou inibir transcrição de gene. TGF-beta é secretado por macrófagos, linfócitos, plaquetas e células endoteliais como proteína precursora clivado proteoliticamente TGF-beta ativo liga-se a dois receptores de superfície celular (tipo I e II) desencadeia fosforilação de fatores de transcrição citoplasmáticos Smads formam heterodímeros com Smad 4 no núcleo ligam-se à proteínas de ligação e ao DNA ativa ou inibe a transcrição genica. Características do TGF-beta: o É inibidor de crescimento da maioria das células epiteliais: bloqueia o ciclo celular pelo aumento da expressão de inibidores do ciclo pertencentes às famílias Cip/Kip e INK4/ARF. o É um potente agente fibrogênico que estimula a quimiotaxia dos fibroblastos e aumenta a produção de colágeno, fibronectina e proteoglicanos, enquanto inibe a degradação de colágeno ao diminuir as proteases da matriz e aumentar as atividades inibitórias das proteases. o Possui forte efeito anti-inflamatório, mas aumenta algumas funções imunes. MECANISMOS DE REGENERAÇÃO DOS TECIDOS E ÓRGÃOS A incapacidade de uma verdadeira regeneração em mamíferos foi atribuída à ausência de formação de blastema (a fonte de células para regeneração) e à rápida resposta fibroproliferativa após a ferida. Como exemplo é usado o fígado, mas que não é uma regeneração verdadeira, pois há uma hiperplasia compensatória nas partes restantes do fígado ressecado. Regeneração hepática O fígado humano possui uma notável capacidade de regenerar-se, como demonstrado por seu crescimento após hepatectomia parcial. As partes do fígado que permanecem após hepatectomia parcial constituem um minifígado intacto, que se expande rapidamente, alcançando a massa do fígado original. A restauração da massa hepática é alcançada sem que haja um novo crescimento dos lobos que foram retirados na cirurgia. O crescimento ocorre por aumento dos lobos que restaram, processo conhecido como crescimento compensatório ou hiperplasia compensatória.

8 Quase todos os hepatócitos replicam-se durante a regeneração hepática após hepatectomia parcial. Como os hepatócitos são células quiescentes, eles levam várias horas para entrar no ciclo celular, progredir para G1 e alcançar a fase S de replicação do DNA. A onda de replicação dos hepatócitos é sincronizada e acompanhada por replicação sincrônica de células não parenquimatosas (células de Kupffer, células endoteliais e células estreladas). A proliferação do hepatócito, no fígado que está se regenerando, é desencadeada por ações combinadas de citocinas e fatores de crescimento polipeptídicos. Há influencia autócrina do TGF-alfa e parácrina de fatores de crescimento com HGF e IL-6 (preparam os hepatócitos quiescentes para entrar no ciclo). Sob a estimulação do HGF, TGF-α e HB-EGF, os hepatócitos preparados entram no ciclo celular e sofrem replicação do DNA. Norepinefrina, serotonina, insulina, hormônios do crescimento e da tireoide atuam como adjuvantes para a regeneração hepática, facilitando a entrada dos hepatócitos no ciclo celular. Há dois principais pontos de restrição para a replicação do hepatócito: a transição G0/G1 que traz hepatócitos quiescentes para o ciclo celular e a transição G1/S necessária para a passagem pelo último ponto de restrição de G1. A expressão do gene no fígado em regeneração prossegue nas fases, começando com a resposta inicial imediata do gene, que é transitória e correspondente à transição G0/G1. Mais de 70 genes são ativados durante essa resposta, incluindo os proto-oncogenes c-fos e c-jun, cujos produtos se dimerizam para formar o fator de transcrição AP-1; o c-myc, que codifica um fator de transcrição ativador de muitos genes diferentes; e outros fatores de transcrição, como NF-κB, STAT-3 e C/EBP. A resposta inicial imediata do gene prepara o estágio para a ativação sequencial de múltiplos genes, quando os hepatócitos progridem para a fase G1. Hepatócitos individuais replicam-se uma ou duas vezes durante a regeneração e retornam, então, ao estado quiescente em uma sequência de eventos estreitamente regulada, mas os mecanismos de pausa do crescimento não foram estabelecidos. Os inibidores do crescimento, como o TGF-β e as ativinas, podem estar envolvidos no término da replicação dos hepatócitos. MATRIZ EXTRACELULAR (MEC) E INTERAÇÕES CÉLULA-MATRIZ A regeneração e reparo dos tecidos depende das interações entre as células e a MEC. A MEC regula o crescimento, a proliferação, o movimento e a diferenciação das células que vivem no seu interior. A MEC está em constante remodelamento e sua síntese e degradação acompanham a morfogênese, a regeneração, a cura de feridas, os processos fibróticos crônicos, a invasão e a metástase de tumores. A MEC sequestra água, proporcionando turgor aos tecidos moles e minerais que dão rigidez ao osso, mas ela faz muito mais do que apenas preencher os espaços entre as células para manter a estrutura do tecido. Outras funções: o Suporte mecânico: para a ancoragem da célula e migração celular, e manutenção da polaridade celular.

9 o Controle do crescimento celular: podem regular a proliferação celular sinalizando através de receptores celulares da família das integrinas. o Manutenção da diferenciação celular: o tipo de proteína da MEC infuencia o grau de diferenciação das células no tecido. o Arcabouço para renovação tecidual: a manutenção da estrutura normal do tecido requer uma membrana basal ou um arcabouço de estroma. A integridade da membrana basal ou do estroma de células parenquimatosas é essencial para a regeneração organizada dos tecidos. É particularmente notável que, embora células lábeis e estáveis sejam capazes de regeneração, a lesão a esses tecidos resulta na restituição da estrutura normal apenas se a MEC não for lesada. O rompimento dessas estruturas leva à deposição de colágeno e à formação de cicatriz. o Estabelecimento de microambientes teciduais: membrana basal funciona como um limite entre o epitélio e o tecido conjuntivo subjacente o Armazenamento e apresentação de moléculas reguladoras: FGF e HGF, são secretados e armazenados na MEC, em alguns tecidos. Isto permite a rápida difusão de fatores de crescimento após lesão local ou durante a regeneração. A MEC é composta por três grupos de macromoléculas: proteínas estruturais fibrosas, como os colágenos e as elastinas que promovem resistência à tensão e retração; glicoproteínas adesivas, que conectam os elementos da matriz uns aos outros e às células; e proteoglicanos e hialuronan, que fornecem elasticidade e lubrificação. Essas moléculas se organizam para formar duas formas básicas de MEC: matriz intersticial e membranas basais. A matriz intersticial é encontrada em espaços entre as células epiteliais, endoteliais e células musculares lisas, bem como no tecido conjuntivo. Colágeno Atualmente, são conhecidos 27 tipos diferentes de colágenos, codificados por 41 genes dispersos em pelo menos 14 cromossomos. Cada colágeno é composto de três cadeias que formam um trímero na forma de hélice tripla. O polipeptídeo é caracterizado por uma sequência que se repete, na qual a glicina está na terceira posição e contém os aminoácidos especializados 4-hidroxiprolina e hidroxilisina. Os tipos I, II, III, V e XI são os colágenos fibrilares. Os colágenos tipo IV possuem domínios longos da tripla hélice, porém interrompidos, e formam bainhas em vez de fibrilas, constituindo os principais componentes da membrana basal, em associação com a laminina. O colágeno tipo VII forma as fibrilas de ancoragem entre algumas estruturas epiteliais e mesenquimais.

10 Elastina, fibrilina e fibras elásticas A habilidade dos tecidos de expandir e retrair (flexibilidade) é responsabilidade das fibras elásticas. Morfologicamente, as fibras elásticas consistem em um eixo central feito de elastina, circundado por uma rede periférica de microfibrilas. Quantidades substanciais de elastina são encontradas nas paredes dos vasos sanguíneos de grande calibre, como a aorta, assim como no útero, na pele e nos ligamentos. A rede microfibrilar periférica que circunda o eixo consiste, em grande parte, em fibrilina, uma glicoproteína que se associa a ela própria ou com outros componentes da MEC. Essas microfibrilas influenciam na disponibilidade de TGFbeta ativo na MEC. Proteínas de adesão celular São chamadas de moléculas de adesão celular (CAM) são classificadas em 4 familias: imunoglobulinas, caderinas, integrinas e selectinas. Essas proteínas atuam como receptores transmembrana. Como receptores, as CAM podem ligar-se a moléculas semelhantes ou diferentes em outras células, promovendo interação entre células semelhantes (interação homotípica) ou entre tipos celulares diferentes (interação heterotípica).

11 As integrinas se ligam a proteínas da MEC, como a fibronectina, a laminina e osteopontina, promovendo uma conexão entre células e MEC, bem como a proteínas adesivas em outras células, estabelecendo o contato célula-célula. A fibronectina é uma proteína grande que se liga a muitas moléculas, como o colágeno, a fibrina, os proteoglicanos e receptores de superfície celular. FIBRONECTINA: a forma plasmática se liga à fibrina e auxilia na estabilização do coagulo que preenche as lacunas criadas por feridas e atua como substrato para deposição de MEC e formação de matriz provisória durante a cura de feridas. A laminina é a glicoproteína mais abundante na membrana basal e possui domínios de ligação para a MEC e para os receptores de superfície celular. Na membrana basal, polímeros de laminina e colágeno tipo IV formam redes estreitamente ligadas. A laminina pode, também, mediar a adesão de células aos substratos de tecido conjuntivo. As caderinas e integrinas ligam a superfície celular ao citoesqueleto através da ligação a actina e filamentos intermediários. Os complexos integrina-citoesqueleto funcionam como receptores ativados e desencadeiam um número de vias de sinais de transdução, incluindo a MAP cinase, a PKC e vias PI3k, que são também ativadas por fatores de crescimento. Caderina significa proteína de adesão dependente de cálcio. Elas medeiam interações entre células do mesmo tipo. Essas interações conectam a membrana plasmática de células adjacentes, formando dois tipos de junções celulares chamados (1) zônula de aderência, junções pontuais pequenas, localizadas próximas à superfície apical das células epiteliais e (2) desmossomas, junções mais extensas e mais fortes, presentes em células epiteliais e musculares. A migração de ceratinócitos no processo de reepitelização das feridas na pele é dependente da formação de junções dermossômicas. A ligação das caderinas ao citoesqueleto ocorre através de duas classes de cateninas. A catenina-β liga as caderinas com a catenina-α, a qual, por sua vez, se conecta à actina, completando, assim, a conexão com o citoesqueleto. Caderina catenina-beta catetina-alfa actina citoesqueleto. Outras famílias de proteínas adesivas que são secretadas: (1) SPARC (proteína ácida secretada e rica em cisteína), conhecida também como osteonectina, contribui para o remodelamento tecidual em resposta à lesão e atua como inibidor da angiogênese; (2) as trombospondinas, uma família de proteínas grandes, multifuncionais, algumas das quais, semelhantes à SPARC, também inibem a angiogênese; (3) osteopontina (OPN) é uma glicoproteína que regula a calcificação, é um mediador da migração de leucócitos envolvidos na inflamação, no remodelamento vascular e na fibrose e (4) a família tenascina, que consiste em proteínas grandes multiméricas envolvidas na morfogênese e adesão celular. Glicosaminoglicanos (GAGS) e proteoglicanos Os GAGs consistem em longos polímeros repetidos de dissacarídeos específicos. Com exceção do hialuronan, os GAGs estão ligados a uma proteína central, formando moléculas chamadas proteoglicanos. Os proteoglicanos são notáveis em sua diversidade. A MEC contém, na maioria dos locais, várias proteínas centrais diferentes,

12 cada uma delas contendo GAGs diferentes. Podem ser proteínas integrais de membrana e, através da ligação a outras proteínas e ativação de fatores de crescimento e quimiocinas, atuam como moduladores da inflamação, das respostas imunes e do crescimento e diferenciação celulares. Há quatro famílias estruturalmente distintas de GAGs: heparansulfato, condroitina/dermatan-sulfato, queratan-sulfato e hialuronan (AH abundante nas valvas cardíacas, pele e tec esqueléticos. Liga-se à grande quantidade de agua e forma um gel viscoso dando ao tec. conjuntivo a capacidade de resistir à compressão, elasticidade e lubrificação). CURA POR REPARO, FORMAÇÃO DE CICATRIZ E FIBROSE Quando a lesão é extensa e atinge células parenquimatosas e do arcabouço de estroma a cura não pode se dar por regeneração. Sendo assim, a cura se dá por deposição de colágeno e outros elementos da MEC, promovendo a formação de cicatriz. O reparo pela deposição de tecido conjuntivo inclui as seguintes características básicas: o o o o o Inflamação. Angiogênese. Migração e proliferação de fibroblastos. Formação de cicatriz. Remodelamento do tecido conjuntivo. A reação inflamatória induzida pela lesão contém a lesão, remove o tecido lesado e promove a deposição de componentes da MEC na área da lesão, ao mesmo tempo em que a angiogênese é estimulada. Contudo, se a lesão persiste, a inflamação torna-se crônica, levando a uma excessiva deposição de tecido conjuntivo conhecida como fibrose. As relativas contribuições do reparo e da regeneração são influenciadas por: (1) capacidade proliferativa das células do tecido; (2) integridade da matriz extracelular e (3) resolução ou cronicidade da lesão e da inflamação. Mecanismos da angiogênese A angiogênese é um processo fundamental que afeta reações fisiológicas (p. ex., cura de feridas) e processos patológicos, como o desenvolvimento de tumores e metástase, retinopatia diabética e inflamação crônica. Angiogênese a partir de vasos preexistentes: há vasodilatação e aumento da permeabilidade dos vasos preexistentes, degradação da MEC e migração das células endoteliais. Etapas: o Vasodilatação: resposta ao oxido nítrico + aumento da permeabilidade: resposta ao VEGF (fator de crescimento endotelial vascular); o Degradação proteolítica da membrana basal do vaso original pelas metaloproteinases de matriz (MMP) e rompimento do contato célula-célula (resposta ao ativador do plasminogênio); o Migração das células endoteliais em direção ao estimulo; o Proliferação de células endoteliais;

13 o Maturação de células endoteliais (inibição do crescimento e remodelagem em tubos capilares); o Recrutamento de células periendoteliais para formar o vaso maduro. Angiogênese a partir de células precursoras endoteliais (EPC) As EPC podem ser recrutadas da medula óssea para os tecidos e iniciar a angiogênese. A natureza do mecanismo de migração é incerta. Essas células expressam alguns marcadores de células-tronco hematopoiéticas, bem como VEGFR-2 e caderinaendotelial vascular (caderina-ve). As EPC contribuem para a reendotelização de implantes vasculares e a neovascularização de órgãos isquêmicos, feridas cutâneas e tumores. Fatores de crescimento e receptores envolvidos na angiogênese Apesar da diversidade de fatores que participam da angiogênese, o VEGF é o fator de crescimento mais importante nos tecidos adultos que sofrem angiogênese fisiológica (p. ex., a proliferação do endométrio), assim como a angiogênese que ocorre na inflamação crônica, na cura de feridas, nos tumores e na retinopatia diabética. O receptor VEGFR-2 (o mais importante receptor de VEGF) é tirosina-cinase, induz a migração das EPC da medula óssea e aumenta a proliferação e diferenciação dessas células nos locais de angiogênese. No processo de angiogênese que se origina de vasos locais preexistentes, a sinalização do VEGF estimula a sobrevivência das células endoteliais, sua proliferação e motilidade, iniciando o brotamento de novos capilares. A proliferação, diferenciação e migração das células endoteliais podem ser estimuladas também pelo FGF-2. Mecanismo para desenvolvimento de perfeita angiogênese: via Notch que promove a ramificação correta de novos vasos e impede a angiogênese excessiva, reduzindo a sensibilidade ao VEGF. Os ligantes e receptores de Notch são moléculas ligadas à membrana. Há 5 ligantes de Notch e 4 receptores transmembrana. O ligante 4 semelhante a Delta (Dll4) é especifico de célula endotelial e é expresso em artérias e capilares, mas não em veias. Durante a angiogênese, a célula de condução, conhecida como célula da extremidade, sofre proliferação e migração, mas as células-eixo mantêm sua conexão com o vaso existente. O VEGF induz o ligante 4 semelhante a Delta nas células da extremidade, enquanto Notch 1 e Notch 4 são expressos nas células-eixo. A interação entre ligante 4 semelhante a Delta e os receptores Notch nas células da extremidade e do eixo adjacentes leva a uma clivagem proteolítica do receptor, em duas etapas, liberando o domínio intracelular de Notch, que se transloca para o núcleo e ativa genes que diminuem a sensibilidade ao VEGF. O bloqueio do ligante 4 semelhante a Delta aumenta a proliferação das células endoteliais e o brotamento de capilares, enquanto o bloqueio do VEGF tem efeitos opostos e diminui também a sobrevivência das células endoteliais. O VEGF estimula o ligante 4 semelhante a Delta (Dll4)/Notch inibe a sinalização do VEGFR bloqueio de VEGF causa.

14 Os vasos recém formados precisam ser estabilizados. A estabilização requer o recrutamento de pericitos e células musculares lisas (células periendoteliais) e a deposição de proteínas da MEC. As angiopoietinas 1 e 2 (Ang1 e Ang2), o PDGF e o TGF-β participam do processo de estabilização. A Ang1 interage com um receptor nas células endoteliais, chamado Tie2, recrutando as células periendoteliais. O PDGF participa do recrutamento das células musculares lisas, enquanto o TGF-β estabiliza os vasos neoformados, aumentando a produção de proteínas da MEC. A interação Ang1-Tie2 medeia a maturação do vaso a partir de tubos endoteliais simples, formando estruturas vasculares mais elaboradas e ajudando a manter a quiescência endotelial. Em contraste, a Ang2, que também interage com Tie2, possui efeito oposto, tornando as células endoteliais mais responsivas à estimulação por fatores de crescimento, como o VEGF, ou, na ausência do VEGF, mais responsivas aos inibidores da angiogênese. Proteínas da MEC como reguladores da angiogênese Esses processos são controlados por várias classes de proteínas, incluindo (1) as integrinas, particularmente αvβ3, que é crítica na formação e manutenção de vasos sanguíneos neoformados, (2) as proteínas matricelulares, incluindo trombospondina 1, SPARC e tenascina C, que desestabilizam as interações entre células e matriz e, portanto, promovem a angiogênese e (3) as proteinases, como os ativadores de plasminogênio e as MMP, que são importantes na remodelagem do tecido durante a invasão endotelial. Além disso, essas proteinases clivam proteínas extracelulares, liberando fatores de crescimento ligados à matriz, como o VEGF e o FGF-2, que estimulam a angiogênese. Cura de feridas cutâneas A cura de feridas cutâneas é dividida em três fases: inflamação, proliferação e maturação. A lesão inicial provoca adesão e agregação das plaquetas, formando um coágulo na superfície da ferida, levando à inflamação. Na fase proliferativa, há a formação do tecido de granulação, proliferação e migração de células do tecido conjuntivo e reepitelização da superfície da ferida. A maturação envolve a deposição de MEC, o remodelamento do tecido e a contração da ferida.

15 Ferida de primeira intenção: formação de uma cicatriz relativamente fina. Ferida de segunda intenção: reação inflamatória mais intensa, formação de abundante tecido de granulação (descrita adiante) e extensa deposição de colágeno, levando à formação de cicatriz substancial que geralmente se contrai. Formação do coágulo sanguíneo A ferida causa a ativação das vias de coagulação que resultam na formação de um coágulo sanguíneo na superfície da ferida. Além das hemácias capturadas, o coágulo contém fibrina, fibronectina e componentes do complemento. O coágulo detém o sangramento e funciona como arcabouço para as células em migração, que são atraídas por fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas liberadas na área. A liberação do VEGF leva ao aumento da permeabilidade edema. Contudo, ocorre desidratação na superfície externa do coágulo, formando uma crosta que cobre a ferida. Em feridas que causam grandes perdas de tecido, o coágulo de fibrina é maior e há mais exsudato e restos necróticos na área ferida. Dentro de 24 horas, neutrófilos aparecem nas bordas da incisão e migram para o coágulo, usando o arcabouço produzido pela fibrina. Essas células liberam enzimas proteolíticas que removem os restos necróticos e bactérias. Formação de tecido de granulação Entre 24-72hrs fibroblastos e células endoteliais vasculares proliferam e formam o tecido de granulação, que é ponto de referência do reparo tecidual. O termo deriva de sua aparência granular, rósea e macia, na superfície das feridas. Sua característica histológica é a presença de novos e pequenos vasos sanguíneos (angiogênese) e proliferação de fibroblastos. Esses vasos neoformados são permeáveis, permitindo a passagem de líquido e proteínas plasmáticas para o espaço extravascular edema. Progressivamente, o tecido de granulação invade o espaço da incisão; a quantidade de tecido de granulação depende do tamanho do defeito e da intensidade da inflamação. Por volta de 5 a 7 dias, o tecido de granulação preenche a área da ferida e a neovascularização atinge seu ponto máximo. Proliferação celular e deposição de colágeno 48 a 96 horas, os neutrófilos são amplamente substituídos por macrófagos. Os macrófagos representam os constituintes celulares chave do reparo tecidual, removendo resíduos extracelulares, fibrina e outros materiais estranhos do local de reparo e promovendo angiogênese e deposição de MEC. A migração de fibroblastos para o local da lesão é orientada por quimiocinas, TNF, PDGF, TGF-β e FGF. Sua subsequente proliferação é desencadeada por múltiplos fatores de crescimento, como PDGF, EGF, TGF-β, FGF e as citocinas IL-1 e TNF secretados por macrófagos e plaquetas. As fibras colágenas agora estão presentes nas bordas da incisão, mas no início estão orientadas verticalmente e não estabelecem pontes sobre a incisão. Em 24 a 48 horas, grupos de células epiteliais movem-se da borda da ferida (inicialmente com

16 pouca proliferação celular) ao longo das margens cortadas da derme, depositando, à medida que se movem, componentes da membrana basal. Elas se fundem na linha média, abaixo da superfície da crosta, produzindo uma fina e contínua camada epitelial que fecha a ferida. Os macrófagos estimulam a produção de FGF-7 e IL-6 que aumentam a migração e a proliferação dos ceratinócitos. Simultaneamente à epitelização, as fibrilas colágenas tornam-se mais abundantes e começam a formar pontes na incisão. Inicialmente, é formada uma matriz provisória contendo fibrina, fibronectina plasmática e colágeno tipo III, que é substituída por uma matriz composta principalmente de colágeno tipo I. O TGF-β é o agente fibrogênico mais importante e é produzido pela maioria das células do tecido de granulação, provocando a migração e a proliferação de fibroblastos, aumentando a síntese de colágeno e fibronectina e diminuindo a degradação da matriz pelas metaloproteinases. A epiderme recupera sua espessura e arquitetura normais e a queratinização superficial. Formação de cicatriz Desaparecimento de infiltrado leucocitário, edema e vascularização aumentada empalidecimento devido ao aumento de colágeno e à regressão da vascularização o arcabouço de tecido de granulação é convertido em cicatriz avascular e pálida (composta de fibroblastos fusiformes, colágeno denso, fragmentos de tecido elástico e outros componentes da MEC) perda definitiva dos anexos dérmicos. Final: tecido conjuntivo acelular destituído de infiltrado inflamatório e recoberto por epiderme intacta. Contração da ferida É importante em feridas de segunda intenção. Formação de uma rede de miofibroblastos (formados a partir de fibroblastos induzidos por PDGF, TGF-beta, FGF-2 liberados pelos macrófagos da região) que expressam alfa-actina de musculo liso e vimentina nas bordas da ferida contraem-se na ferida e produzem grande quantidade de MEC (colágeno tipo I, tenascina-c, SPARC e fibronectina). Remodelamento do tecido conjuntivo O equilíbrio entre síntese e degradação da MEC resulta no remodelamento da trama de tecido conjuntivo uma característica importante do reparo tecidual. Alguns fatores de crescimento (PDGF, FGF e citocinas como IL-1, TNF) estimulam a síntese e ativação de metaloproteinas, enzimas que degradam componentes da MEC (no caso de colágeno é feito pela melatoproteina de matriz MMP). As metaloproteinases da matriz incluem as colagenases intersticiais (MMP-1, -2 e -3), que clivam o colágeno fibrilar tipos I, II e III; as gelatinases (MMP-2 e 9), que degradam o colágeno amorfo, bem como a fibronectina; as estromelisinas (MMP-3, 10 e 11), que agem em uma variedade de componentes da MEC, incluindo proteoglicanos, laminina, fibronectina e colágenos amorfos; e a família de MMP ligadas à membrana (ADAM).

17 São inibidas por TGF-beta e esteroides. Uma vez formadas, as colagenases ativadas são inibidas por uma família de inibidores de metaloproteinases, que são produzidos pela maioria das células mesenquimais, impedindo a ação descontrolada dessas proteases. As colagenases e seus inibidores são essenciais no debridamento de locais lesados e no remodelamento do tecido conjuntivo necessário para reparar o defeito. ADAM são enzimas relacionadas com MMP que ficam ancoradas à membrana, a ADAM-17 cliva as formas precursoras ligadas à membrana do TNF e do TGF-alfa, liberando moléculas ativas. Recuperação da força tênsil O acúmulo final de colágeno depende não apenas do aumento de síntese, mas também da diminuição de degradação. A resistência da ferida aumenta rapidamente durante as 4 semanas seguintes, mas esse aumento reduz-se aproximadamente no terceiro mês após a incisão e alcança um platô de cerca de 70% a 80% da força tênsil da pele intacta. A recuperação da força tênsil decorre da síntese de colágeno que ultrapassa sua degradação durante os primeiros 2 meses e, em tempos posteriores, de modificações estruturais das fibras colágenas (ligação cruzada e aumento do tamanho das fibras) quando a síntese de colágeno cessa posteriormente. Fatores locais e sistêmicos que influenciam a cura de feridas Sistêmicos: nutrição adequada (proteínas, vitamina C), estado metabólico (diabetes melito atrasa), estado circulatório (suprimento sanguíneo), hormônios (glicocorticoides inibem a inflamação e logo a síntese de colágeno). Locais: infecções retardam a cura, fatores mecânicos (movimento precoce das feridas), corpos estranhos (fragmentos de objetos que impeçam a cicatrização), tamanho, localização e tipo da ferida.