UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA E FENOTÍPICA DE Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS DE ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL ISOLADAS NO ESTADO DO PARÁ CINTYA DE OLIVEIRA SOUZA Belém-Pará 2013

2 CINTYA DE OLIVEIRA SOUZA CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA E FENOTÍPICA DE Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS DE ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL ISOLADAS NO ESTADO DO PARÁ Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro Belém-Pará 2013

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4 1 CINTYA DE OLIVEIRA SOUZA CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA E FENOTÍPICA DE Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS DE ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL ISOLADAS NO ESTADO DO PARÁ Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Banca Examinadora: Prof. Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro Instituto Evandro Chagas / SVS / MS Prof. Dr. Ricardo Ishak Instituto de Ciência Biológicas, UFPA Profa. Dra. Lena Líllian Canto de Sá Morais Instituto Evandro Chagas / SVS / MS Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado Instituto de Ciência Biológicas, UFPA Profa. Dra. Karla Tereza Silva Ribeiro Instituto de Ciência Biológicas, UFPA Profa. Dra. Marluisa de Oliveira Guimarães Ishak (Suplente) Instituto de Ciência Biológicas, UFPA Belém, 10 de Julho de 2013

5 2 Nosso limite nós mesmos o construímos; expandi-lo é apenas uma questão de vontade e de coragem. Francisco Lúzio de Paula Ramos

6 3 À minha família, especialmente à minha querida mãe Neiva Monari e ao meu amado esposo Alexandre Moraes. "Há pessoas que transformam o sol numa simples mancha amarela, mas há também aquelas que fazem de uma simples mancha amarela o próprio sol" (Pablo Picasso). Mãezinha, esta foi a forma que achei para descrever sua força e sua coragem. Você é uma grande e surpreendente mulher, na qual eu busquei o exemplo de superação. Meu bem, você é um presente de Deus. Ao teu lado tornei-me uma pessoa melhor e mais feliz! A Deus, sem o qual eu não teria coragem para lutar nem forças para amar!

7 4 AGRADECIMENTOS A Deus, por estar comigo durante todos os momentos de minha vida. Obrigada por sua infinita misericórdia e por guiar-me por seus caminhos. Ao meu amado esposo Alexandre, seu amor, cuidado, compreensão e carinho foram essenciais para a superação dos momentos difíceis desta conquista. Obrigada por sempre estar ao meu lado! À minha mãe Neiva e meu pai José Carlos, por todo amor, dedicação, carinho, respeito e educação que me ensinaram a viver. Aos meus irmãos Carlos César e Nádia, pelo verdadeiro exemplo de família, onde a conquista de um é a vitória de todos. Ao meu querido sobrinho João Gabriel (6 anos) que mesmo sem saber restaurava as minhas forças com o seu sorriso. Ao meu orientador Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro, por ter sido um grande incentivador e orientador. Muito Obrigada! À Universidade Federal do Pará e ao Curso de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Centro de Ciências Biológicas, pela oportunidade de crescimento profissional ofertado com o desenvolvimento e a conclusão deste doutorado. Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da UFPA pelos vários ensinamentos e experiências que me fizeram crescer no conhecimento. Aos Professores Doutores, Antonio Carlos Rosário Vallinoto, Lena Líllian Canto de Sá Morais e Karla Tereza Silva Ribeiro, membros da banca examinadora, pelas importantes contribuições no plano de qualificação. Ao Instituto Evandro Chagas/SVS/MS e seu corpo técnico e administrativo pela oportunidade de desenvolvimento desta tese. À Dra Elizabeth Conceição de Oliveira Santos, diretora do Instituto Evandro Chagas, pelo apoio às atividades de pesquisa e a qualificação profissional.

8 5 Às chefias da Seção de Bacteriologia e Micologia, Dra Maria Luiza Lopes e, da Seção de Meio Ambiente, Dra Iracina Maura de Jesus, que viabilizaram a execução deste trabalho por meio da concordância na utilização das coleções bacterianas. À Dra Flávia Correa Bastos pela inestimável colaboração e orientação na execução e análise dos testes de PFGE. Obrigada por ter estado sempre à disposição! À Dr.ª Lena Líllian Canto de Sá Morais pela orientação direta e pessoal durante todo processo de análise dos perfis de macrorrestrição enzimática, desde as importantíssimas orientações sobre a utilização do programa Bionumerics até a análise e descrição final dos resultados. Obrigada por sua valiosa contribuição, por sua paciência e disposição em ajudar! À Profa Dra Karla Tereza Silva Ribeiro pela concordância e disponibilização das amostras ambientais isoladas de água de consumo e de beber provenientes do município de São Sebastião da Boa Vista. À Dra Daniela Rocha pelas orientações durante a execução dos ensaios de PCR multiplex. À amiga Ana Judith Pires Garcia Quaresma pela disposição e colaboração ativa durante a execução dos testes de suscetibilidade Às amigas Maurimelia Mesquista da Costa, Karla Valéria Batista Lima, Daniele Murici Brasiliensis e Ana Roberta Fusco da Costa pelas importantes contribuições durante as etapas de revisão dos resultados. À Geralda Resende e Elivan Vale (Seção de Meio Ambiente) pela atenção e colaboração durante a localização e obtenção das informações referentes às amostras ambientais. À Denise Amorim e Raimundo Pio pela colaboração durante os ensaios de PFGE. À amiga Fernanda Sagica e ao Prof. Dr. Édson Ramos pelas importantes contribuições durante as análises estatísticas. Às amigas Silvia Marques, Luana Nepomuceno, Ana Roberta, Karla Lima, Daniele Murici, Ana Judith, Flavia Bastos e Maurimelia Costa pela amizade e palavras de incentivo durante este período.

9 6 Ao Prof. Dr. Francisco Lúzio de Paula Ramos pelo apoio, atenção e incentivos na busca do aprimoramento técnico e científico. Aos estudantes, bolsistas e servidores do IEC e da Universidade Federal do Pará que participaram do isolamento e identificação dos isolados de Escherichia coli: Taiany Bicalho, Patricia Yoshida, Eveline Bezerra de Sousa, Dolores Dias, José Góes, Caetano, Raimundo nonato, Madalena, Jardel, Vanderley, Maria Odete, Raquel, Rosinha Kaieda, Elivan Vale, Geralda Rezende, Raimundo Pio. Às amigas Ana Roberta Fusco da Costa e Eveline Bezerra de Sousa que foram responsáveis pela identificação molecular das E.coli diarreiogênicas de origem humana. Às coordenações dos Projetos Juruti (Dra Lourdes Garcez), Projeto HIV (Dra Yvone Gabbay), Projeto Praias (Dr Edvaldo Loureiro), Projeto Ilhas (Dra Lena Líllian) e Projeto Marajó (Dr. Ricardo Ishak) pela oportunidade de participar de alguns desses estudos e pela disponibilidade das amostras que comporam este trabalho. Aos amigos do Laboratório de Bacteriologia Geral, Entéricos I e II e do Setor de esterilização da Seção de Bacteriologia e Micologia (SABMI/IEC) por toda colaboração no preparo dos meios de cultura, cultivo e recuperação das amostras. Aos profissionais e estudantes das áreas técnica e administrativa da SABMI/IEC/MS pelo convívio, auxílio e amizade no decorrer desta etapa. Muito obrigada!

10 7 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS 9 LISTA DE TABELAS E QUADROS 11 RESUMO 12 ABSTRACT 13 1 INTRODUÇÃO CARACTERÍSTICAS GERAIS DE Escherichia coli CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS DE Escherichia coli RECONHECIMENTO DE E. coli COMO PATÓGENO GASTROINTESTINAL Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS E. coli enteropatogênica - EPEC E. coli enterotoxigênica - ETEC E. coli enteroinvasora - EIEC E. coli produtora da Toxina de Shiga - STEC E. coli enteroagregativa - EAEC DIAGNÓSTICO LABORATORIAL RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA RELEVÂNCIA DA ANÁLISE CLONAL POR PFGE (PULSED FIELD GEL ELETROFORESIS) NA EPIDEMIOLOGIA DE ISOLADOS DE Escherichia coli OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos MATERIAL E MÉTODOS AMOSTRAS PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS Reisolamento, Identificação e manutenção das culturas de E. coli Detecção Molecular de E. coli diarreiogênicas Extração do DNA bacteriano Reação em Cadeia mediada pela Polimerase - Multiplex (PCRmultiplex)... 37

11 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase - Simples (PCR-monoplex) Eletroforese Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos Preparação do Inóculo Semeadura nas placas Aplicação dos Discos de Antimicrobianos Leitura e interpretação do teste Eletroforese em Gel de Campo Pulsante (PFGE) Preparo da suspensão bacteriana Montagem dos blocos de agarose Processo de Lise in situ Digestão do DNA com a enzima de restrição XbaI Montagem do gel de corrida e condições eletroforéticas Coloração e fotodocumentação do gel de agarose Interpretação e análise dos perfis de macrorrestrição gerados pelo PFGE APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS ASPECTOS ÉTICOS RESULTADOS FREQUÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS PELFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS E FENÓTIPOS DE RESISTÊNCIA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS VARIABILIDADE GENÉTICA DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS DISCUSSÃO DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS E. coli diarreiogênicas de origem humana E. coli diarreiogênicas de origem ambiental RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICES

12 9 LISTA DE FIGURAS Página Figura 1- Padrão de aderência localizada de EPEC em cultura de células HeLa (Hernades et al., 2009) Figura 2- Fímbria BFP de EPEC (Nataro & Kaper, 1998) Figura 3- Estrutura em forma de pedestal vista na lesão A/E de EPEC (Kaper et al., 2004) Figura 4- Padrão de aderência localizada de EPEC em cultura de células HeLa (Hernandes et al., 2009) Figura 5- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com a categoria patogênica Figura 6- Amplificação dos alvos moleculares gerados pelo PCR-multiplex. Linha 1: Mix de DNA das cepas padrões de E. coli diarreiogênica, linha 2 a 8: Controles positivos para observação da amplificação individual dos alvos moleculares Figura 7- Frequência de resistência aos antimicrobianos entre as E. coli diarreiogênicas Figura 8- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com a origem de isolamento Figura 9- Perfis de macrorrestrição de E. coli diarreiogênicas gerados pela enzima Xba I por meio do método de PFGE. Linhas 1, 7 e 13: Marcador de peso molecular (48,5 a 1018,5 KB); linhas 2-5 e 6-8: E. coli diarreiogênicas com perfil de macrorrestrição; linha 11: ETEC 615 (ambiental) com degradação do DNA genômico; linha 12: Salmonella Braenderup Figura 10- Dendograma da relação genética entre as E. coli diarreigênicas baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima Xba I e definidos pelo PFGE. O agrupamento por similaridade foi determinado pelo coeficiente de Dice e método UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths) Figura 11- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enteropatogênica (EPEC) baseado nos perfis de macrorrestrição

13 10 Figura 12- Figura 13- Figura 14- gerados pela enzima Xba I e definidos pelo PFGE. O agrupamento por similaridade foi determinado pelo coeficiente de Dice e método UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5 / Applied Maths) Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enteroagregativa (EAEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima Xba I e definidos pelo PFGE. O agrupamento por similaridade foi determinado pelo coeficiente de Dice e método UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5 / Applied Maths) Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enterotoxigênica (ETEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima Xba I e definidos pelo PFGE. O agrupamento por similaridade foi determinado pelo coeficiente de Dice e método UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5 / Applied Maths) Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enteroinvasora (EIEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima Xba I e definidos pelo PFGE. O agrupamento por similaridade foi determinado pelo coeficiente de Dice e método UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths)... 63

14 11 LISTA DE TABELAS E QUADROS Página Quadro 1- Cepas de referência de Escherichia coli para PCR Quadro 2- Classificação molecular das categorias patogênicas de E. coli Quadro 3- Componentes e concentrações utilizados na PCR-multiplex Quadro 4- Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCRmultiplex Quadro 5- Programa de cliclagem utilizado na PCR-multiplex Quadro 6 - Componentes e concentrações utilizados na PCR-monoplex Quadro 7 - Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCRmonoplex Quadro 8- Programa de cliclagem utilizado na PCR-monoplex Quadro 9- Interpretação do diâmetro dos halos de inibição aos antimicrobianos utilizados Tabela 1- Frequência das E. coli diarreiogênicas de origem ambiental de acordo a origem de isolamento Tabela 2- Frequência de E. coli diarreiogênicas de origem humana de acordo com origem de isolamento Tabela 3- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com os fatores de virulência e a origem de isolamento Tabela 4- Frequência da resistência antimicrobiana de E. coli diarreiogênica de acordo com as origens de isolamento Tabela 5- Perfil de suscetibilidade entre as E. coli diarreiogênicas de acordo com os antimicrobianos utilizados Tabela 6- Tabela 7- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com as categorias patogênicas Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com a origem de isolamento Tabela 8- Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com as categorias patogênicas... 55

15 12 RESUMO A Escherichia coli é uma enterobactéria comensal do trato intestinal de humanos e animais e sua presença no ambiente é indicativo de contaminação fecal. A presença de determinados genes de virulência tornam essas bactérias patogênicas, podendo ser classificadas em categorias diarreiogênicas: E.coli enteropatogênica típica (EPEC-t) ou atípica (EPEC-a), E.coli enterotoxigênica (ETEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora da toxina de Shiga (STEC) e E. coli enteroagregativa (EAEC). Com objetivo de conhecer a frequência, a resistência antimicrobiana e as relações genéticas entre estas categorias no estado do Pará, foram pesquisados genes de virulência por PCR-multiplex e/ou monoplex entre 410 amostras de E.coli, sendo 344 de origem ambiental e 66 de origem humana. A resistência antimicrobiana foi avaliada pelo método de difusão em disco e as relações genéticas por PFGE. As cinco categorias de E.coli diarreiogênicas foram identificadas, sendo mais frequentes entre a origem humana (13,36%) do que ambiental (1,74%). A ETEC, EAEC e EPEC atípicas foram frequentes entre as duas origens. A EIEC e STEC foram exclusivas de origem humana, enquanto, a EPEC tipica foi exclusiva de origem ambiental. As maiores resistências foram observadas ao sulfametoxazol-trimetoprim (44,44%), ampicilina (40,28%) e tetraciclina (33,33%) e a única diferença de resistência entre as amostras humanas e ambientais foi à amoxicilina-ácido clavulânico. Não houve diferença estatística de resitência antimicrobiana entre as catogorias de E. coli, no entanto, a EAEC e EPEC apresentaram a maior diversidade de fenótipos de resistência. Os fenótipos de resistência mais frequentes foram AMP-STX-TE (24,32%), AM-STX (21,62%) e STX-TE (16,22%). A análise das relações genéticas revelou uma ampla variabilidade dos perfis de macrorrestrição entre todas as categorias de E. coli diarreiogênicas, tanto as de origem humana quanto ambiental, mesmo assim, foi possível a identificação de clones de origem humana que estavam geograficamente relacionados. Uma vez que as E. coli diarreiogênicas, puderam ser identificadas entre amostras humanas e ambientais, sendo a maioria resistente, sugere-se que as E. coli isoladas no Pará, podem apresentar potencial patogênico para o desenvolvimento de doença gastrointestinal e, que a água de rio, pode servir de fonte de infecção para população. Palavras chaves: E. coli diarreiogênicas, humana, ambiente, resistência e PFGE.

16 13 ABSTRACT Escherichia coli is a commensal enterobacteria from the intestinal tract of humans and animals and their presence in the aquatic environment is indicative of fecal contamination. The presence of certain virulence genes make these pathogenic bacteria be classified into diarrheogenic categories: enteropathogenic E.coli typical (EPECt) or atypical (EPECa), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), and. enterohemorrhagic E. coli (EHEC) or E. coli Shiga toxin-producing (STEC) and enteroaggregative E. coli (EAEC). In order to know the frequency, antimicrobial resistance and between these categories in the Pará State, we investigated virulence genes by multiplex and/or monoplex-pcr among 410 E. coli strains, among which, 344 were of environmental origin and 66 of human origin. Antimicrobial resistance was evaluated by the disk diffusion and the genetic relationship by PFGE. The six categories of diarrheagenic E. coli have been identified and the most common were the ones from human origin (13.36%) than the environmental ones (1.74%). The ETEC, EAEC and atypical EPEC were frequent between the two sources. The EIEC and STEC were exclusive of human origin, while the typical EPEC was exclusive of environmental origin. The highest resistance was observed to trimethoprim-sulfamethoxazole (44.44%), ampicillin (40.28%) and tetracyclin (33.33%) and the only difference in resistance between the human and environmental samples was to amoxicillin-clavulanic acid. There was no statistical difference in antimicrobial resistance among E. coli categories, however, EAEC and EPEC showed the highest diversity of resistance phenotypes. The most frequent resistance phenotypes were AMP-STX-TE (24.32%), AM-STX (21.62%) and STX-TE (16.22%). The genetic relationships analysis revealed a wide variability of macrorestriction profiles among all categories of diarrheagenic E. coli, both of human origin as of environmental one, anyway, it was possible to identify clones of human origin that were geographically related. Since diarrheagenic E. coli, have been identified among human and environmental samples, being the majority resistant, it is suggested that the E. coli strains isolated in Pará, may have pathogenic potential for the development of gastrointestinal disease, and that river water, can serve as source of infection for population. Keywords: diarrhoeagenic E. coli, human, environment, resistance, PFGE.

17 14 1. INTRODUÇÃO 1.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS DE Escherichia coli A Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo pertencente à família Enterobacteriaceae que coloniza o trato gastrointestinal de humanos e animais, mede 1,1-1,5 m de diâmetro por 2,0-6,0 m de comprimento, são móveis por flagelos peritríquios ou imóveis e apresentam metabolismo respiratório ou fermentativo com bom crescimento à temperatura de 37ºC. As seguintes características bioquímicas são utilizadas para sua identificação: fermentam a glicose e outros carboidratos com a formação de ácido e gás; são oxidase-negativa, catalase-positiva, vermelho de metila e indol positivos, Voges-Proskauer e citrato de Simmons negativos, não produzem H 2 S e não realizam a hidrólise da uréia; a maioria das cepas fermenta a L-arabinose, maltose, D-manitol, D-manose, L-raminose, D- xilose (Winn Jr et al., 2008). Além das cepas de E. coli comensais, que fazem parte da microbiota do intestino humano, existem cepas que podem ser patogênicas e causar doença, produzindo diferentes quadros clínicos. As categorias que causam infecção intestinal são coletivamente chamadas de E. coli diarreiogênicas com distintos mecanismos de patogenicidade; e as associadas às infecções extraintestinais (urinárias, meningites, septicemias e outras) são conhecidas como EXPEC (Extraintestinal Pathogenic E. coli) (Martinez & Trabulsi, 2008) CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS DE Escherichia coli A E. coli K-12 é considerada uma E. coli comensal e devido sua ampla utilização como modelo na biologia molecular e biotecnologia teve seu genoma primeiramente descrito. O genoma da E. coli K-12 é constituído por uma sequência de DNA de fita dupla possuindo pares de bases, sendo 87,8% dos genes codificantes para proteínas, 0,8% para RNA estáveis, 0,7% consiste de repetições não-codificantes e, aproximadamente, 11% são destinados para regulação e outras funções. O genoma também contém sequência de elementos de inserção (IS), fragmentos de fagos, e muitas outras sequências de composição incomum, indicando uma elevada plasticidade genômica através de transferência horizontal de genes (Blattner et al., 1997).

18 15 As categorias patogênicas de E. coli são definidas pela presença ou ausência de determinados segmentos de DNA codificantes de fatores de virulência que, em sua maioria são adquiridos através de eventos de transferências horizontais de genes intra ou extra espécie (Bielaszewska et al., 2007). Devido à aquisição de segmentos específicos como as ilhas de patogenicidade e outros elementos genéticos móveis, os genomas de E. coli patogênicas podem ser de até 1Mb maiores do que as comensais e pode codificar cerca de genes (Croxen & Finlay, 2010) RECONHECIMENTO DE E. coli COMO PATÓGENO GASTROINTESTINAL A Escherichia coli passou a ser reconhecida como patógeno intestinal primário após a ocorrência de um surto de diarreia infantil relatado por Bray & Beavan (1948), no qual foi isolada uma cepa particular de E. coli, identificada como Bacterium coli neopolitanum. A partir desse relato, cada amostra epidêmica de E. coli identificada, recebia uma designação de seus descobridores. Para padronizar a nomenclatura da E. coli, um bacteriologista dinamarquês, Fritz Kauffmann, adaptou o esquema de sorotipagem desenvolvido para Salmonella enterica, para o uso com E. coli (Kauffmann, 1954; Ewing, 1986). De acordo com este esquema, a E. coli é sorotipada com base na presença dos antígenos somáticos (antígeno O), flagelares (antígeno H) e capsulares (antígeno K) (Nataro & Kaper, 1998). A utilidade imediata desse esquema foi demonstrada pelo fato de que várias cepas de E. coli, que haviam sido isoladas em outros surtos de diarreia entre 1920 e 1940, pertenciam, surpreendentemente, a um pequeno número de sorogrupos O, em particular O111 e O55. Entretanto, nem todas as E. coli podem ser tipadas dessa forma, devido alguns isolados autoaglutinarem e serem chamados rugosos (O rough ou OR) ou por não poderem ser tipados pelos antissoros existentes (O non-typable ou ONT). São conhecidos mais de 180 sorogrupos O e mais de 60 sorogrupos H, sendo possíveis mais de combinações entre estes antígenos (Robins-Browne & Hartland, 2002). O antígeno O é responsável pela designação do sorogrupo, enquanto que a determinação do antígeno somático e flagelar (O:H) indica o sorotipo (Angeles, 2002). De acordo com Nataro e Kaper (1998), as Escherichia coli podem ser classificada em três grupos: comensais, patogênicas intestinais e extraintestinais. Entre as patogênicas intestinais são identificadas seis diferentes categorias conhecidas como E. coli diarreiogênicas

19 16 descobertas ao longo do tempo: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC) ou E. coli produtora da toxina de Shiga (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli aderente difusa (DAEC). A primeira categoria a ser reconhecida foi a E. coli enteropatogênica (EPEC), na década de 1940 (Bray & Beavan 1948). Com o passar dos anos, as infecções por esta categoria em países industrializados tornaram-se pouco frequentes e o interesse nesta bactéria também. No final da década de 1960, observou-se que algumas variedades de E. coli causavam diarreia semelhante à cólera, produziam enterotoxinas termolábil e termoestável e foram nomeadas como E. coli enterotoxigênica (ETEC) (Sack et al., 1971). Na década de 1970, foi observado que um grupo de E. coli era capaz de causar disenteria bacilar e ceratoconjuntivite em cobaias pelo teste de Sereny, uma característica encontrada até então no gênero Shigella. Essas amostras foram inicialmente classificadas como Shigella e mais tarde identificadas como E. coli enteroinvasora (EIEC) (Dupont et al., 1971). No início de 1980, dois surtos de diarreia associados à colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica ocorreram na América do Norte (Estados Unidos e Canadá ) devido o consumo de sanduíches com carne bovina mal passada. Durante a investigação destes surtos foi isolado das fezes dos pacientes um sorotipo incomum de E. coli, identificado como O157:H7, produtor de citotoxinas e denominado de E. coli entero-hemorrágica (EHEC) (Riley et al., 1983; Karmali et al., 1983). Essas novas descobertas evidenciaram o potencial patogênico das Escherichia coli e estimularam o interesse em E. coli diarreiogênicas, bem como a investigação de suas propriedades patogênicas. Com a introdução de novos testes de investigação de patogenicidade, como a adesão em cultura de células e inoculação em alças intestinais de coelho, novas categorias foram sendo descritas como a E. coli enteroagregativa (EAEC) (Vial et al., 1988; Cravioto et al., 1991) Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS De acordo com Nataro & Kaper (1998), as E. coli diarreiogênicas representam importante causa de diarreia endêmica e epidêmica no mundo. No entanto, a frequência

20 17 desses patógenos pode ser subestimada devido sua detecção exigir métodos diagnósticos específicos, que não são utilizados na prática clínica. A identificação de E. coli diarreiogênicas requer sua diferenciação das espécies não patogênicas da microbiota normal (Toma et al., 2003). As E. coli que causam diarreia são classificadas em categorias patogênicas de acordo com fatores de virulência específicos, que são codificados por cromossomos, plasmídeos e DNA de bacteriófagos. Esses fatores de virulência fornecem a cada categoria uma capacidade de causar síndrome clínica com características epidemiológicas e patológicas distintas (Browne et al., 2004). As seis categorias diarreiogênicas de E. coli são diferenciadas com base nos seus mecanismos de patogenicidade em: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC) ou E. coli produtora da toxina de Shiga (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli aderente difusa (DAEC) que atuam de acordo com a presença de fatores de virulência como adesinas fimbriais e afimbriais, toxinas e invasinas (Nataro & Kaper, 1998; Teng et al., 2004; Nguyen et al., 2005). Destas, as principais categorias associadas à diarreia aguda em menores de 5 anos são EPEC e ETEC (Souza et al., 2002, Ochoa et al., 2011), mas recentemente, a ocorrência de EAEC associada à diarreia vem sendo investigada e evidenciada nas regiões Sudeste e Nordeste do Brasil (Spano et al., 2008; Regua-Mangia et al., 2009a; Moreno et al., 2010). Percebe-se que a ocorrência das E. coli é um processo dinâmico e a cada época uma modificação de prevalência ou surgimento de uma nova categoria pode ser observada. Um exemplo foi o que ocorreu com a E. coli enteropatogênica típica (EPEC-t), anteriormente associada às diarreias infantis. Atualmente, há poucos relatos dessa categoria (EPEC-t), e a mesma vem sendo substituída pelas E. coli enteropatogênica atípica (EPEC-a) e E. coli enteroagregativa (EAEC) (Souza et al., 2002; Gomes et al., 2004; Rodrigues et al., 2004; Araújo et al., 2007; Moreno et al., 2010). Estudos epidemiológicos, sorológicos e moleculares desenvolvidos com EPEC atípica, sugerem que esta pode ser uma nova categoria e não um subgrupo de EPEC com ausência do plasmídeo EAF (Schmidt, 2010). Outro exemplo foi a descoberta de uma nova variante híbrida de E. coli (STEC-EAEC), sorotipo O104:H4, relacionada a um surto de colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica, ocorrido na Alemanha e em outros países da Europa com relato de vários óbitos (Kim et al., 2011).

21 E. coli enteropatogênica EPEC A primeira categoria de E. coli diarreiogênica foi a EPEC, identificada na década de Esta categoria foi considerada, em países em desenvolvimento, uma importante causa de diarreia aguda e eventual diarreia persistente em crianças menores de 5 anos, com prevalência em crianças menores de 2 anos de idade (Albert, 1996; Gomes et al., 1991) e responsáveis por surtos de diarreia hospitalar em berçários no período de inverno (Smith et al., 1996). O quadro clínico causado por EPEC se manifesta com diarreia aguda, que pode ser leve ou grave, acompanhada de febre e vômito (Fagundes-Neto & Scaletsky, 2000; Angeles, 2002). Em 1995, durante o 2º Simpósio Internacional sobre EPEC, realizado em São Paulo, foi reconhecida a existência de duas subcategorias de EPEC denominadas EPEC típica e EPEC atípica. Nesse simpósio ficou definido que EPEC típica de origem humana é aquela que possui um gene cromossômico eae (E. coli attachment-effacement) e um plasmídeo de virulência conhecido como EAF (EPEC adherence factor) que codifica a fímbria BFP (Bundle Forming Pilus), responsável pelo padrão de aderência em células epiteliais; enquanto que EPEC atípica é aquela que não possui o plasmídeo EAF ou fímbria BFP (Kaper, 1996; Trabulsi et al., 2002). Uma ampla definição de EPEC pode não requerer a presença do plasmídeo EAF ou fímbria BFP, mas apenas a habilidade de causar a lesão A/E (attaching and effacing), ou seja, presença de eae, com ausência de Stx (Toxina de Shiga) (Kaper, 1996). Em estudos com voluntários, verificou-se que algumas amostras destituídas de EAF causavam diarreia de menor intensidade nos pacientes do que as EAF-positivas (Nataro & Kaper, 1998). O mecanismo central da patogênese de EPEC é a lesão A/E, habilidade também presente em E. coli produtora de toxina de Shiga (STEC) e outras espécies bacterianas. O mecanismo pelo qual EPEC típicas promovem diarreia é complexo e provavelmente resulta dos efeitos de adesão na célula epitelial que inclui alterações na estrutura da membrana e na secreção de íons (Vidal et al., 2007). De acordo com Frankel et al. (1996), Nataro & Kaper (1998) e Vidal et al. (2007), o processo enteropatogênico ocorre em três estágios: 1º) Aderência localizada: as EPEC típicas produzem um padrão de aderência característico em culturas de células Hep-2 (células epiteliais de laringe humana) e HeLa (células epitelial de cervix humano), chamado de aderência localizada. Neste padrão, a

22 19 bactéria adere em pontos localizados da membrana plasmática dos enterócitos formando microcolônias compactas (Figura 1). Este fenômeno está associado com a presença da fímbria BFP que é codificada pelo plasmídeo EAF. Cleary et al. (2004) demonstraram que além do papel de interação entre as EPEC, a fímbria BFP é o fator de fixação inicial predominante, entretanto, na ausência de BFP (Figura 2), os filamentos EspA (EPEC secreted protein) são capazes de promover uma fixação bacteriana inicial, porém de menor eficiência; Figura 1- Padrão de aderência localizada de EPEC em cultura de células HeLa (Hernades et al., 2009). Figura 2- Fímbria BFP de EPEC (Nataro & Kaper, 1998). 2º) Transdução de sinais: a aderência de EPEC à célula epitelial induz uma variedade de rotas de sinalização na célula eucariótica. Os genes responsáveis pela ativação da transdução de sinais são codificados em uma ilha de patogenicidade chamada de Locus of enterocyte effacement ou região LEE, que codifica um Sistema de Secreção do Tipo III, secretor de várias proteínas como as Esp (EPEC secreted proteins) e receptor Tir (Translocated intimin receptor). Nessa etapa ocorrem alguns eventos como fosforilação de proteínas com ativação da tirosina quinase e aumento da concentração de Ca 2+ intracelular que inibe a absorção de Na + e Cl - ; 3º) Aderência íntima: a aderência íntima à célula epitelial é mediada pela ação da intimina (Int EPEC ) que é uma proteína de membrana codificada pelo gene cromossômico eae (E. coli attachment-effacement). Abaixo da região de aderência ocorre a condensação dos filamentos de actina das microvilosidades dos enterócitos que resulta na formação de estruturas semelhantes a pedestais (Figura 3). Este conjunto de modificações representa a base da lesão A/E (attaching and effacing).

23 20 A classificação de EPEC em típicas e atípicas tem importante implicação na patogenicidade e desfecho da diarreia, antes não totalmente apreciada (Trabulsi et al., 2002). As EPEC típicas (EPEC-t) são isoladas somente de humanos, enquanto as EPEC atípicas (EPEC-a) são encontradas em humanos e em vários animais como gado bovino, bubalino, equinos, aves e animais domésticos como cães e gatos (Ishii et al., 2007; Morato et al., 2009; Moura, 2009; Chase-Topping et al., 2012). Por muitos anos, as EPEC típicas foram associadas à diarreia infantil, mas têm-se observado, frequentemente, a redução desta subcategoria e um aumento relativo do isolamento de EPEC atípicas (Souza et al., 2002; Ghosh & Ali, 2010; Moreno et al., 2010) inclusive como única categoria entre as E. coli diarreiogênicas associadas aos casos diarreicos (Ferrer, 2007). Figura 3 - Estrutura em forma de pedestal vista na lesão A/E (attaching and effacing) de EPEC (Kaper et al., 2004). A alta prevalência de EPEC-atípica em pacientes com diarreia comparada aos indivíduos controles (sem diarreia) em muitos países e em algumas regiões do Brasil e, a ocorrência de surtos fortemente associados a esta categoria, faz com que as EPEC-a sejam consideradas como verdadeiros patógenos intestinais (Hernandes et al., 2009; Sousa, 2010). De acordo com Scaletsky et al. (2009), há evidências que mesmo entre as EPEC atípicas ocorra subgrupos patogênicos relacionados à doença diarreica. Os principais sorotipos de EPEC encontrados são: O55:[H6], O86:H34, O111:[H2], O114:H2, O119:[H6], O127:H6, O142:H6, O142:H34 (típicas) e O26:H[11], O55:[H7], O55:H34, O86:H8, O111ac:[H8], O111:[H9], O111:H25, O119:H2, O125ac:H6, O128:H2 (atípicas) (Trabulsi et al., 2002). Várias EPEC atípicas de humanos e animais, que não

24 21 pertencem aos sorogrupos clássicos, tem sido identificadas (Blanco et al., 2005; Bando et al., 2007) E. coli enterotoxigênica ETEC A segunda principal categoria de E. coli a ser associada com diarreia foi a ETEC, que emergiu no final dos anos 60 e início dos anos 70, devido principalmente ao trabalho desenvolvido por Sack et al. (1971) em Calcutá. As cepas de ETEC estão associadas à causa de diarreia em crianças com maior incidência na faixa etária de 2 a 3 anos (Albert et al., 1995) e a diarreia dos viajantes de características semelhante à cólera (Black, 1990; Nataro et al., 2006). Estão distribuídas numa grande variedade de sorogrupos, que abrangem pelo menos 78 grupos O e 34 H. Os sorogrupos O mais comuns são: O6, O8, O15, O20, O25, O27, O49, O63, O78, O128, O148, O153, O159, O167 e O169, e os grupos O e H mais fortemente associados: O8:H9, O78:H12 e O25:H42 (Wolf, 1997; Nataro et al., 2006). Investigações epidemiológicas têm implicado a água e os alimentos contaminados, com dose infectante de 10 8 UFC/mL (unidades formadoras de colônia), como veículos comuns de transmissão de ETEC sendo, a diarreia dos viajantes, diretamente relacionada à contaminação de alimentos e água (Mattila, 1994; Angeles, 2002). O sintoma predominante é a diarreia aquosa profusa, acompanhada de câimbras abdominais leves, vômitos e febre; esta diarreia pode ser leve e autolimitada, mas em alguns casos pode ser grave (Angeles, 2002). Em contraste com a patogenia da EPEC, o mecanismo pelo qual a ETEC promove diarreia se deve a aderência na mucosa intestinal e produção de enterotoxinas. A aderência à mucosa intestinal está relacionada às adesinas conhecidas como Pili tipo 1 e CFA I e II (colonization factor antigens) também chamados de antígenos CS (coli surface antigens), sendo ambos considerados como os fatores de virulência mais importantes para a colonização da mucosa intestinal por ETEC. Os genes codificadores dos CFA são encontrados em plasmídeos que também podem conter informações genéticas para as enterotoxinas. A investigação de CFA para a detecção de ETEC é pouco prática devido ao seu grande número e heterogeneidade (Nataro & Kaper, 1998). A partir da colonização inicia-se a elaboração de enterotoxinas. As cepas de ETEC produzem dois tipos de enterotoxinas: toxinas termolábeis LT I e LT II (heat-labile toxin) e toxinas termoestáveis STa e STb (heat-stable toxin) (Nataro & Kaper, 1998).

25 22 A LT I é expressa por E. coli que são patogênicas ao homem e animais, enquanto que LT-II é encontrada primariamente em amostras de animais (Costa et al., 2006). LT-I é uma toxina oligomérica, antigenicamente semelhante à toxina produzida por V. cholerae, possuindo uma subunidade A e cinco subunidades B. O mecanismo de patogenicidade de LT- I consiste na ligação das subunidades B ao mesmo receptor da toxina colérica (gangliosídio G M1 ), permitindo a entrada da subunidade A. O principal alvo da subunidade A é uma proteína de membrana (Gs) que regula a adenilato-ciclase; como efeito final, tem-se o aumento de AMPc (monofostato de adenosina cíclico), com ativação dos íons sódio, cloreto, bicarbonato de potássio e água da célula para luz intestinal, promovendo assim a diarreia aquosa (Nataro & Kaper, 1998). Há duas classes distintas de ST, a STa (também chamada de ST-I) e STb, que diferem em estrutura e mecanismo de ação. Existem algumas variantes de STa, a STp (ou STIa) e STh (ou STIb). A STp ou STIa é isolada de humanos e animais, a STh ou STIb é encontrada predominantemente em humanos (Nataro & Kaper, 1998). A classe STb está associada primariamente a cepas ETEC isoladas de suínos, entretanto, algumas cepas ETEC expressando STb, de origem humana, foram observadas (Trabulsi et al., 2002; Kaper et al., 2004). De modo semelhante, a enterotoxina STa liga-se à guanilato-ciclase, resultando em elevação dos níveis de monofosfato de guanosina cíclico e hipersecreção subsequente de líquidos (Nataro & Kaper, 1998) E. coli enteroinvasora EIEC Em 1971, DuPont et al. (1971) descreveram certas amostras de E. coli que causavam doença diarreica invasiva ou disenteria em voluntários. Estas amostras, de sorotipos distintos de ETEC e EPEC, eram extremamente semelhantes à Shigella. Hoje, há evidências de que EIEC e Shigella spp estão relacionadas genética e bioquimicamente (Angeles, 2002), no entanto, há diferenças no processo patogênico e na resposta imunológica do hospedeiro que evidenciam que a diarreia causada por EIEC é mais branda que a provocada por Shigella (Ferreira et al., 2012). As EIEC são frequentemente lactose-negativas, lisina descarboxilase-negativa, imóveis, com exceção do sorotipo O124:H30 e produzem uma doença semelhante à shigelose (Gibotti et al., 2004). A doença é mais comumente descrita em surtos do que em casos esporádicos (Gordillo et al., 1992), afetam, principalmente, crianças acima de dois anos de idade e adultos de baixa

26 23 renda em países em desenvolvimento, causando uma diarreia aguda aquosa que precede a disenteria bacilar (fezes contendo muco, sangue e leucócitos), acompanhada de dor abdominal, vômito, tenesmo e febre (Taylor et al., 1988, Nataro & Kaper, 1998). No Brasil, há relatos de que na cidade de São Paulo a frequência com que esta categoria está associada a diarreia varia de 2,3 a 15,8% dependendo da população de estudo e de que em outras cidades essa frequência é mais baixa (Toledo & Trabulsi, 1990, Ferreira et al., 2012). O mecanismo patogênico inclui a capacidade de invadir os enterócitos da mucosa do cólon e proliferar no interior dessas células, resultando em processo inflamatório, morte celular e propagação para células vizinhas; a produção de enterotoxinas é outro fator considerado de importância para patogênese da infecção por EIEC, pois são responsáveis pela secreção de água e eletrólitos no intestino delgado, promovendo assim, a fase de diarreia aquosa (Nataro & Kaper, 1998). Um processo complexo de colonização e permanência da EIEC nas células intestinais envolve múltiplos genes, tanto cromossomais como plasmidiais. Os genes necessários para a invasão se encontram em um plasmídeo de 140 MDa chamado pinv (plasmídeo de invasão), que codifica proteínas invasivas, como as Ipa (invasion plasmid antigen) e outras que estão envolvidas no processo patogênico (Angeles, 2002). O conjunto do gene ipa codifica quatro proteínas (IpaA, IpaB, IpaC e IpaD) sendo um dos loci essencial à invasão e está próximo a uma região do plasmídeo onde ocorrem deleções espontâneas. A perda do plasmídeo de invasão ou deleção espontânea de uma pequena região contendo genes ipa ocorre com relativa frequência (1 em 10 3 a 10 4 células), tornando a bactéria não invasiva, e portanto, avirulenta. O gene ipah codificador de um polipeptídeo semelhante a proteína IpaB, mas distinto imunológica e geneticamente, está presente em múltiplas cópias, tanto em plasmídeo quanto no cromossomo, e não faz parte do conjunto dos genes ipabcda. Portanto, a pesquisa de ipah é pouco comprometida pela perda do plasmídeo e/ou eventos de deleção seletiva do plasmídeo de invasão, sendo assim, mais sensível para diagnóstico laboratorial (Venkatesan et al., 1989). Os principais sorotipos desta categoria são: O28ac:Nomotile (NM - não móvel), O29:NM, O112ac:NM, O121:NM, O124:NM, O124:H30, O136:NM, O143:NM, O144:NM, O152:NM, O164:NM e O167:NM. O número de antígenos O associados à EIEC são limitados, sendo que três deles estão presentes em Shigella (O112ac, O124 e O152) (Gibotti et al., 2004).

27 E. coli produtora da Toxina de Shiga STEC Em 1982, um surto de colite hemorrágica, ocorrido nos Estados Unidos, chamou atenção para uma síndrome clínica incomum de doença diarreica e para um novo patógeno bacteriano entérico. O agente etiológico se tratava da E. coli O157:H7, um sorotipo não reconhecido, anteriormente, como causador de doença diarreica em humanos (Riley et al.,1983). As STEC são reconhecidas como importante causa de diarreia aquosa, sanguinolenta com desenvolvimento de colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (HUS hemolytic uremic syndrome) em todo o mundo, causadoras de surtos tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento (Morabito et al., 1998; Gomes et al., 2011). A maioria dos casos e dos surtos tem sido atribuída ao consumo de carne bovina e suína (Stephan & Schumacher, 2001) e outras fontes como frutas, saladas, sucos, iogurte e água, quando contaminados por fezes de animais infectados (Feng, 1995; Costa et al., 2006; Von Sydow et al., 2006). Diferentes quadros clínicos são observados nas infecções por STEC: quadro de diarreia cujo período de incubação é de 3-4 dias e perduram por 5-10 dias, são acompanhados por câimbras e dores abdominais, febre baixa e vômito em 30-50% dos casos; o quadro de síndrome hemolítica urêmica é caracterizado por manifestações de insuficiência renal aguda, trombocitopenia e anemia hemolítica microangiopática (López et al., 2000). As manifestações diarreicas promovidas por STEC são atribuídas a duas enterotoxinas semelhantes à toxina de Shiga, denominadas SLT-I e SLT-II (Toxina Shiga Like), também conhecidas como Verotoxinas (VT-1 e VT-2) ou toxinas de Shiga (Stx-1 e Stx-2). A Stx-1 é idêntica à toxina de Shiga produzida por Shigella dysenteriae tipo 1 e a Stx-2 possui 60% de homologia; como esta, ambas possuem cinco subunidades B e uma subunidade A, estando a subunidade B ligada a um glicolipídio específico na célula hospedeira. Uma vez internalizada, a subunidade A é clivada em duas moléculas, e o fragmento A 1, liga-se a um ácido ribonucléico ribossomal 28S (rrna) e interrompe a síntese protéica. A síndrome hemolítica urêmica tem sido preferencialmente associada à produção de Stx-2, que destrói seletivamente as células endoteliais renais (Levine, 1987; Browne, 2005). Stx-1 e Stx-2 são codificadas por genes encontrados em dois distintos bacteriófagos, que são integrados ao cromossomo do hospedeiro (Browne, 2005). Outros potenciais fatores de virulência são codificados pelo cromossomo e um plasmídeo de 60 MDa encontrado em todas as amostras do sorotipo O157:H7, dentre os quais podemos citar: proteína intimina,

28 25 enterohemolisina citolítica (Ehly- Enterohaemolysin), proteínas séricas e uma catalase (Nataro & Kaper, 1998). Trabalhos realizados em alguns países da América do Sul (Chile e Argentina) citam além do sorotipo O157:H7, outros sorogrupos envolvidos nos quadros de HUS (Síndrome Hemolítica Urêmica): O11:H - (H - - antígeno flagelar ausente), O21:H -, O26:H -, O26:H11, O75:H - e O87:H - (Morabito et al., 1998; López et al., 2000; Browne, 2005). O sorogrupo O157, antes característico de EHEC, foi descrito por Blank et al. (2003) no Brasil em amostras de EPEC, o que evidencia o fato da não correlação de sorogrupos com determinada categoria patogênica. Segundo Schmidt (2010), outros sorogrupos como O111, O103 e O145 tem sido reconhecidos como importante causa de colite hemorrágica e HUS. Dentre os determinantes de virulência acessórios das amostras O157:H7 e O26:H11 temos a ilha de patogenicidade conhecida como LEE (Locus of enterocyte effacement). Esta ilha consiste num agrupamento de genes associados à virulência incluindo eae, que codifica a adesina intimina (como em EPEC) que é utilizada como alvo em alguns ensaios diagnósticos. A ilha de patogenicidade LEE foi primeiramente identificada em EPEC (que causa diarreia em crianças, mas não produz Stx ou causa HUS) (Browne, 2005). Em estudos de evolução de E. coli patogênicas verificou-se que, na análise comparativa de sequências completas do genoma de amostras E. coli não patogênicas e EHEC O157:H7, estas bactérias compartilham um arcabouço genético comum com ilhas de DNA interceptadas. Há evidências de que muitos fatores podem ter sido adquiridos de outras bactérias por transferência horizontal de gene (por exemplo, através dos bacteriófagos, transposons e plasmídeos). Nesse contexto, é preciso lembrar que a evolução bacteriana é um processo que pode conduzir indubitavelmente a emergência de outro clone patogênico de E. coli bem sucedido no futuro (Schmidt, 2010) E. coli enteroagregativa EAEC Pesquisadores em 1987, ao examinarem amostras de E. coli isoladas em um estudo epidemiológico sobre a etiologia da diarreia no Chile encontraram amostras que apresentavam um padrão exclusivo de aderência, semelhante a empilhados de tijolos, que foi chamada aderência agregativa (AA) (Cravioto et al., 1991) (Figura 4). As cepas de E. coli que se aderem às células de cultura de Hep-2 (célula epitelial de laringe humana) ou HeLa (célula epitelial de cérvix humano) são classificadas em três diferentes categorias de acordo com o tipo de aderência: aderência localizada (AL), aderência

29 26 agregativa (AA) e aderência difusa (AD). As E. coli de aderência agregativa são denominadas Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) (Nataro et al., 1987). As EAEC são consideradas como agente causador de diarreia aguda e persistente em crianças e adultos de países em desenvolvimento como Peru e Brasil (Ochoa et al., 2011; Souza et al., 2002; Moreno et al., 2010) e desenvolvidos como Estados Unidos e Reino Unido (Navarro-Garcia & Elias, 2011). Alguns surtos de gastroenterites foram relatados no Japão envolvendo crianças em idade escolar e na Iuguslávia entre recém-nascidos de 2 a 11 dias de idade, internados em unidade neonatal (Itoh et al., 1997). A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é considerada uma categoria emergente de E. coli diarreiogênica com distribuição e importância mundial (Okhuysen & DuPont, 2010). De acordo com Chan et al. (1994), alguns sintomas como vômito e febre foram relacionados aos casos de diarreia causada por EAEC. O mecanismo pelo qual a EAEC causa diarreia não esta bem definido, porém vários fatores de virulência vêm sendo identificados: fímbria de aderência agregativa I e II (AAF I e II) responsáveis pela aderência à mucosa intestinal (Nataro et al., 1992), hemolisina e a produção de uma toxina termo estável chamada EAST, semelhante a STa produzida pelas cepas de ETEC e outra toxina codificada por plasmídeos conhecida como Pet (plasmidencoded toxin) (Garcia et al., 1999), além desses fatores, fazem parte da patogênese desta categoria a produção de biofilme e a inflamação da mucosa intestinal (Navarro-Garcia & Elias, 2011). Figura 4- Padrão de aderência localizada de EAEC em cultura de células HeLa (Hernandes et al., 2009)

30 27 O diagnóstico padrão para classificação de EAEC é a observação da aderência agregativa (AA) em cultura de células HEp-2, no entanto, a investigação do gene pcvd432 (plasmídeo de aderência agregativa - paa) ou a presença do gene aggr (ativador transcricional das fímbrias de aderência agregativa - AAF) são utilizadas como marcador molecular em estudos epidemiológicos que buscam esclarecer a associação de EAEC às doenças diarreicas (Baudry et al., 1990; Schmidt et al., 1995; Jenkins et al., 2006). Vários estudos sugerem que as cepas de EAEC são genética e fenotipicamente heterogêneas (Nataro et al., 1995; Czeczulin et al., 1999) DIAGNÓSTICO LABORATORIAL O diagnóstico laboratorial das infecções diarreicas é realizado pela identificação direta ou indireta do agente etiológico. No caso das infecções de origem bacteriana, a maioria dos diagnósticos é realizada pelo método convencional, que consiste no isolamento do agente bacteriano das fezes e posterior identificação bioquímica e sorológica (Winn Jr et al., 2008; Martinez & Trabulsi, 2008). Para o isolamento de bactérias da família Enterobacteriaceae, especificamente de E. coli, as amostras fecais são semeadas em meios seletivos indicadores como o ágar Mac Conkey MC e/ou ágar EMB (Eosina Azul de Metileno); após incubação, as colônias suspeitas são submetidas aos meios de triagem Triple Sugar Iron Agar TSI e a caracterização bioquímica realizada por meio de testes bioquímicos convencionais (Winn Jr et al., 2008) ou em aparelhos semi-automatizados (Mini API- biomèrieux) ou automatizados (Vitek II-bioMèrieux). Após identificação do gênero ou espécie bacteriana, a amostra é submetida à caracterização sorológica através da técnica de soroaglutinação que pode ser realizada em lâminas ou tubos, segundo recomendações de Ewing (1986) e Kauffmann (1954). O método convencional utilizado na identificação da maioria dos enteropatógenos bacterianos não é suficiente para o diagnóstico das E. coli diarreiogênicas. Um estudo mais amplo envolvendo aspectos moleculares, como a pesquisa de genes codificantes de fatores de virulência e experimentos in vivo como os testes de aderência e invasão à cultura de células, são necessários para a identificação destas categorias (Nataro et al., 1987; Cravioto et al., 1991).

31 28 A detecção dos genes codificantes de fatores de virulência por meio da Reação em Cadeia Mediada pela Polimerase (Polymerase Chain Reaction PCR) está sendo amplamente utilizada para a diferenciação de E. coli patogênicas das comensais e classificação das diferentes categorias diarreiogênicas (Frankel et al., 1989; Wang et al., 1997; Paton & Paton, 1998; Pennisi, 1999; Phantoumath et al., 2003). Os principais fatores de virulência utilizados na pesquisa molecular para diferenciação entre as E. coli diarreiogências são: a fímbria BFP (Bundle-forming pilus) codificada pelo gene bfpa localizado no plasmídeo EAF (EPEC Adherence Factor) e a proteína intimina codificada pelo gene cromossomal eaea (E. coli attachment-effacement) para identificação de EPEC; a proteína de invasão codificadas pelo plasmídeo Ipa (invasion plasmid antigen) para identificação de EIEC; as enterotoxinas termolábil (LT) e a termoestável (ST) para identificação de ETEC e toxinas de Shiga (Stx-1 e Stx-2) codificadas pelos identificação de STEC (Campos et al., 2004; Franzolin et al., 2005). Para investigação de EAEC pesquisa-se os genes pcvd432 (plasmídeo de aderência agregativa - paa) ou gene aggr (ativador transcricional das fímbrias de aderência agregativa - AAF) (Jenkins et al., 2006). Apesar da técnica de PCR convencional ser utilizada rotineiramente para a pesquisa de E. coli diarreiogênicas, a investigação dos isolados bacterianos requer um grande número de reações individuais para a detecção de vários fatores de virulência (Kimata et al., 2005). Para reduzir o número de testes necessários para a identificação dessas E. coli, vários sistemas de PCR multiplex, para a amplificação simultânea de dois ou mais loci em uma única reação, têm sido desenvolvidos. Estes sistemas de detecção múltipla representam apropriada solução para laboriosa identificação de categorias diarreiogênicas de E. coli, além de se mostrar como uma tecnologia mais eficiente e econômica (Saucedo et al., 2003). Usualmente mais de uma PCR multiplex é requerida (Toma et al., 2003, Costa et al., 2010), no entanto, uma única PCR multiplex já foi utilizada para determinação simultânea de cinco categorias diarreiogênicas de Escherichia coli (Aranda et al., 2007; Sousa, 2010) RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA Ao longo das últimas quatro décadas, desde a descoberta das penicilinas naturais, o avanço da indústria farmacêutica levou ao surgimento de diversos antimicrobianos, com espectro de ação cada vez mais amplo, porém não houve, paralelamente, a preocupação com as consequências futuras de tal desenvolvimento. Hoje, é notório o uso inadequado destes

32 29 antimicrobianos tendo como principal consequência a emergência de micro-organismos multirresistentes (Martins et al., 2000). Para que os antimicrobianos sejam utilizados adequadamente, conhecimentos específicos relacionados a estes, às características epidemiológicas dos pacientes e às infecções em questão, devem ser avaliados. A exposição aos antimicrobianos pode desencadear resistência bacteriana, mesmo quando empregado de forma correta. O uso inadequado desses fármacos agrava esta ocorrência, sendo este, o principal fator envolvido na emergência de micro-organismos multirresistentes, limitando as opções terapêuticas para o tratamento de processos infecciosos (Brasil, 1998). A multirresistência abrange muitos grupos bacterianos, inclusive Escherichia coli diarreiogênicas e comensais isoladas de diferentes fontes: intestinais e extraintestinais de humanos, animais e ambientais (Estrada-Garcia et al., 2005; Melo, 2006; Aslani et al., 2008; Ochoa et al., 2009; Gibson et al., 2010; Patoli et al., 2010; Johnson et al., 2010). Nos países em desenvolvimento, a multirresistência aos antimicrobianos sulfametoxazol-trimetoprim (SXT), ampicilina (AMP) e tetraciclina (TE) em E. coli diarreiogênicas isolada de pacientes com diarreia, é considerado um problema emergente (Estrada-Garcia et al., 2005; Oteo et al., 2005; Ochoa et al., 2009; Garcia et al., 2011). Estrada-Garcia et al. (2005), no México, evidenciaram que 73% das E. coli diarreiogênicas foram resistentes a ampicilina (AMP) e 65% ao sulfametoxazol-trimetoprima (SXT); além, do fenômeno de multirresistência (3 ou mais antimicrobianos) encontrado em 58% das amostras. Entre as diferentes categorias diarreiogênicas, pode-se constatar que a resistência a ampicilina (AMP) e ao sulfametoxazol-trimetoprim (SXT) foi maior entre ETEC (E. coli enterotoxigênica) e EAEC (E. coli enteroagregativa) do que entre EPEC-a (E. coli enteropatogênica atípica). No Peru, os percentuais de resistência a estes antimicrobianos foram maiores do que no México: 85% a ampicilina (AMP) e 65% a tetraciclina (TE). As multirresistências mais frequentes foram aos antimicrobianos AMP-SXT-TE e AMP-SXT, em 24% e 19% das amostras, respectivamente. A multirresistência variou de 44 a 100%, sendo a EAEC (E. coli enteroagregativa) a mais resistente entre as categorias diarreiogênicas (Ochoa et al., 2010). No Brasil, Garcia et al. (2011) encontraram menores percentuais de resistência entre E. coli diarreiogênicas, sendo 39,7% de resistência a tetraciclina (TE) e 30,9% a ampicilina e ao sulfametoxazol-trimetoprim (SXT), no entanto, identificaram resistência de 5,9% a cefalotina e de 3% a levofloxacina. A EAEC apresentou o maior percentual de resistência

33 30 (81%), seguida pela ETEC (62,8%) e EPEC (60%). A resistência aos antimicrobianos tem sido identificada como característica relevante entre EAEC, que já apresentou 81,5% de resistência com definição de 15 perfis distintos, sendo 11, com padrão de multirresistência (Regua-Mangia et al., 2009b). Sabe-se que antibioticoterapia é indicada apenas nos casos de infecções extraintestinais por Escherichia coli e outras enterobactérias, principalmente nas infecções urinárias, septecemias e outras, sendo desaconselhável nos casos de infecções intestinais (Silva, 2002; Brasil, 2009). Mesmo assim, observam-se quadros diarreicos causados por bactérias multirresistentes, sendo essa situação, reconhecida como um importante problema de saúde pública nos países em desenvolvimento e, sua investigação é prioritária para o Programa de Controle das Doenças Diarreicas estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (Vila et al., 1999). Em relação à resistência de Escherichia coli isoladas de ambientes aquáticos, Melo (2006) e Patoli et al. (2010), observaram que os maiores percentuais de resistência aos antimicrobianos foram detectados em ambientes com maior ação antrópica, sendo a presença de dejetos de origem humana ou animal, a principal fonte de contaminação da água por E. coli multirresistentes (Reinthaler et al., 2003). Os maiores percentuais de resistência dos isolados ambientais foram aos antimicrobianos ampicilina e acido nalidíxico, que são indicados no manejo clínico de casos diarreicos graves (Estrada-Garcia et al., 2005; Silva, 2002; Brasil, 2009) RELEVÂNCIA DA ANÁLISE CLONAL POR PFGE (PULSED FIELD GEL ELETROFORESIS) NA EPIDEMIOLOGIA DE ISOLADOS DE Escherichia coli A Eletroforese de Campo Pulsante (PFGE) é uma técnica de tipagem molecular baseada no estudo da similaridade cromossomal. Esta técnica consiste na separação de fragmentos de DNA de alto peso molecular, obtidos pela digestão do DNA genômico com enzimas de restrição com baixa frequência de corte (Gandra et al., 2008). É reconhecida como técnica padrão ouro para identificação de linhagens bacterianas e apresenta poder discriminatório elevado, sendo utilizada como instrumento eficaz para as análises de diversidade genética de diferentes micro-organismos e nos estudos de relações epidemiológicas (Persing & Tenover, 2004; Magalhães et al., 2005; Goering, 2010).

34 31 O PFGE vem sendo utilizado na rotina da pesquisa epidemiológica e molecular de Escherichia coli em diferentes contextos relacionados à saúde humana, dando resposta a uma série de questionamentos, como na determinação de possíveis fontes de infecções comunitárias e hospitalares para elucidação de surtos ou origem de contaminação (Regua- Mangia et al., 2003; Borges et al., 2010), na inspeção de alimentos e manipuladores de alimentos para avaliação do processo produtivo e qualidade do produto final (Badri et al., 2009; Campos et al., 2009) e, no estudo das relações genéticas entre amostras isoladas de humanos e animais para o reconhecimento de possíveis reservatórios e o esclarecimento das prováveis vias de transmissão (Santos et al., 2010; Chase-Topping et al., 2012). No Brasil, a maioria dos estudos com E. coli, utilizando PFGE, é desenvolvido com E. coli produtora de toxina de Shiga (STEC), que avalia a diversidade de fatores de virulência entre principais sorogrupos: O26, O111, O113 e O157, e demonstram a heterogeneidade genética entre amostras isoladas de humanos, de animais e de alimentos (Guth et al., 2002; Bastos et al., 2006; Vaz et al., 2006; Santos et al., 2010). A utilização do PFGE foi essencial para determinar aspectos epidemiológicos de EPEC atípicas. Enquanto as EPEC típicas raramente são isoladas de animais, sendo o homem seu principal hospedeiro suscetivel, as EPEC atípicas são isoladas de animais (cães, gatos, bovinos, macacos) e humanos e, os resultados dos perfis eletroforéticos gerados pelo PFGE permitiram a identificação de clones comuns entre humanos e animais, sendo possível considerar que animais atuam como reservatórios e fonte de infecção de EPEC atípica para humanos (Moura, 2009). Johnson et al. (2008) identificaram por meio do PFGE que E. coli uropatogênica (UPEC) isoladas de animais de companhia e de humanos apresentam os mesmos clones e que a trasmissão cruzada desta categoria de E. coli entre humanos e animais pode ocorrer no ambiente domiciliar. A técnica de PFGE permitiu o reconhecimento da diversidade genética entre amostras de Escherichia coli pertencentes aos mesmos sorotipos e a similaridade genética entre cepas de diferentes sorotipos e sorogrupos. Estes achados indicam que cepas pertencentes ao mesmo sorogrupo O podem ter evoluído separadamente umas das outras e que o sorogrupo O em si não deve ser tomado por indicador de relações genéticas entre as cepas de E. coli (Bando et al., 2007; Peroto, 2007). De acordo com Afset et al. (2008), a análise das relações genéticas, entre EPEC atípica isoladas de crianças com ou sem diarreia, por PFGE e MLST (Multilocus sequence typing),

35 32 permitiu evidenciar elevada heterogeneidade entre as amostras avaliadas e, que os resultados de PFGE confirmaram um padrão de infecção endêmica entre as crianças durante o período de estudo, demonstrando que o PFGE possuiu maior poder discriminatório do que o MLST na diferenciação entre EPEC atípicas não relacionadas epidemiologicamente.

36 OBJETIVOS Objetivo Geral Caracterizar genotípica e fenotipicamente os isolados de Escherichia coli diarreiogênicas de origem humana e ambiental identificados no Estado do Pará Objetivos Específicos Identificar sequências gênicas (eae, bfp, st, lt, stx, ipah, aggr) codificantes dos fatores de virulência em E. coli de origem humana e ambiental e classificá-las em categorias diarreiogênicas E. coli enteropatogênica - EPEC; E. coli enterotoxigênica - ETEC, E. coli produtora de Toxina Shiga - STEC, E. coli enteroinvasora EIEC e E. coli enteroagregativa - EAEC); Determinar e comparar as frequências de E. coli diarreiogênicas (EPEC, ETEC, STEC, EIEC e EAEC) entre as origens humana e ambiental; Identificar o perfil de suscetibilidade das E. coli diarreiogênicas frente aos antimicrobianos; Determinar e comparar a frequência e os fenótipos de resistência aos antimicrobianos entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana e ambiental e entre as categorias patogênicas; Determinar a variabilidade genética das categorias diarreiogênicas de E. coli de origem humana e ambiental; Avaliar e comparar os perfis de macrorrestrição das categorias diarreiogênicas de E. coli de acordo com a origem e data de isolamento.

37 34 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. AMOSTRAS BACTERIANAS O estudo incluiu um total de 410 amostras de Escherichia coli coletadas em projetos anteriores entre os anos de 2000 a 2012, sendo 344 de origem ambiental e 66 de origem humana Amostras Ambientais: Das 344 E. coli ambientais, 146 foram isoladas de águas superficiais de rio no entorno das ilhas Grande e Murutucu no município de Belém/PA, no período de 2002 a 2004; 106 foram isoladas de areia das praias de Mosqueiro e Salinópolis - Belém/PA, no ano de 2002 e, as 92 E. coli restantes foram isoladas de água de beber ou de consumo doméstico que abasteciam residências no município de São Sebastião da Boa Vista Marajó/PA, no ano de Amostras Humanas: Das 66 E. coli diarreiogênicas de origem humana (fezes), 24 foram provenientes de indivíduos HIV-positivo com ou sem diarreia, atendidos nas Unidades de Referência para doenças infecto-parasitárias localizadas em Belém/PA e identificadas segundo Costa et al. (2010). As demais 42 E. coli diarreiogênicas foram provenientes de indivíduos com ou sem diarreia residentes no município de Juruti-Pará e, identificadas segundo Sousa (2010). A seleção destas amostras e as informações referentes à data de isolamento e números de indivíduos positivos para E. coli diarreiogênicas foram obtidas por meio de consulta às fichas epidemiológicas e aos registros laboratoriais.

38 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS Reisolamento, reidentificação e manutenção das culturas de E. coli As amostras estavam estocadas em ágar nutriente e foram semeadas em tubos contendo caldo TSB (Tryptic Soy Broth, Merck) e incubadas à temperatura de ºC por horas. Após crescimento, as amostras foram plaqueadas em ágar MC (Mac-Conkey, Merck) e incubadas à temperatura de ºC por horas. Uma colônia isolada e representativa do cultivo foi semeada em tubos contendo ágar TSI (Triple Sugar Iron, Merck) e incubada à temperatura de ºC por horas. Após crescimento, as amostras foram repicadas para dois tubos contendo ágar nutriente, um deles foi direcionado para reidentificação bioquímica utilizando o sistema API 20E e outro mantido à temperatura ambiente para utilização no decorrer do trabalho. As amostras originais foram devolvidas e novamente estocadas nas coleções biológicas Detecção Molecular de E. coli diarreiogênicas A pesquisa das sequências gênicas para detecção molecular de E. coli diarreiogênicas foi realizada por PCR-multiplex e/ou PCR-monoplex seguindo as recomendações de Sousa (2010). As E. coli de origem ambiental foram testadas inicialmente por PCR-multiplex para triagem das E. coli diarreiogênicas e, posteriormente, por PCR-monoplex para confirmação e classificação. As E. coli de origem humana, já classificadas como E. coli diarreiogênicas, foram testadas apenas por PCR-monoplex para confirmação da presença dos genes característicos de cada categoria. Foram utilizadas cepas padrões de cada categoria diarreiogênica como controles positivos, além de um controle negativo (Quadro 1), cedidas pela Dra Tânia Vaz do Instituto Adolfo Lutz IAL / São Paulo. Quadro 1- Cepas de referência de Escherichia coli para PCR Cepas de Referência Categoria E2348/69 EPEC H10407 ETEC-LT/ST EDL1284 EIEC EDL933 STEC EAEC O42 EAEC E. coli K12 DH5α E. coli comensal

39 36 As E. coli diarreiogênicas foram classificadas de acordo com a presença dos seguintes genes ou sequências de DNA utilizando os critérios estabelecidos nos trabalhos de Campos et al. (2004) e Franzolin et al. (2005) (Quadro 2). Essa classificação orientou a seleção dos alvos moleculares utilizados na PCR. Quadro 2- Classificação molecular das categorias patogênicas de E. coli Categorias patogênicas EPEC típica EPEC atípica ETEC EIEC STEC Genes Característicos Gene eaea (intimina), gene bfpa (fímbria BFP) e/ou Região EAF com ausência dos genes stx-1 e stx-2 (toxina de Shiga) Gene eaea (intimina) com ausência dos genes stx-1 e stx-2 (toxina de Shiga) Genes codificadores das enterotoxinas LT (termolábil) e/ou ST (termoestável) Gene ipah (plasmídeo de invasão) Genes eaea (intimina) e stx (Stx-1 e/ou Stx-2); ou somente Stx-1 e/ou Stx-2 Gene aggr (ativador transcricional para AAF -fímbria de aderência EAEC agregativa) Fonte: Adaptado de Campos et al., 2004; Franzolin et al., Extração do DNA bacteriano A extração do DNA bacteriano foi realizada por fervura e congelamento seguindo às recomendações de Starnbach et al. (1989), Olsvik & Strockbine (1993) e Baloda et al. (1995) como descrito a seguir: um repique da cultura de trabalho foi transferida para tubo contendo 3 ml de caldo Luria, e incubado à temperatura de ºC por 12 horas; 1,5 ml da cultura foi transferido para um microtubo de 1,5 ml e centrifugado a g durante 5 minutos; o sobrenadante foi descartado, e o precipitado solubilizado em 400 L de água purificada (milli-q) estéril; a suspensão foi homogeneizada em agitador mecânico do tipo vortex e levada ao termobloco (100 ºC) por 10 minutos; após este tempo, a suspensão foi imediatamente, submetida à temperatura de _ 20º C para congelamento. após congelamento, a suspensão foi descongelada a temperatura ambiente e centrifugada a 9.660g por 5 minutos para separação e estocagem do sobrenadante a - 20 ºC.

40 37 Para realização do PCR-multiplex, a extração do DNA bacteriano foi reunida em grupos (pools) que continham 2 a 5 amostras de E. coli. Para PCR-monoplex o DNA foi extraído individualmente por amostra Reação em Cadeia mediada pela Polimerase Multiplex (PCR-multiplex) As reações foram realizadas com volume final de 25 µl, utilizando os componentes e suas respectivas concentrações de acordo com o Quadro 3. A descrição dos oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos genes de virulência está apresentada no Quadro 4. Os ciclos de temperaturas estão apresentados no Quadro 5 e para realização das ciclagens foi utilizado o aparelho termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems). Quadro 3- Componentes e concentrações utilizados na PCR-multiplex Componentes e concentrações Volume Água purificada estéril 4,75 Tampão de reação 10X (Invitrogen) 2,5 µl Cloreto de magnésio - MgCl 2 50mM (Invitrogen) 1,0 µl Desoxinucleotídeos - dntp 10mM (Invitrogen) 1,25 µl EAE 1/2 (10 pmol) BFP 1/ 2 (2,5 pmol) Stx f/r (2,5 pmol) (1,5 µl/1,5 µl) (1,0 µl/1,0 µl) (1,0 µl/1,0 µl) Iniciadores LT f/r (2,5 pmol) ST f/r (10 pmol) EI 1/2 (2,5 pmol) aggr1/ 2 (2,5 pmol) (0,5 µl/0,5 µl) (1,0 µl/1,0 µl) (0,5 µl/0,5 µl) (1,0 µl/1,0 µl) Platinum -Taq DNA Polymerase 5U/µL (Invitrogen) 0,5 µl DNA da Escherichia coli 2,0 µl Volume final da reação 25,0 µl

41 38 Quadro 4- Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCR-multiplex. Designação LT-f LT-r BFP-1 BFP-2 EAE-1 EAE-2 ST-f ST-r EI-1 EI-2 STX-f STX-r AggR-1 AggR-2 Sequência de oligonucleotídeos (5 3 ) GGCGACAGATTATACCGTGC CGGTCTCTATATTCCCTGTT AATGGTGCTTGCGCTTGCTGC GCCGCTTTATCCAACCTGGTA CTGAACGGCGATTACGCGAA CGAGACGATACGATCCAG ATTTTTMTTTCTGATTTRTCTT CACCCGGTACARGCAGGATT GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC GAGCGAAATAATTTATATGTG TGATGATGGCAATTCAGTAT GTATACAAAAGAAGGAAGC ACAGAATCGTCAGCATCAGC Fator de virulência (gene) Enterotoxina termolábil-lt (lt) Fímbria BFP (bfpa) Intimina (eaea) Enterotoxina termoestável-st (st) Plasmídeo de invasão (ipah) Toxina de Shiga 1 e 2 (Stx) Fimbria de aderência agregativa (aaf) Produto 450 pb 326 pb 917 pb 190 pb 600 pb 518 pb 254 pb Referência Aranda et al. (2004) Toma et al. (2003) Quadro 5- Programa de cliclagem utilizado na PCR-multiplex Estágios Etapas Temperatura Tempo Nº de Ciclos Estágio 1 Desnaturação 95 C 7 min. 1 Hibridização 60 C 1 min. Estágio 2 Extensão 72 C 1 min e 20 seg. 15 Desnaturação 94 C 1 min. Hibridização 55 C 1 min. Estágio 3 Extensão 72 C 1 min e 20 seg. 25 Desnaturação 94 C 1 min. Estágio 4 Extensão 72 C 30 min Reação em Cadeia mediada pela Polimerase - Simples (PCR-monoplex) A PCR-monoplex foi realizada em três situações: 1ª) confirmação das E. coli ambientais que apresentaram amplificação para um ou mais genes investigados na PCRmultiplex, 2ª) confirmação das E. coli humanas já identificadas como E. coli diarreiogênicas e 3ª) diferenciação dos genes que codificam para as toxinas de Shiga 1 e 2 (Stx-1 e 2) em STEC. As reações de PCR-monoplex foram realizadas com volume final de 25 µl, utilizando os componentes e suas respectivas concentrações de acordo com o Quadro 6. A descrição dos oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos genes está apresentada no Quadro 4 (1ª e 2ª situação) e Quadro 7 (3ª situação). Os ciclos de temperaturas estão apresentados no Quadro 8 e para realização das ciclagens foi utilizado o aparelho termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems).

42 39 Quadro 6 - Componentes e concentrações utilizados na PCR-monoplex Componentes Quantidade Água purificada estéril 17 L Tampão de reação 10X (Invitrogen) 2,5 L Cloreto de magnésio - MgCl 2 50mM (Invitrogen) 0,75 L Desoxinucleotídeos - dntp 10mM (Invitrogen) 1,25 µl Oligonucleotídeos - 2,5pmol/ L (Invitrogen) 1,0 L/1,0 L Platinum -Taq DNA Polymerase 5U/µL (Invitrogen) 0,5 L DNA da Escherichia coli 1,0 L Volume final da reação 25 L Quadro 7 - Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCR-monoplex Designação STX- 1a STX- 1b STX- 2a STX- 2b Sequência de oligonucleotídeos (5 3 ) CAACACTGGATGATCTCAG CCCCCTCAACTGCTAATA ATCAGTCGTCACTCACTGGT CTGCTGTCACAGTGACAAA Fator de virulência/gene Toxina de Shiga -1 (stx1) Toxina de Shiga -2 (stx2) Produto 349 pb 110 pb Referência Pal et al. (1999) Quadro 8 - Programa de cliclagem utilizado na PCR-monoplex Etapas Temperatura Tempo Nº de Ciclos Desnaturação Inicial 95 C 5 min. 1 Desnaturação 95 C 1 min. Hibridização C 1 min. 40 Extensão 72 C 1 min. Extensão Final 72 C 10 min Eletroforese Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2,0% contendo 1,5 µl de Sybr Safe (Invitrogen) para visualização e determinação dos fragmentos de DNA amplificados. Juntamente com as amostras, os controles positivos e o marcador de peso molecular (Ready-load 100pb DNA Ladder, Invitrogen) foram aplicados aos géis para comparação. A corrida eletroforética foi realizada sob voltagem máxima e constante de 100 V em tampão TE (Tris-EDTA Buffer) por 1 hora. Após a corrida, os géis foram visualizados em

43 40 transiluminador (luz ultravioleta) para análise visual dos fragmentos de DNA amplificados e, o registro fotográfico foi realizado pelo sistema de fotodocumentação UPV Biolmaging Systems (EpiChemi Darkroom) Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos A suscetibilidade aos agentes antimicrobianos das E. coli diarreiogênicas foi avaliada pelo método de difusão em sistema de disco, de acordo com Bauer et al. (1966), observando as recomendações do Clinical and Laboratory Standards (CLSI, 2012) Preparo do inóculo Cada amostra de E. coli foi repicada para tubos contendo caldo Mueller-Hinton (Oxoid) e incubadas à temperatura de 35 C durante 24 horas. Após esse período, foram novamente repicadas para outro tubo contendo caldo Mueller-Hinton (Oxoid) e incubadas à temperatura de 35 C por 6 horas para obtenção do inóculo equivalente a 0,5 da escala de Mc Farland que corresponde a 1,5 x 10 8 UFC/mL. A concentração do inóculo foi observada por meio de densitômetro (VITEK Densichek - biomèrieux) Semeadura nas placas A partir da suspensão bacteriana equivalente a 0,5 da escala de Mc Farland e com auxílio de um swab (J.Prolab), cada amostra foi semeada na superfície das placas contendo 4,0 mm de altura de ágar Mueller Hinton (Oxoid). O swab foi aplicado sobre toda a superfície do meio de cultura por três vezes, girando a placa num ângulo de 60 após cada aplicação. Para finalizar a semeadura, o swab foi aplicado ao redor das bordas da superfície do ágar e as placas permaneceram por 10 minutos à temperatura ambiente com tampa fechada para secagem do inóculo Aplicação dos discos de antimicrobianos A aplicação dos discos de antimicrobianos foi realizada com auxílio do dispensador automático Disc dispenser (Oxoid). Em seguida, as placas foram incubadas à temperatura de 35 C por horas. Foram utilizados os antimicrobianos (Oxoid) a seguir nas respectivas concentrações: ampicilina 10µg (AMP), amoxicilina 20µg / ácido clavulânico 10µg (AMC), cloranfenicol 30µg (C), ceftazidima 30µg (CAZ), ciprofloxacina 5µg (CIP), gentamicina

44 41 10µg (CN), cefotaxima 30µg (CTX), nitrofurantoína 300µg (F), ácido nalidíxico 30µg (NA), sulfametoxazol 23,75µg / trimetoprim 1,25µg (SXT), tetraciclina 30µg (TE) e canamicina 30µg (K) Leitura e interpretação do teste O diâmetro das zonas de inibição foi medido com auxílio de um paquímetro (Digimatic Caliper, Mitutoyo Corporation) e a interpretação do diâmetro dos halos foi realizada conforme especificações apresentadas no Quadro 9 (CLSI, 2012). Foram consideradas resistentes as amostras que apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano e amostras multirresistentes as que apresentaram resistência simultânea a três ou mais antimicrobianos com diferentes mecanismos de ação (Magiorakos et al., 2012). Quadro 9- Interpretação do diâmetro dos halos de inibição aos antimicrobianos utilizados Agentes Concentração Diâmetro do halo de inibição (mm)* Antimicrobianos /Disco Resistentes Intermediários Sensíveis Ácido nalidíxico (NA) 30µg 13 ou menos ou mais Ampicilina (AMP) 10µg 13 ou menos ou mais Amoxicilina Acido 20µg/10µg 13 ou menos ou mais Clavulânico (AMC) Canamicina (K) 30µg 13 ou menos ou mais Ceftazidima (CAZ) 30µg 14 ou menos ou mais Cefotaxima (CTX) 30µg 14 ou menos ou mais Ciprofloxacina (CIP) 5µg 15 ou menos ou mais Cloranfenicol (C) 30µg 12 ou menos ou mais Gentamicina (CN) 10µg 12 ou menos ou mais Nitrofurantoína (F) 300µg 14 ou menos ou mais Sulfametoxazol 23,75µg /1,25µg 10 ou menos ou mais trimetoprim (SXT) Tetraciclina (TE) 30µg 14 ou menos ou mais * Milímetros O controle de qualidade da potência dos discos de antimicrobianos foi realizado com cepas padrões de Escherichia coli (ATCC ) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC: 27853) Eletroforese em Gel de Campo Pulsante (PFGE) A identificação dos perfis de macrorrestrição das amostras de E. coli diarreiogênicas foi realizada por meio de extração e digestão do DNA genômico por enzima de restrição, seguido de eletroforese em gel de campo pulsante (PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis)

45 42 utilizando o sistema Contour-Clamped Homogeneuos Electric Field DRIII apparatus (CHEF- DR III/ Bio-Rad). As etapas e os procedimentos realizados estão descritos abaixo e foram realizados conforme as recomendações de Gautom (1997) Preparo da suspensão bacteriana As amostras foram semeadas em tubos contendo 5 ml de caldo TSB (Tryptic Soy Broth, Merck) e incubadas à temperatura de 37 ºC por 18 horas. Após esse período, as amostras foram semeadas em placas contendo meio TSA (Tryptic Soy Agar, Merck) e incubadas nas mesmas condições anteriores para obtenção de colônias isoladas. A partir de uma colônia, a amostra bacteriana foi semeada em placa contendo meio TSA (Tryptic Soy Agar) para obtenção de crescimento confluente após incubação à temperatura de 37 C por 18 horas. A partir desse crescimento confluente e com o auxílio de swab foi preparada uma suspensão bacteriana em 3 ml de solução tampão TE (Tris EDTA Apêndice 1.3) até a obtenção de turbidez igual a 1 da escala de Mc Farland que corresponde a 3,0 x 10 8 UFC/mL Montagem dos blocos de agarose Uma alíquota de 300 µl da suspensão bacteriana de cada amostra foi transferida para um microtubo de 1,5 ml e adicionado 15 µl de proteinase K (20mg/mL) para obtenção de uma concentração final de 1mg/mL. Em seguida, foi preparada uma solução de agarose (Seakem Gold Agarose, Lonza) a 1,2%, em tampão TE (Apêndice 1.3). O volume de 300 µl desta agarose foi distribuído para os tubos contendo a suspensão bacteriana mais a proteinase K. Antes da solidificação e com o auxílio de uma micropipeta, as amostras foram suavemente homogeneizadas e distribuídas em moldes apropriados (Bio-Rad Laboratories) para a confecção dos blocos (plugs) de agarose. Foram preparados três blocos por amostra Processo de lise in situ Após solidificação à temperatura ambiente por 10 minutos, os blocos de agarose, referentes a cada amostra, foram transferidos para distintos tubos cônicos de 50 ml contendo 10 ml de solução de lise celular (Apêndice 1.8) e incubados à temperatura de 54 C por 2 horas para que ocorresse o processo de lise celular e liberação do DNA cromossômico in situ.

46 43 Após incubação, a solução de lise foi desprezada e os blocos de agarose foram lavados a fim de eliminar todos os resíduos do processo de lise celular. Foram realizadas duas lavagens com 10 ml de água milli-q esterilizada (pré-aquecida à temperatura de 50 o C) na qual os tubos permaneceram incubados por 15 minutos em banho maria à temperatura de 50 C, seguida de mais quatro lavagens com 10 ml de solução tampão TE (Apêndice 1.3) repetindo-se as condições de tempo e incubação (15 minutos a 50 ºC). Após a última lavagem, os blocos de agarose foram mantidos em solução tampão TE e armazenados à temperatura de 4 C, até o momento de uso Digestão do DNA com a enzima de Restrição Xba I Para cada amostra foi selecionado um bloco de agarose do qual foi retirado um corte de 2 mm com o auxílio de lâmina e de bisturi. Este corte foi transferido para microtubos de 1,5 ml contendo 200 µl de solução de pré-digestão (solução tampão da enzima de restrição XbaI à 10% (Roche) e incubado à temperatura de 37 ºC por 10 minutos. Em seguida, a solução de pré-digestão foi retirada e substuida por 200 µl da solução de digestão (Apêndice 1.11) contendo a enzima de restrição Xba I (Roche) na concentração de 50U por amostra e os tubos foram novamente incubados à temperatura de 37 C por 18 a 24 horas. A enzima de restrição Xba I reconhece o DNA alvo na sequência T/CTAGA. A cepa padrão universal Salmonella Braenderup H9812 foi utilizada como controle do processo de digestão das amostras Montagem do gel de corrida e condições eletroforéticas Após o período de digestão, o corte de 2 mm foi colocado nos orifícios de um gel de agarose e em seguida esses orifícios foram selados com o próprio gel para que as frações não se desprendessem. Este gel de agarose (For Pulsed Field Electrophoresis: Running Gel/ Sigma) foi preparado na concentração de 1% em TEB 0,5X (Apêndice 1.10) e montado sobre o molde do próprio aparelho CHEF-DR III System (Bio-Rad). Nas posições externas e centrais dos géis foi utilizado o marcado de peso molecular de 48,5 a 1018,5 KB (Lambda Ladder PFGE marker/biolabs, Beverly, MA, USA). A separação dos fragmentos de DNA do cromossoma bacteriano clivado pela enzima de restrição foi realizada em sistema de eletroforese do tipo CHEF-DR III System (Bio-Rad) utilizando tampão de corrida TE 0,5X (Apêndice 1.10) sob as seguintes condições

47 44 eletroforéticas: tempo de pulso inicial de 5 segundos e final de 30 segundos por 24 horas, ângulo de 120º, gradiente de 6 V/cm correspondendo aproximadamente a V, velocidade de recirculação do tampão de 70 e temperatura de 14 ºC Coloração e fotodocumentação do gel de agarose Após a eletroforese, o gel foi corado por imersão em solução de brometo de etídio (5mg/mL) por 30 minutos e em seguida lavado uma vez com água milli-q destilada. Os perfis de marrestrição foram visualizados sob iluminação ultravioleta e as imagens capturadas no formato TIFF e digitalizadas pelo sistema de fotodocumentação GEL LOGIC 2200 Imaging System (Molecular Imaging System, Carestream Health, Inc.) Interpretação e análise dos perfis de macrorrestrição gerados pelo PFGE Os perfis de macrorrestrição foram analisados com o auxílio do programa de computação Software Bionumerics Versão 6.5 (Applical Maths, Inc., Austin, TX) que permitiu a comparação entre diferentes perfis eletroforéticos (diferentes géis) que apresentaram em comum uma mesma escala de referência (marcador de peso molecular). As bandas foram selecionadas automaticamente pelo programa e em seguida, procedeu-se a inspeção visual para correção. Os perfis considerados geneticamente idênticos foram aqueles que apresentaram percentual de similaridade de 100%, e aqueles com uma ou mais bandas foram considerados diferentes. O grau de homologia entre as amostras foi determinado pelo coeficiente de Dice e a correlação para agrupamento e construção do dendoograma foi calculada por UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) com tolerância de 2,5%. O algorítimo (cluster cut off algorithm) do Bionumerics Version 6.5 foi utilizado para a definição dos agrupamentos significantes APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS As informações referentes à origem e data de isolamento das E. coli diarreiogênicas e os resultados sobre fatores de virulência e fenótipos de resistência foram organizados em banco de dados utilizando-se o programa Microsoft Office Access 2007 e apresentados por meio de gráficos ou tabelas gerados pelo programa Microsoft Office Excel 2010.

48 45 Para análise estatística, foram realizados o teste binomial para duas proporções, o teste exato de Fisher e o teste X 2 de partição para comparação entre as variáveis, estes testes foram executados por meio do programa BioEstat Versão 5.0 (Ayres et al., 2007) considerando o nível de confiança de 95% (p 0,05) ASPECTOS ÉTICOS O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (CEP) do Instituto Evandro Chagas com registro CEP/IEC Nº 0046/11 (CAAE: ) (Apêndice 2).

49 46 3. RESULTADOS 3.1 FREQUÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS Do total de 344 amostras de E. coli de origem ambiental, seis (1,74%) foram classificadas como E. coli diarreiogênicas. Estas amostras foram identificadas apenas entre as E. coli isoladas de água superficial de rio e, dentro desta amostragem, o percentual foi de 4,11% (6/146) (Tabela 1). Destas seis amostras, três foram provenientes do entorno da ilha Murutucu e três da ilha Grande. Tabela 1- Frequência das E. coli diarreiogênicas de origem ambiental de acordo com a origem de isolamento. Isolamento de origem Escherichia coli avaliadas Escherichia coli diarreiogênica ambiental Nº Nº % Agua superficial de rio ,11 Agua de beber/consumo Areia de Praia Total ,74 Todas as 66 E. coli de origem humana foram confirmadas como diarreiogênicas e foram isoladas das fezes de 64 indivíduos. Em dois deles foram detectadas infecções mistas por dois tipos diferentes de E. coli diarreiogênica (EPEC+EAEC e EPEC+EIEC). Considerando o número de indivíduos participantes destes projetos, o percentual de ocorrência de E. coli diarreiogênica de origem humana foi de 13,36% (64/479) (Tabela 2). Tabela 2- Frequência de E. coli diarreiogênicas de origem humana de acordo com a origem de isolamento. Isolamento de origem humana Indivíduos Participantes Indivíduos com Escherichia coli diarreiogênica Nº Nº % Portadores do HIV ,25 Indivíduos de Juruti-PA ,09 Total ,36 As diferenças entre estes percentuais (1,74% e 13,36%) ou (4,11% e 13,36%) foram estatisticamente significantes (Teste binomial: p<0,0001 e p=0,0019, respectivamente),

50 47 demonstrando que houve diferença quanto à frequência de E. coli diarreiogênica entre as origens ambiental e humana. As 66 E. coli de origem humana e as seis de origem ambiental perfazem um total de 72 E. coli diarreiogênicas que estão distribuidas em cinco categorias, sendo a E. coli enterotoxigênica-etec a mais frequente (29,17%-21/72), seguida pelas E. coli enteropatogênica-epec e E. coli agregativa-eaec (ambas com 26,39%-19/72), E. coli enteroinvasora-eiec (15,28%-11/72) e E. coli produtora de toxina de Shiga-STEC (2,78%- 2/72) (Figura 5). Figura 5- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com a categoria patogênica. ETEC: E. coli enterotoxigênica; EPEC: E. coli enteropatogênica; EAEC: E. coli enteroagregativa; EIEC: E. coli enteroinvasora; STEC: E. coli produtora de toxina de Shiga. De acordo com as origens de isolamento, as ETEC (3,96%-19/479), EAEC (3,76%- 18/479) e as EPEC atípicas (3,34%-16/479) foram as mais frequentes entre as amostras humanas, seguidas pela EIEC (2,29%-11/479) e STEC (0,41%-2/479). Entre as amostras ambientais foram detectadas ETEC e EPEC atípica na frequência de 0,58% (2/344) (ambas) e EPEC típica e EAEC, ambas com frequência de 0,29% (1/344) (Tabela 3).

51 48 Tabela 3- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com a origem de isolamento. E. coli diarreiogênicas e Fatores de Origem de Isolamento Virulência Humana (479) a Ambiental (344) b Nº (%) Nº (%) Total p-valor c ETEC d 19 (3,96) 2 (0,58) 21 0,9930 LT (Enterotoxina termolábel) ,000 ST (Enterotoxina termoestável) ,000 ST e LT ,000 EPEC e atípica 16 (3,34) 2 (0,58) 18 0,6326 EPEC e típica 0 ( - ) 1 (0,29) 1 0,0833 EAEC f 18 (3,76) 1 (0,29) 19 0,6795 EIEC g 11 (2,29) 0 ( - ) 11 0,5812 STEC h 2 (0,41) 0 ( - ) 2 1,000 Stx Stx-1, Stx-2 e Intimina/EAE Somatória das linhas em negrito a Número total de indivíduos; b Número de amostras avaliadas; c Teste exato de Fisher. d ETEC: E. coli enterotoxigênica; e EPEC: E. coli enteropatogênica; f EAEC: E. coli enteroagregativa; g EIEC: E. coli enteroinvasora; h STEC: E. coli produtora de toxina de Shiga. Das 19 ETEC identificadas de origem humana, sete (36,84%) foram positivas para enterotoxina termolábil (LT), oito (42,10%) para enterotoxina termoestável (ST) e quatro (21,06%) para as duas enterotoxinas (ST e LT). Destas duas ETEC de origem ambiental, uma foi ETEC-LT e outra ETEC-ST. Entre as 19 EPEC, 18 (94,7%) foram classificadas como EPEC atípicas produtoras da proteína de adesão íntima (intimina/eae- E. coli attachmenteffacement) e apenas uma foi classificada como típica (1,36%) de origem ambiental, que apresentou além da proteína intimina, a fímbria BFP (Bundle Forming Pilus). Das 18 EPEC atípicas, 16 foram de origem humana e duas de origem ambiental. As EIEC (2,29%) e as STEC (0,41%) foram identificadas apenas entre as amostras de origem humana. Entre as duas STEC, uma foi positiva apenas para toxina de Shiga tipo 1 (Stx-1) e a outra positiva para Stx- 1 e 2 além de apresentar a proteína intimina/eae (Tabela 3). A diferença de ocorrência de cada categoria de E. coli diarreiogênica considerando as origens de isolamento (humana e ambiental) não foi estatisticamente significativa (p> 0,05). A relação das 72 E. coli diarreiogênicas e a distribuição dos genes que codificam os fatores de virulência que permitiram a classificação das mesmas em categorias patogênicas ou patotipos estão demonstradas no Apêndice 3 e as amplificações referentes aos alvos

52 49 moleculares que permitiram a identificação das categorias de E. coli diarreiogênicas podem ser observados abaixo na Figura 6. eae (917pb) ipah (600pb) stx (518pb) lt (450pb) bfp (326pb) aggr (254pb) st (190pb) Figura 6- Amplificação dos alvos moleculares gerados pelo PCR-multiplex. Linha 1: Ladder 1 Kb, linha 2: Mix de DNA das cepas padrões de E. coli diarreiogênica, linha 3 a 9: Controles positivos para observação da amplificação individual dos alvos moleculares.

53 PELFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS E FENÓTIPOS DE RESISTÊNCIA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS. A resistência antimicrobiana entre as E. coli diarreiogênicas foi de 51,39% (37/72) (Figura 7) sendo de 53,03% (35/66) entre as de origem humana e de 33,33% (2/6) entre as de origem ambiental (Tabela 4). A diferença de resistência entre E. coli diarreiogênicas de origem humana e ambiental não foi significativa (p=0,4230). Figura 7- Frequência de resistência aos antimicrobianos entre as E. coli diarreiogênicas. Tabela 4- Frequência da resistência antimicrobiana de E. coli diarreiogênica de acordo com as origens de isolamento. Origem de isolamento E. coli diarreiogênicas E. coli diarreiogênica resistentes Nº Nº % Humana ,03 Ambiental ,33 Total ,39 Teste exato de Fisher: (Humana x Ambiental) p=0,4230

54 51 A resistência entre as E. coli diarreiogênicas foi mais frequente aos antimicrobianos sulfametoxazol-trimetoprim (44,44% - 32/72), ampicilina (40,28% - 29/72) e tetraciclina (33,33% - 24/72) e, considerada estatisticamente significativa (X 2 de partição= 98,2252; p>0,0001) quando comparada à resistência ao cloranfenicol (11,12% - 8/72), a amoxicilinaácido clavulânico (5,56% - 4/72), a canamicina (2,77% - 2/72) e a gentamicina (1,39% - 1/72) (Tabela 5). Ao se comparar os percentuais de resistência aos três principais antimicrobianos sulfametoxazol-trimetoprim, ampicilina e tetraciclina, observou-se que não houve diferença estatística de resistência entre os mesmos (X 2 de partição= 2,4597; p=0,1168). Todas as E. coli diarreiogênicas foram sensíveis aos antimicrobianos ácido nalidíxico, ceftazidima, cefotaxima e ciprofloxacina (Tabela 5). Tabela 5- Perfil de suscetibilidade entre as E. coli diarreiogênicas de acordo com os antimicrobianos utilizados. Antimicrobiano Perfil de Suscetibilidade (72)* Sensível % Intermediário % Resistente % Acido Nalidixico , Ampicilina 41 56,94 2 2, ,28 Amoxicilina-ácido clavulânico 64 88,88 4 5,56 4 5,56 Canamicina 48 66, ,56 2 2,77 Ceftazidima , Cefotaxima , Ciprofloxacina , Cloranfenicol 64 88, ,12 Gentamicina 68 94, ,39 Nitrofurantoina 69 95,83 3 4,17 0 0,00 Sulfametoxazol trimetoprim 39 54,17 1 1, ,44 Tetraciclina 43 59,72 5 6, ,33 * Número de amostras avaliadas.

55 52 Entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana, destacam-se os percentuais de resistência aos antimicrobianos sulfametoxazol-trimetoprim (46,97% - 31/66), ampicilina (40,91% - 27/66), tetraciclina (34,85% - 23/66) e cloranfenicol (10,61% - 7/66). As E. coli diarreiogênicas de origem ambiental foram resistentes à ampicilina e amoxicilina-ácido clavulânico, ambos (40,00%-2/6) e, aos antimicrobianos cloranfenicol, sulfametoxazoltrimetoprim e tetraciclina (20% -1/6) (Figura 8). A diferença percentual de resistência à amoxicilina-ácido clavulânico foi a única significativa entre os dois grupos, sendo as E. coli diarreiogênicas de origem ambiental, as mais resistentes a este antimicrobiano do que as de origem humana (Teste exato de Fisher: p=0,0228). Figura 8- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com a origem de isolamento. AMP: Ampicilina; AMC: Amoxicilina-Acido Clavulânico; K: Canamicina; C: Cloranfenicol; CN: Gentamicina; SXT: Sulfametoxazol trimetoprim; TE: Tetraciclina.

56 53 Avaliando-se a resistência antimicrobiana por categoria de E. coli diarreiogênica, verificou-se que a EPEC (X 2 de partição=6.5469; p=0,0108) e a EAEC (X 2 de partição=6.5769; p=0,0103) apresentaram resistência significativa aos antimicrobianos ampicilina, sulfametozaxol-trimetoprim (ambos 63,16% - 12/16) e tetraciclina (36,84% - 7/19 e 47,37% - 9/19, respectivamente). As ETEC (X 2 de partição=6.5469; p=0,0105) foram significativamente resistentes à ampicilina (33,33%-7/21) e ao sulfametozaxol-trimetoprim (28,57%-6/21), enquanto as EIEC (X 2 de partição=5.3036; p=0,0213) apresentaram resistência significativa aos antimicrobianos sulfametozaxol-trimetoprim (45,45% - 5/11) e tetraciclina (54,55% - 6/11). Entre as duas STEC foi observada resistência ao sulfametozaxoltrimetoprim (50,00% - 1/2) e à tetraciclina (50,00% - 1/2) (Tabela 6). Analisando-se a resistência entre os principais antimicrobianos de cada categoria, observou-se que não houve diferença estatística da resistência entre os mesmos (Tabela 6). Tabela 6- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com as categorias patogênicas. E. coli diarreiogênicas Antimicrobiano ETEC (21)* EPEC (19)* EAEC (19)* EIEC (11)* STEC (2)* Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Ampicilina 7 33, , ,16 1 9, Amoxicilina /Ac. Clavulânico 1 4, ,53 1 5, Canamicina , Cloranfenicol , , Gentamicina , Sulfametoxazol trimetoprim 6 28, , , , ,00 Tetraciclina 1 4, , , , ,00 * Número de amostras avaliadas

57 54 Foram identificados 13 diferentes fenótipos de resistência antimicrobiana variando de um a cinco antimicrobianos e distribuídos entre 37 E. coli diarreiogênicas. Os mais frequentes fenótipos de resistência entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana foram AMP-SXT-TE (25,71% - 9/35), AMP-SXT (22,86% - 8/35) e SXT-TE (17,14% - 6/35). Dois fenótipos de resistência foram identificados entre as amostras ambientais, sendo um deles, representado por cinco antimicrobianos (AMP-AMC-C-SXT-TE) e o outro por dois (AMP-AMC). O fenótipo ambiental AMP-AMC-C-SXT-TE também ocorreu entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana na frequência de 5,71% (2/35), no entanto, o fenótipo AMP-AMC foi exclusivo de amostra ambiental (Tabela 7). Das 37 E. coli diarreiogênicas que apresentaram resistência, 17 (45,94%) foram multirresistentes. Tabela 7- Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com a origem de isolamento. Origem de isolamento Fenótipos de Resistência Humana Ambiental Total de Fenótipos Nº % Nº % Nº % AMP-K-C-CN-SXT 1 2, ,70 AMP-K-C-SXT-TE 1 2, ,70 AMP-AMC-C-SXT-TE 2 5, ,00 3 8,11 AMP-C-SXT-TE 2 5, ,41 AMP-C-SXT 1 2, ,70 AMP-SXT-TE 9 25, ,32 AMP-SXT 8 22, ,62 AMP-AMC ,00 1 2,70 AMP-TE 2 5, ,41 SXT-TE 6 17, ,22 SXT 1 2, ,70 TE 1 2, ,70 AMP 1 2, ,70 Total de fenótipos , , ,00

58 55 A E. coli diarreiogênica que apresentou maior frequência e diversidade de fenótipos de resistência foi a EAEC (73,68% - 14/19). Em seguida, destacou-se as frequências de EIEC (54,54% - 6/11) e EPEC (42,10% - 8/19), porém estas diferenças não foram significativas (X 2 de partição=3.9075; p=0,1417). Entre as EAEC e as EPEC o fenótipo mais comum foi AMP- SXT-TE, com percentuais de 28,60% (4/14) e 37,50% (3/8), respectivamente. Entre as ETEC, o mais frequente foi AMP-SXT (83,33% - 5/6) e entre as EIEC o SXT-TE (66,66% - 4/6). Os fenótipos constituídos por cinco ou quatro antimicrobianos foram identificados somente entre amostras de EAEC e EPEC, sendo o AMP-AMC-C-SXT-TE e o AMP-C-SXT-TE presentes nestas duas categorias enquanto os fenótipos AMP-K-C-CN-SXT e AMP-K-C-SXT-TE, envolvendo a canamicina, ocorreram somente entre as EAEC (Tabela 8). Tabela 8- Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com as categorias patogênicas. Origem de Isolamento E. coli diarreiogênica Fenótipos de Resistência Frequência Nº % ETEC (6/21)* (28,57%)** AMP-SXT-TE 1 16,64 AMP-SXT 5 83,33 EPEC (8/19)* (42,10%)** AMP-AMC-C-SXT-TE 1 12,50 AMP-C-SXT-TE 1 12,50 AMP-SXT-TE 3 37,50 AMP-SXT 2 25,00 AMP-TE 1 12,50 EAEC (14/19)* (73,68)** AMP-K-C-CN-SXT 1 7,14 Humana AMP-K-C-SXT-TE 1 7,14 AMP-AMC-C-SXT-TE 1 7,14 AMP-C-SXT-TE 1 7,14 AMP-C-SXT 1 7,14 AMP-SXT-TE 4 28,60 AMP-SXT 1 7,14 AMP-TE 1 7,14 SXT-TE 1 7,14 SXT 1 7,14 AMP 1 7,14 EIEC (6/11)* (54,54%)** AMP-SXT-TE 1 16,67 SXT-TE 4 66,66 TE 1 16,67 STEC (1/2)* (50,00%)** SXT-TE 1 100,00 Ambiental ETEC (1/2)* (50,00%)** AMP-AMC 1 100,00 EPEC atípica (1/2)* (50,00)** AMP-AMC-C-SXT-TE 1 100,00 * Número de amostras resistentes por número de amostras avaliadas. ** Percentual de amostras resistentes.

59 VARIABILIDADE GENÉTICA DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS Na análise do perfil de macrorrestrição cromossômica pela enzima Xba I foram tipadas 70 das 72 E. coli diarreiogênicas identificadas. As duas amostras não tipadas apresentaram degradação do DNA genômico, mesmo após inúmeras tentativas de extração. Estas amostras foram identificadas como ETEC-ST, uma de origem ambiental e outra humana. Entre as 70 E. coli diarreiogênicas foram identificados 67 distintos perfis de macrorrestrição com número mínimo de 13 e máximo de 23 fragmentos variando na faixa de 48,5 a 485,0 kb. A demonstração da variação dos tamanhos dos fragmentos de macrorrestrição e da corrida eletroforética está apresentada abaixo na Figura ,0 kb 436,5 kb 388,0 kb 339,5 kb 291,0 kb 242,5 kb 194,0 kb 145,5 kb 97,0 97,0 kb 48,5 kb Figura 9- Perfis de macrorrestrição de E. coli diarreiogênicas gerados pela enzima Xba I por meio do método de PFGE. Linhas 1, 7 e 13: Marcador de peso molecular (48,5 a 1018,5 kb); linhas 2-6 e 8-10: E. coli diarreiogênicas com perfil de macrorrestrição; linha 11: ETEC 615 (ambiental) com degradação do DNA genômico; linha 12: Salmonella Braenderup. Uma ampla variabilidade genética foi detectada na análise global das amostras deste estudo, estando as categorias de E. coli diarreiogênicas dispostas em diferentes topologias do dendograma (Figura 10).