ALIMENTAÇÃO AZOTADA DAS LEVEDURAS

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1 GRANES ET AL. ALIMENTAÇÃO AZOTADA DAS LEVERURAS, PAG. 1 ALIMENTAÇÃO AZOTADA DAS LEVEDURAS Daniel GRANÈS, Edouard MÉDINA, Lucile BLATEYRON, Céline ROMÉRO, Eric BRU, Christophe ROUX, Caroline BONNEFOND, Agnès PIPERNO, Myriam ROUANET, Thomas OUI ICV Montpellier, France Flash Info Vendanges septembre 26 As necessidades de azoto das leveduras No mundo dos seres vivos, o azoto é um elemento essencial que entra na composição dos ácidos aminados, dos prótidos e das proteínas. No caso das leveduras, estas proteínas são elementos constitutivos da célula e dos seus organitos (proteínas de estrutura) ou das enzimas que intervêm como transportadores ou nas reacções metabólicas (proteínas funcionais). O azoto é assim um factor chave para a multiplicação e actividade fisiológica das leveduras. Quando se fala de azoto, considera-se o conjunto das moléculas que contém um ou mais átomos de azoto. Portanto, nem todo o azoto é utilizável pelas leveduras: P. Barre, V. Jiranek e outros definiram o azoto assimilável como a quantidade de azoto em mg / L disponível e susceptível de ser utilizado pela levedura. Neste trabalho, quando se fala de azoto, referimo-nos sempre a esta definição, salvo indicação em contrário. O azoto assimilável é constituído por azoto amoniacal e por ácidos aminados. Alguns ácidos aminados, como a prolina não são assimiláveis pelas leveduras. A determinação do azoto assimilável considera apenas os ácidos assimiláveis. Em meio sintético e em cultura pura, a fermentação completa de 2 g / L de açúcar (aproximadamente 12º potenciais) só é conseguida com teores iniciais de azoto assimilável superiores a 15 mg / L, sendo este valor considerado como o nível de carência absoluta. Ao contrário de outras leveduras, a Saccharomyces cerevisiae não possui protease externa e por este motivo não pode hidrolisar os péptidos e as proteínas para recuperar os ácidos aminados. Por conseguinte, o azoto assimilável pode representar menos de 5% do azoto total. A quantidade de azoto assimilável pelas leveduras tem quatro efeitos importantes e parcialmente dependentes uns dos outros: A multiplicação celular aumenta com adições de azoto que são eficazes quando são efectuados durante a primeira metade da fermentação (ou seja a aproximadamente 15 de densidade) depois diminui progressivamente até se tornar nula no último terço da FA (ou seja depois de 13 de densidade). Uma parte do azoto assimilável está incorporada nas proteínas de estrutura que são necessárias para a construção de novas células. Sablayrolles (INRA) demonstrou por outro lado que é perigoso adicionar demasiado azoto (verificar cálculo das necessidades médias de azoto durante a FA em função do grau alcoólico provável): uma forte população conduz a uma mortalidade elevada devido à aceleração da cinética fermentativa, que provoca um aumento da temperatura e a competição das leveduras por outros factores de sobrevivência. A cinética de fermentação alcoólica está claramente associada ao nível de população de leveduras. Considera-se que 1 a 15 milhões de células por ml em bom estado fisiológico durante a fase estacionária (2 a 3 dias após o início da FA) são capazes de terminar a FA. O azoto desempenha um papel na fermentação alcoólica ao permitir a síntese de proteínas que vão assegurar o transporte dos açúcares até ao interior da célula onde são fermentados produzindo etanol. Estas proteínas são degradadas durante a fermentação alcoólica e por isso a levedura tem necessidade de renovar este pool para poder concluir a FA. As leveduras encontram maiores dificuldades para adsorver o azoto quando o meio se enriquece em etanol, o que explica a razão

2 GRANES ET AL. ALIMENTAÇÃO AZOTADA DAS LEVERURAS, PAG. 2 pela qual, as adições tardias são menos eficazes que as adições precoces. Apesar disso, os estudos mostram que as adições de azoto têm um maior impacto, durante um período mais longo, na cinética fermentativa do que na multiplicação das leveduras (aproximadamente até ao último quarto da FA 12 de densidade). Por último, existe uma sinergia entre o azoto e o oxigénio: numa FA conduzida em anaerobiose estrita (sem adições de O2) a permeabilidade celular deteriora-se rapidamente fazendo com que a absorção de azoto seja muito difícil uma vez que os açúcares se encontram dentro da célula: existe uma diferença de cerca de dois dias entre o início da carência de azoto e a paragem da fermentação alcoólica. Este último dado explica também porque se recomenda actuar de forma preventiva, adicionando conjuntamente o azoto e o oxigénio durante o primeiro terço da FA. A produção de compostos sulfurados está directamente relacionada com a carência em azoto. A explicação mais plausível é que, numa situação de carência azotada, a levedura extrai e metaboliza o enxofre adicionado (SO 2 ) ou presente naturalmente nos mostos (diversos sulfatos) para produzir aminoácidos sulfurados que lhe servirão para construir as suas proteínas. Nestas condições, o aumento das doses de sulfitação favorece a produção de compostos sulfurados. Os elementos desenvolvidos no parágrafo precedente explicam também porque as adições tardias de azoto assimilável são pouco eficazes sobre os odores sulfurados. Por fim, o aparecimento de odores sulfurados é um bom indicador do risco de paragem da FA já que a sua produção começa quase imediatamente depois do início da carência de azoto. A produção de compostos aromáticos, nomeadamente de ésteres, depende muito do nível de azoto assimilável pelas leveduras. De modo geral, a quantidade de compostos aromáticos produzidos durante a FA varia no mesmo sentido que a concentração inicial em azoto assimilável do mosto. Assim, o enólogo deve combinar todos estes elementos para definir uma estratégia coerente de correcção das carências de azoto: não muito tarde, com oxigénio e sem excessos. Outro elemento importante, a forma do azoto desempenha um papel fundamental. Não foram realizados muitos trabalhos em fisiologia. Os principais resultados são os seguintes: Durante as adições tardias (supostamente curativas / FA lentas) o azoto aminado é mais eficaz do que o azoto amoniacal. A formação de álcoois superiores aromáticos que participam positivamente no carácter frutado e especiado dos vinhos é menor quando a única fonte de azoto é o amoníaco, resultados confirmados na prática, em adegas, e através de estudos comparativos FermaidE NH 4 + realizados no âmbito de um programa de I&D. Falamos de uma temática muito actual já que a Universidade de Saragoça demonstrou a forte relação que existe entre a composição aminada e as moléculas aromáticas produzidas durante a FA. As adições de aminoácidos assimiláveis são tão eficazes como o azoto amoniacal para controlar os odores sulfurados. O azoto das uvas e dos mostos Os resultados obtidos pelo ICV mostram que a zona mediterrânea é em geral, uma zona na qual o azoto está presente em baixas concentrações no momento da vindima.

3 GRANES ET AL. ALIMENTAÇÃO AZOTADA DAS LEVERURAS, PAG Observatoire du Millésime: evolução da concentração média de nitrogénio assimilável Ecart - t ype des mesures Como exemplo, em 25 a média de mais de 6 medições efectuadas pelo ICV Pyrénées Roussillon foi de 12 mg / L para os graus álcoolicos prováveis entre 1,1 e 17,5. Da totalidade dos valores 78% foram inferiores a 15 mg / L teor considerado, pela maioria dos especialistas, como o limite da carência absoluta para a Saccharomyces cerevisiae (ver capítulo seguinte). Os resultados do "Observatoire 5 du Millésime" confirmam estes dados com variações entre anos, entre castas e entre zonas. O gráfico à esquerda ilustra as medições desde 1999, no momento da vindima das uvas, geralmente com 12% de grau potencial ou superior. Pontualmente, foram observadas diminuições da concentração de azoto das uvas durante a maturação, mas foram casos excepcionais. As variações entre colheitas ocorrem principalmente devido à alimentação hídrica da vinha: os anos de stress conduzem normalmente a teores mais baixos. As medições anunciadas pelos enólogos do ICV tendo como base as medições do Observatoire du Millésime dão uma boa indicação da tendência da colheita e das diferenças associadas à casta. Poucas adegas dispõem das ferramentas necessárias para efectuar uma monitorização em tempo real e em cada cuba, da concentração de azoto para a poderem corrigir caso a caso. Além disso, como será possível constatar mais adiante, que nem todas as leveduras têm as mesmas necessidades. Por este motivo, não é pertinente sistematizar este tipo de medição Observatoire du Millésime : concentrações em azoto assimilável em função das castas Ecart - type des mesures CS Chardonnay Carignan Grenache Merlot Mourvèdre Sauvignon Syrah A casta tem um impacto quase tão importante como o ano de colheita, como mostram as médias de 6 anos no momento da vindima obtidas no âmbito do programa de I&D (grau alcoólico provável normalmente acima dos 12%). As castas mediterrâneas têm valores geralmente baixos (à excepção da Syrah) e as castas importadas de outras zonas os valores mais elevados. É possível constatar que, como para o efeito do ano, o efeito variedade apresenta uma grande variabilidade intravarietal. As outras causas conhecidas da variabilidade das concentrações de azoto das uvas são claramente de ordem agronómica: fertilização azotada da vinha (orgânica ou mineral), prática da cobertura vegetal (ou eliminação de infestantes insuficiente), irrigação.

4 GRANES ET AL. ALIMENTAÇÃO AZOTADA DAS LEVERURAS, PAG. 4 Metade do azoto assimilável presente nas uvas apresenta-se normalmente sob a forma amoniacal e outra metade sob a forma aminada (os resultados do ICV apresentam um intervalo de 4% a 6% de aminoácidos, os resultados do INRA de Montpellier um pouco menos de 6%). Contudo, de acordo com os resultados do ICV Pyrénées Roussillon, o azoto amoniacal representa cerca de 8% do azoto assimilável, o que pode significar uma diversidade em função das zonas ou dos diferentes anos. A maior parte dos resultados mostram que durante a maturação as concentrações de aminoácidos variam pouco. Por outro lado, os resultados do ICV Pyrénées Roussillon obtidos em 25 tendem a mostrar que quando as concentrações de azoto assimilável se encontram abaixo do nível de carência absoluta (cerca de 15 mg / L), as concentrações de aminoácidos assimiláveis são reduzidas para metade: quando há déficite este é muito mais marcado no caso dos aminoácidos. Controlo da alimentação azotada durante a FA Mesmo que este não seja o único factor de controlo da FA podem-se correlacionar as necessidades médias de azoto das leveduras com os níveis de concentrações de açúcares: Tendo como base uma necessidade de 15 mg / L de azoto para um grau potencial de 12% e uma FA realizada durante 8 dias a 24ºC será necessário adicionar de 25 a 3 mg / L de azoto assimilável por cada grau provável suplementar. Para um grau potencial de 13% serão necessários cerca de 18 mg / L para 14% cerca de 21 mg / L. Isto é claramente uma ordem de grandeza para limitar os riscos de FA lentas assim como os germes de contaminação resultantes ou os riscos de paragens de FA. É necessário também manter o espírito de que é mais perigoso do que benéfico ultrapassar estes valores e não esquecer que regular as adições de azoto não elimina os riscos de paragens de FA. Seria útil voltar a ler o documento sobre os 13 pontos-chave da FA. As leveduras adsorvem o azoto do meio rapidamente: 5% a 8% de azoto é consumido em menos de 1h. O que significa que um início espontâneo da FA cria ou acentua a carência. Contudo, nem todas as leveduras são iguais do ponto de vista da sua reactividade com as adições de azoto. Foram realizadas medições em meios de cultura sintéticos carenciados, com um grau provável de cerca de 12% e a 24ºC. O inconveniente deste tipo de medições é que têm em conta um único factor: se trabalhássemos com um grau provável de 14% os resultados poderiam ser diferentes apesar de tudo, estes resultados representam em grande escala a realidade. Segundo estas medições, as leveduras como a D21 ou a D47 são pouco exigentes enquanto a K1M ou a D8 têm necessidades significativamente mais elevadas. Nestas condições é possível observar, que a K1M é pouco indicada o que poderia fazer supor que tem dificuldades em fermentar mostos difíceis. A investigação de campo, transpondo estes supostos, demonstrou o contrário. No entanto, na realidade quase nunca se encontram estas condições. A K1M consegue superar as dificuldades em condições de maiores concentrações de açúcares, de temperaturas mal controladas, em mau estado sanitário ou de forte competição com as leveduras indígenas. Por outro lado, sabe-se que a K1M reage positivamente às adições de oxigénio (cinética de FA, nomeadamente odores sulfurados) e mais intensamente que a maioria das outras leveduras da gama ICV que ilustram estes resultados. De seguida, a questão que se coloca é o impacto das fases pré-fermentativas no nível de azoto no mosto, na ausência de desenvolvimento de flora espontânea (Saccharomyces ou não). As medições no âmbito do programa I&D comparando para uma mesma matéria-prima, a maceração pelicular e a prensagem directa mostraram que não existem diferenças significativas

5 GRANES ET AL. ALIMENTAÇÃO AZOTADA DAS LEVERURAS, PAG. 5 entre estas duas opções. Contudo, as macerações peliculares dão lugar a FA frequentemente mais fáceis, provando que o azoto não é o único elemento implicado na cinética da FA. Supõe-se que a clarificação ou defecação também tem um efeito negativo na concentração de azoto assimilável do mosto. Para valores baixos (< 1 mg / L), a determinação quantitativa com o método de referência revelou que as diferenças vão sempre no mesmo sentido, mas são apenas mais elevadas que a repetibilidade da análise: aproximadamente 5 a 15 mg / L a mais no mosto na clarificação. Para mostos mais ricos em azoto, a clarificação pode provocar uma redução de 3% das concentrações de azoto assimilável, o que poderia induzir uma carência. A clarificação tem assim, influência no azoto assimilável: em qualquer caso, a medição realizada no laboratório é uma medição efectuada em mosto claro, ou seja próxima da que será obtida na adega à saída da clarificação/decantação. Por outro lado, a clarificação empobrece o mosto em esteróis e em ácidos gordos que são factores de sobrevivência muito importantes para as leveduras. Os flocos pécticos ou borras finas que se reincorporam durante a clarificação limitam este empobrecimento. É de notar que é impossível controlar na adega este tipo de tendência, já que é necessário realizar a determinação com o formol titulação (com o Foss é necessário clarificar a amostra antes da sua análise). Como controlar a adição de azoto? O primeiro ponto refere-se à escolha dos produtos e da dose considerando quer os aspectos técnicos (nível de carência determinado / concentração de açúcares, eficácia), quer organolépticos, económicos (custo por hl) e regulamentares (doses máximas legais de fosfato ou sulfato de diamónio, concentrações de tiamina dos nutrientes enriquecidos com esta vitamina): O sulfato ou fosfato de diamónio é um dos mais eficazes, mais concentrados e menos expendiosos. Incorpora 6 mg / L de azoto assimilável por cada adição de 3 g / hl. O impacto organoléptico é regular: aromas descritos como tecnológicos, voláteis e químicos com concentrações elevadas e mais agressivas na boca (rugosidade em vinho branco ou em rosé, adstringência e secura em todos os vinhos). Echelle arbitraire ASDQ Effet des apports azotés sur Sauvignon R&D ICV Témoin No que respeita aos 3 nutrientes complexos do tipo FermaidE nem todos são eficazes, são medianamente concentrados (45 mg / L de azoto assimilável por cada adição de 3 g / hl de 2 1 FermaidE Od. Agrumes Fruits ) provocam impactos Soufrées blancs organolépticos variáveis, em geral orientados para notas mais maduras e para uma maior doçura na boca (ver gráfico à direita). Estes custam 4 a 6 vezes mais por quilo que o fosfato de diamónio. DAP FermaidE Réglisse Volume Ac. Rugosité Astr. Séch. Amertume O preço mais elevado deve-se à presença de leveduras secas inactivas que custam cerca de 1 vezes mais do que o fosfato de diamónio. Esta adição de azoto orgânico é também uma garantia de melhor eficácia, para adições tardias (após a segunda metade da fermentação) quer sejam preventivas ou correctivas. Quanto mais quantidade de fosfato de diamónio se adicionar numa solução de nutrientes complexos mais se reduzirá o preço de custo e maior será o nível de azoto assimilável libertado por g de produto. Quanto mais barato e concentrado for o produto, mais elevada será a proporção de azoto mineral.

6 GRANES ET AL. ALIMENTAÇÃO AZOTADA DAS LEVERURAS, PAG. 6 Não é necessário considerar todos os compostos orgânicos como nutrientes azotados. Os Booster por exemplo transportam apenas ¼ do azoto que transporta o FermaidE, ou seja 1 15 mg / L com adições de 3 g / hl. Todos os testes realizados pelo ICV confirmam que uma má gestão da nutrição azotada faz perder a maior parte dos efeitos positivos de Booster O gráfico à direita mostra a vermelho estes resultados. Além da ligeira diferença em relação à duração da FA (em geral de 1 a 3 dias), quando não se efectua adição de FermaidE todas as características positivas diminuem. Este efeito nem sempre se apresenta com a mesma intensidade em termos de impacto, mas a tendência é constante Merlot - Cuvaison courte - R&D ICV - 25 BoosterRouge 3 g / hl à l'encuvage BoosterRouge 3 g / hl à l'encuvage + FermaidE Soufré Herbacé Fruits O segundo ponto diz respeito à estratégia de adição: as adições durante a fase de multiplicação e durante a fase estacionária são os mais eficazes. Deste modo, é sempre preferível actuar de forma preventiva. Atenção, contudo, à má interpretação da adição chamada inicial : Não é necessário adicionar azoto durante a adição das leveduras a não ser no início da FA (de -5 a -1 pontos de densidade) quando a fase de multiplicação já tenha sido iniciada. Durante a adição clássica na fase final de crescimento (cerca de 1/3 da FA) a adição combinada de O 2 deve ser efectuada de forma sistemática quer em vinhos tintos quer em vinhos brancos ou rosés. Neste estado, as 4 8 mg / L de oxigénio adicionado são consumidas imediatamente pelas leveduras sem que estas possam oxidar as moléculas aromáticas ou os seus percursores. rouges Confiture Volume Intensité tannique Astring. Séch. Amertume Quando as análises ou os resultados da adição indicarem carências que não possam ser corrigidas com as adições de nutrientes complexos (limitados frequentemente pelas suas concentrações em tiamina) é necessário completar estas adições com sulfato ou fosfato de diamónio. No caso das adições tardias (depois da primeira metade da FA) que será melhor evitar, é sempre preferível o azoto complexo. Quando as adições de azoto resolvem apenas parcialmente o problema apesar de um bom controlo dos restantes pontos chave da FA, é necessário aplicar produtos específicos do tipo GofermProtect, fortemente recomendados também no caso de graus alcoólicos elevados (>13,5 14% potencial), com carências ou não (ver a tabela seguinte). Por último, pode ser colocada a questão sobre o impacto na FML da gestão do azoto durante a FA. Com efeito, as bactérias lácticas são consumidoras de azoto, mas apenas sob a forma orgânica (aminoácidos e pequenos péptidos). Neste sentido, resíduos de FermaidE podem ter influência na cinética da FML. Este fenómeno nunca foi revelado, mas em testes realizados ao abrigo do programa I&D comprovou-se este efeito. Por outro lado, os activadores da FML são essencialmente elaborados à base de aminoácidos já que a sua carência pode bloquear completamente a FML. De qualquer forma, estes não asseguram que a FML se desenvolva sem problemas a alimentação azotada das bactérias lácticas não é o único factor de êxito da FML. Nos casos tradicionais é essencialmente a autólise das leveduras que assegura as necessidades das bactérias lácticas. Com as leveduras que apresentam uma autólise como a PDM ou a K1M, independentemente dos outros factores explicativos, os atrasos ou dificuldades da FML podem ser explicados pelo menos parcialmente por esta característica. FermaidE ou GofermProtect : conselhos para a escolha dos produtos

7 GRANES ET AL. ALIMENTAÇÃO AZOTADA DAS LEVERURAS, PAG. 7 FermaidE ou FermaidBlanc transportam azoto assimilável à razão de 45 mg / L por cada adição de 3 g / hl esteróis e vitaminas (sobretudo tiamina). Desempenham um papel positivo no que respeita à carência de azoto mas também, em certa medida, em relação à resistência das leveduras no final de FA (devido aos esteróis e às vitaminas assimiladas). Este último ponto explica a estratégia histórica do ICV de fraccionamento das adições: a densidade inicial de -5 a -1 pontos e no final do primeiro terço da FA. GofermProtect foi desenvolvido pela Lallemand para proporcionar às leveduras, durante a fase de rehidratação, esteróis, vitaminas e oligoelementos que asseguram uma melhor sobrevivência das leveduras, sendo particularmente importante para vinhos de elevado teor alcoólico ou sujeitos a processos causadores de stress (especialmente turbidez baixa, ou nomeadamente temperaturas baixas) não é uma ferramenta de controlo das carências azotadas! De forma esquemática, recomenda-se: grau potencial elevado ou processo stressante baixo grau provável e processo clássico Carência azotada Ausência de carência azotada GofermProtect depois FermaidE GofermProtect FermaidE