Análise Morfo-Histológica e Fitoquímica de Verbena litoralis Kunth

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1 Acta Farm. Bonaerense 24 (2): (2005) Recibido el 14 de febrero de 2003 Recibida nueva versión: 7 de diciembre de 2004 Aceptado el 27 de enero de 2005 Trabajos originales Análise Morfo-Histológica e Fitoquímica de Verbena litoralis Kunth Tiago Juliano Tasso de SOUZA*; Melânia Palermo MANFRON; Gilberto Dolejal ZANETTI; Solange Cristina da Silva Martins HOELZEL & Vera Pereira PAGLIARIN Departamento de Farmácia Industrial, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria, Campus Universitário, Prédio 26. Santa Maria, RS, Brasil. CEP: RESUMO. Foram determinados o perfil fitoquímico e parâmetros morfo-anatômicos de Verbena litoralis Kunth, planta reconhecida popularmente como medicinal, objetivando sua diagnose como insumo farmacêutico. O mesofilo bifacial, a disposição do esclerênquima, os tricomas glandulares e tectores, assim como a ausência de drusas e cristais de oxalato de cálcio são características significativas no controle botânico de qualidade desta espécie para a indústria farmacêutica. Como resultado da análise fitoquímica destaca-se a presença de flavonóides, cumarinas, saponinas, taninos e cardioativos. SUMARY. Histomorphological and Phytochemical Analysis of Verbena litoralis Kunth. Phytochemical profile and morpho-anatomical parameters were determined for Verbena litoralis Kunth, plant popularly recognized as medicinal, aiming its diagnosis as a pharmaceutical drug. Isofacial mesophyl, arrangement of sclerenchyma, glandular and non-glandular trichomes, as well as absence of calcium oxalate crystals and druses are significative characteristics to this species botanic quality control for pharmaceutical industries. From phytochemical analysis it can be remarked the presence of flavonoids, cumarins, tannins and cardiotonic compounds. INTRODUÇÃO As análises fitoquímica e botânica de drogas vegetais são procedimentos que colaboram para otimizar a segurança terapêutica e, conseqüentemente, a melhor utilização de medicamentos. Estes procedimentos firmaram a fundamentação científica como o diferencial entre preparações utilizadas em medicina popular e fitoterápicos 1. Um dos passos iniciais para o controle de qualidade de uma droga vegetal é a definição de características farmacobotânicas com a descrição macro e microscópica da parte da planta utilizada como medicinal, e dos grupos de substâncias químicas, para a identidade de marcadores em matéria-prima vegetal, preparados fitoterápicos intermediários e produtos fitoterápicos. A família Verbenaceae compreende aproximadamente 100 gêneros de distribuição tropical e subtropical 2, e dentre eles o gênero Verbena, com aproximadamente 250 espécies distribuídas preferentemente nas regiões tropicais e temperadas da América. Verbena litoralis Kunth, é conhecida comumente como gervãozinho-do-campo ou erva-de-pai-caetano. Esta planta vegeta na região andina do Chile ao Peru, Guianas, Venezuela, Argentina 3 e regiões Sudeste e Sul do Brasil, além disso, pode ser encontrada eventualmente na Austrália e África. Verbena litoralis caracteriza-se por seu caule quadrangular, folhas ovadas, ovado-lanceoladas, lanceoladas, espatuladas ou lineares, de base afiliada, com pecíolo curto, e também por suas inflorescências que são caracteristicamente longas e muito pouco densas quando comparadas com as espécies com as quais poderia ser eventualmente confundida (Verbena bonariensis L. e V. brasiliensis Vell.) 4. Essa espécie é uma erva popularmente utilizada no Sul do Brasil como desintoxicante do organismo, em diarréias e desordens gastrintesti- PALAVRAS CHAVE: Descrição macroscópica, Descrição microscópica, Farmacobotânica, Fitoquímica, Plantas medicinais, Verbena litoralis Kunth. KEY WORDS: Macroscopic description, Microscopic description, Medicinal plants, Pharmacobotanic, Verbena litoralis Kunth. * Autor a quem dirigir a correspondência: souzatjt@mail.ufsm.br ISSN

2 SOUZA T.J.T. de, MANFRON M.P., ZANETTI G.D., HOELZEL S.C. da S.M. & PAGLIARIN V.P. nais, e também por suas propriedades antifebris. Além disso, recentemente têm sido publicados trabalhos sobre a atividade antimicrobiana, antioxidante e ainda sobre a atividade ativadora do fator de crescimento neural apresentada por compostos encontrados nessa planta 5-8. O presente trabalho objetiva caracterizar macro e microscopicamente o caule e as folhas, investigar a composição química qualitativa e obter um perfil cromatográfico em CCD, visando contribuir para a padronização e o controle de qualidade de Verbena litoralis como insumo farmacêutico. MATERIAL E MÉTODOS Obtenção do material vegetal Partes aéreas de Verbena litoralis foram coletadas no campus da Universidade Federal de Santa Maria, em Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil, no mês de dezembro de 2001, com registro no Herbário da Universidade Federal de Santa Maria, SMDB A análise anatômica foi realizada com amostras de 2 x 2 mm do caule e das folhas, mantidas em álcool etílico 70 GL, tanto para fixação como para conservação do material que permaneceu sob refrigeração. Para a análise fitoquímica qualitativa e a padronização de um perfil cromatográfico o material foi desidratado em estufa de ar circulante e pulverizado em moinho de facas com tamis 0,86 µm (obtendo-se 100 g de pó). Esse material foi armazenado em frasco âmbar para posterior obtenção dos extratos. Determinação de características macro e microscópicas A caracterização macroscópica foi efetuada através de observações a olho nu e com auxílio de estereomicroscópio (aumento de 10 x) 9. Para o estudo da venação o material vegetal foi diafanizado e corado com safranina 0,1%, em álcool etílico 50%, desidratado e montado em bálsamo sintético Na caracterização microscópica foram analisadas a região apical de lâminas de folhas adultas e a região mediana de ramos O estudo da epiderme foliar, nas faces abaxial e adaxial, foi realizado em lâminas semipermanentes, com cortes à mão livre de material fresco, corados com azul de metileno 0,1% 16. Para a análise do corte transversal o material conservado foi desidratado em série etílica ascendente, nas graduações 80, 90 e 96 GL, por uma hora em cada solução, e incluído em blocos de hidroxietilmetacrilato 17, 18. Secções de 4 µm foram repassadas para lâmina, corados com azul de toluidina 0,1% 19,20, e montadas em bálsamo sintético. As lâminas permanentes foram depositadas no laminário do Laboratório de Farmacognosia do Departamento de Farmácia Industrial da Universidade Federal de Santa Maria. A determinação de características organolépticas e macroscópicas das fraturas, bem como a granulometria e a caracterização microscópica da droga em pó foram realizadas por tamisação e em lâminas semipermanentes, utilizando-se como corante azul de metileno 0,1% 21, 22. Análise química qualitativa e perfil cromatográfico A análise química qualitativa foi realizada em extratos aquoso e etanólico 70%, obtidos a frio, e extratos etéreo, etanólico e aquoso obtidos a quente 23, 24. O perfil cromatográfico do extrato metanólico a 20% foi obtido em CCD sobre cromatofolhas de gel de sílica G 60 F 254 utilizando diversas fases móveis e reagentes cromogênicos 25. RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização Macroscópica As características macroscópicas da espécie em questão não fogem do padrão da família Verbenaceae, pois nesta família botânica encontramse, em geral, folhas opostas verticiladas, simples, inteiras, serradas ou partidas, sem estípulas, e os caules costumam ser quadrangulares 26. As folhas de Verbena litoralis exibem filotaxia oposta-cruzada, são sésseis e não apresentam estípulas. O limbo é simples, de forma ovada, lanceolada, espatulada ou linear, ápice agudo, base atenuada e margem lisa com o terço superior serrado. Atingem 1,5-7,0 cm de comprimento e 0,2-2,0 cm de largura, sendo maiores e mais ovadas nos ramos inferiores e tornando-se menores e mais afiladas nos ramos superiores (2,0 x 0,4 cm), onde também são menos serradas. Possuem consistência membranácea, são discolores e apresentam textura áspera na face abaxial. A venação é do tipo eucamptódroma, com aréola quadrangular, vênulas simples e última marginal ovalada. O caule é herbáceo, tetragonal e apresenta ramificações dísticas desde a base. Atinge cm de altura e 1-7 mm de diâmetro. Apresenta cor verde-luzidia, é liso e rico em pequenas pontuações esbranquiçadas. Caracterização Microscópica A anatomia de Verbena litoralis segue as ca- 210

3 acta farmacéutica bonaerense - vol. 24 n 2 - año 2005 racterísticas gerais da família Verbenaceae. A folha apresenta tricomas, estômatos nas duas faces epidérmicas e mesofilo heterogêneo, mas não apresenta hipoderme como é relatado para Vitex e Avicennia entre outros gêneros da família. Contudo, o sistema vascular não está acompanhado por esclerênquima, como está relatado para o gênero Verbena. O caule é tetragonal, os feixes vasculares não são acompanhados de esclerênquima e o córtex não é colenquimatoso 14. Análise microscópica da folha Em secção paradérmica da folha podem ser observados estômatos do tipo paracítico (raramente anomocítico), além de tricomas tectores e glandulares. Os tricomas tectores nas folhas de Verbena litoralis possuem corpo unicelular, geralmente são cônicos inclinados, raramente cônicos retos, em forma de gancho, ou triangulares. Os tricomas glandulares apresentam pedicelo unisseriado curto com 1-3 células e glândula formada por 1-4 células. Não foram observados tricomas glandulares com pedicelo alongado, como os que ocorrem em Verbena bonariensis 28. Na face adaxial (Fig. 1) a epiderme apresenta células de paredes retas a sinuosas, e na face abaxial (Fig. 2) a epiderme possui células de parede ondulada. O índice de estômatos na face adaxial é de 10,6 % e na face abaxial é de 31,5%. Em secção transversal foi caracterizada a presença de epiderme uniestratificada, com cutícula mais espessa na região mediano-superior, estômatos do tipo mesocítico e tricomas glandulares (Figs. 3, 4 e 5). O mesofilo é heterogêneo bifacial. O parênquima paliçádico apresenta-se composto por 3-5 extratos e o parênquima esponjoso possui 2 extratos de células achatadas, seguido de mais 2 camadas inferiores de células com parede periclinal menor que a anticlinal (Fig. 4). O sistema vascular é composto por feixes do tipo colateral fechado, protegido por bainha parenquimática (Figs. 3 e 4). Na região central, adjacente à epiderme abaxial ocorre uma camada de tecido colenquimático (Fig. 3). Análise microscópica do caule A epiderme no caule é contínua, apresenta células que possuem a parede periclinal maior que a anticlinal, estômatos do tipo mesocítico e cutícula pronunciada (Figs. 6 e 7). Nas arestas, subjacente à epiderme, ocorre reforço de tecido colenquimático do tipo lamelar (6 camadas), seguido imediatamente de pequenas formações esclerenquimáticas (Fig. 7). Após a epiderme ocorre uma camada contínua e subjacente que deve ser hipoderme, já que esta é uma estrutura citada para família Verbenaceae, ao menos para o gênero Clerodendron e também é citada hipoderme em folhas de Avicennia e Vitex 14. A região entre a epiderme e o sistema vascular está preenchida por 3 a 4 camadas de parênquima, sendo que a mais in- A B Figura 1(A-B). Secção paradérmica da face adaxial da epiderme foliar de Verbena litoralis: 1 tricoma tector; 2 tricoma glandular; 3 estômato. A B Figura 2 (A-B). Secção paradérmica da face abaxial da epiderme foliar de Verbena litoralis (400 x): 1 estômatos; 2 célula epidérmica; 3 tricoma tector; 4 tricoma glandular. 211

4 SOUZA T.J.T. de, MANFRON M.P., ZANETTI G.D., HOELZEL S.C. da S.M. & PAGLIARIN V.P. Figura 3. Secção transversal da região mediana das folhas de V. litoralis (400 x). 1 colênquima; 2 parênquima; 3 bainha vascular; 4 feixe líbero-lenhoso. Figura 6. Secção transversal do caule de V. litoralis (400 x): 1 epiderme; 2 colênquima; 3 esclerênquima; 4 floema; 5 xilema; 6 parênquima medular. Figura 4. Secção transversal da região lateral das folhas de V. litoralis (400 x). 1 cutícula; 2 células epidérmicas; 3 estômato; 4 parênquima paliçádico; 5 parênquima lacunoso; 6 feixe líbero-lenhoso protegido por bainha vascular. Figura 7. Secção transversal do caule de V. litoralis (400 x). 1 epiderme; 2 parênquima; 3 feixes de fibras esclerenquimáticas; 4 floema; 5 xilema. Figura 5. Secção transversal da folha de V. litoralis evidenciando a presença de tricomas (400 x). 1 epiderme; 2 tricomas (a- glandular, b- tector em secção diagonal) ; 3 mesofilo paliçádico. Figura 8. Secção transversal do caule de V. litoralis - região central da medula. 1: parênquima medular; 2: xilema. 212

5 acta farmacéutica bonaerense - vol. 24 n 2 - año 2005 terna caracteriza uma bainha amilífera, com células de parede periclinal proporcional à anticlinal. Após este parênquima cortical e antes do sistema vascular há vários grupos de fibras esclerenquimáticas sistematicamente dispostas (Fig. 7). No cilindro central, o sistema vascular configura uma estrutura ectoflóica, com xilema e floema formando faixas contínuas, e o parênquima medular exibe células hexagonais, sendo que as maiores células ocorrem na região central. O espaço intercelular neste parênquima é do tipo meato. Não foram observadas drusas, areias cristalinas, ráfides ou outros tipos de cristais (Fig. 8). Análise da droga pulverizada O material pulverizado de Verbena litoralis apresenta predominantemente a cor verde, odor sui generis e sabor amargo. As fraturas possuem superfície lisa e poucas reentrâncias, são friáveis e membranáceas, apresentam ângulos de 90 e assumem a forma retangular ou quadrada. O pó enquadra-se no tipo heterogêneo e moderadamente grosso 24, uma vez que a maior parte das fraturas permaneceu em tamis com malha 0,5 mm - 0,25 mm, o que pode ser observado na Tabela 1 e Fig. 9. Análise fitoquímica e perfil cromatográfico Os resultados da análise química qualitativa dos extratos obtidos a quente e a frio de Verbena litoralis são semelhantes. O rendimento do extrato seco foi de 3,03% e 1,42% para o extrato aquoso e extrato etanólico, respectivamente. Os extratos apresentam flavonóides, cardioativos, antracenosídeos, saponinas hemolíticas, taninos catéquicos e carotenóides. Em menor concentração foi detectada a presença de óleos voláteis, cumarinas e mucilagens. Não foi observada a presença de alcalóides, óleos fixos e taninos gálicos. Esses resultados são coerentes com a presença de esteróis, triterpenos, e chalconas bioativas relatada na literatura 6-8. A melhor fase móvel testada para a determinação do perfil cromatográfico em CCD, com o extrato metanólico do caule, foi obtida utilizando como sistema eluente acetato de etila:ácido fórmico:água (8:1:1 v/v). Os cromatogramas assim obtidos possuem 5 manchas principais, quando observados sob luz ultravioleta (λ = 260 e 320 nm). A mancha de Rf 0,98 apresenta fluorescência avermelhada, as manchas de Rfs 0,51 e 0,40 fluorescência azulada, e as manchas de Rfs 0,18 e 0,13 fluorescência amarelada. Abertura da Peso Peso Retenção Passagem malha (mm) (g) (%) (%) (%) 2,5 0,019 0,038 0,038 99, ,55 1,1 1,138 99,862 0,8 1,217 2,434 3,572 96,428 0,63 6,552 13,104 16,676 83,324 0,5 12,631 25,262 41,938 58,062 0,4 7,036 14,072 56,01 43,99 0,25 13,299 26,598 82,608 17,392 0,2 2,018 4,036 86,644 13,356 0,16 2,419 4,838 91,482 8,518 0,1 2,453 4,906 96,388 3,642 0,05 1,47 2,84 99,228 0,772 0,04 0,166 0,332 99,56 0,44 Bandeja de recolhimento 0,18 0,36 99,92 0,08 Soma total 50,01 99,92 Tabela 1. Porcentagem de passagem e retenção do pó de Verbena litoralis em função da abertura da malha dos tamises. Figura 9. Análise granulométrica por tamisação do pó do caule de Verbena litoralis (resultados expressos em porcentagem %, p/p). CONCLUSÕES A disposição dos tecidos parenquimáticos, a presença de bainha amilífera, fibras esclerenquimáticas, tricomas tectores e glandulares, bem como a falta de cristais, auxiliam na diagnose de Verbena litoralis como insumo farmacêutico. O alto rendimento de extrato aquoso evidencia maior concentração de constituintes de elevada polaridade, confirmada pela análise fitoquímica qualitativa. 213

6 SOUZA T.J.T. de, MANFRON M.P., ZANETTI G.D., HOELZEL S.C. da S.M. & PAGLIARIN V.P. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Marques, L.C. (1999) Normatização da produção e comercialização de fitoterápicos no Brasil. Cap. 18, p In: Simões, C.M.O.; Schenkel, E.P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L. A. & Petrovick, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento, Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS/UFSC. 821 p. 2. Joly, A.B. (1979) Botânica: introdução à taxonomia vegetal, 5. ed., Editora Nacional, São Paulo, págs 579s. 3. Lorenzi, H. (2000) Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas e tóxicas, 3ª.ed., Nova Odessa: Instituto Plantarum de estudos da flora, São Paulo, 807p. 4. Yeo, P.F. (1989) Kew Bull. 45: Cáceres, A. (1999) Plantas de Uso Medicinal em Guatemala. Editorial Universitária, Universidad de San Carlos de Guatemala, Guatemala, p. 369s. 6. Castro-Gamboa, I. & O. Castro (2004) Phytochemistry 65: Li, Y., M. Ishibashi, M. Satake, X. Chen, Y. Oshima & Y. Ohizumi (2003) J. Nat. Prod. 66: Li, Y.S., M. Ishibachi & X.G. Chen, (2003) Chem. Pharm. Bull. 51: Vidal, W.N. & M.R.R. Vidal (1986) Botânica - organografia; quadros sinópticos ilustrados de fanerógamas, 3.ed., Viçosa: UFV, 144p. 10. Marchiori, J.N.C. (1995) Elementos de dendrologia, Santa Maria: UFSM, 173p. 11. Hickey, L.J. (1974) Bol. Soc. Arg. Bot. 16: Felippe, G.M. & F.M.M.R. Alencastro (1966) Am. Acad. Brasil. Ciênc. 38 (supl.): Stritmatter, C.G.D. (1973) Bol. Soc. Arg. Bot. 15: Metcalfe, C.R. & L. Chalk (1950) Anatomy of the dicotyledons, Oxford: Claredon Press, Vol. 2, 724p. 15. Dickison, W.C. (2000) Integrative Plant Anatomy, Harcourt Academic Spress, San Diego, 533p. 16. Paoli, A.A.S. et al. (2003) Anatomia vegetal, Viçosa: Editora UFV, 438p. 17. Oliveira, F. & G. Akissue (1989) Fundamentos de farmacobotânica, Ed. Atheneu, São Paulo, 216p. 18. Gerrits, P.O. & L. Smid (1983) J. Microsc. 132: Ruetze, M. & U. Schimitt (1986) Eur. J. For. Path. 16: Gerlach, D. (1977) Botanische mikrotechnik, 2. ed., Stuttgard, Georg-Thieme Verlag, 211 p. 21. Costa, A.F. (1982) Farmacognosia, 2. ed., Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa, Vol. 3, 1032 p. 22. Olveira, F.. G. Akisue & M.K. Akisue (1991) Farmacognosia, Ed. Atheneu, São Paulo, 412 p. 23. OMS (1992) Quality control methods for medicinal plant materials, 88 p 24. Moreira, E.A. (1979) Trib. Farm. 47: Lúcio, E.M.R.A. (2000) Triagem farmacológica e triagem fitoquímica, In Sharapin (2000), N. Fundamentos de tecnologia de produtos fitoterápicos, Santa Fé de Bogotá, D.C., Colômbia, Convênio Andrés Bello, págs Wagner, H., S. Bladt &.M. Zgainski (1984) Plant Drug Analysis - A Thin Layer Chromatography Atlas, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, 320p. 27. Barroso, G.M. (1991) Sistemática de angiospermas do Brasil, Vol. 3, Viçosa, Imprensa Universitária da Universidade Federal de Viçosa, 326p. 28. Mathew, L. & G.L. Shah (1983) Fed. Rep. 94: 214