PRÉ-IMUNIZAÇÃO E TRATAMENTO DE TRISTEZA PARASITÁRIA EM BOVINOS LEITEIROS

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1 PRÉ-IMUNIZAÇÃO E TRATAMENTO DE TRISTEZA PARASITÁRIA EM BOVINOS LEITEIROS Eliziária C. dos Santos 1 ; Leandro L. de Oliveira 1 ; Eduardo de A. M. da Silva 1 ; Sérgio O. de Paula 1 1 Laboratório de Imunovirologia Molecular do Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal de Viçosa. depaula@ufv.br Dentre as enfermidades hemoparasitárias que causam grandes perdas a bovinocultura leiteira destaca-se a Tristeza Parasitária Bovina (TPB), que na América Latina tem como agentes etiológicos dois protozoários do gênero Babesia - Babesia bovis e Babesia bigemina, e uma bactéria intracelular obrigatória do gênero rickéttsia Anaplasma marginale. Ambas as espécies de protozoários são transmitidas pela picada do carrapato da falilia ixodidae, do gênero Rhipicephalus (Boophilus) microplus, enquanto Anaplasma marginale, além da picada do vetor biológico, o carrapato do gênero Rhipicephalus (Boophilus) microplus é transmitida pela picada de moscas hematófagas, consideradas vetores mecânicos (BOCK, et al., 2004). Um carrapato adulto ao parasitar os bovinos diminui sua produção de leite em 8,9 ml/dia, considerando que inúmeros carrapatos infectam um único animal as perdas com a produtividade chegam a contabilizar aproximadamente US$ 1 bilhão de dólares ao ano. Além dos gastos requeridos para o controle desses agentes etiológicos, imunização e tratamento dos animais infectados. Desta forma a TPB constitui-se em um fator limitante ao desenvolvimento da pecuária leiteira. PATOGENESEDOS AGENTES DA TRISTEZA PARASITÁRIA BOVINA Babesia bovis e Babesia bigemina Das babesioses que afetam os bovinos, oito espécies já foram identificadas, dentre essas a B. bovis e B. bigemina são as formas mais comuns encontradas no território Brasileiro (GUGLIELMONE, et al., 1995). A B. bigemina é uma espécie considerada pouco patogênica, normalmente associada à anemia não complicada. Já a B. bovis é altamente patogênica, capaz de causar complicações inflamatórias

2 124-1 st International Symposium of Dairy Cattle generalizadas e obstrução da microcirculação por eritrócitos parasitados em órgãos como cérebro e pulmões, levando à severa disfunção dos mesmos (MAHONEY 1977). O comportamento biológico, dessas diferentes espécies tem relação com o ciclo de vida do protozoário que se desenvolve em seu habitat natural (BOCK, et al., 2004), e este requer a existência de um hospedeiro vertebrado intermediário (bovino) e um hospedeiro invertebrado definitivo (carrapato) (UILENBERG, 2006). A transmissão de B. bovis aos bovinos se dá pela picada de carrapatos da família Ixodidae, que não são apenas carreadores mecânicos, mas se comportam como vetores biológicos, na medida em que o protozoário completa a fase de reprodução sexuada do seu ciclo dentro do organismo daqueles artrópodes (KESSLER, et al., 1998). Em geral, a transmissão de B. bovis em uma área está associada a um único vetor, mas a associação pode mudar de uma região para outra. Assim, na Austrália e na América do Sul B. bovis é transmitida pelo Boophilusmicroplus, na África pelo Boophilusannulatus e na Europa pelo Rhipicephalusbursa (FRIEDHOFF 1988). O protozoário possui uma interação com as células do hospedeiro altamente especifica e não invadem outro tipo celular, além dos eritrócitos. A infecção tem inicio com a inoculação das formas infectantes, esporozoítos presentes na saliva dos vetores infectados, na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado (BOCK, et al., 2004). Os esporozoítos ao entrarem em contato com a superfície dos eritrócitos internalizam-se, com auxilio de um complexo apical, constituído por diversas organelas especializadas - roptrias, micronemas, anel polar e conóide. O conteúdo das roptrias e micronemas é liberado sobre a membrana eritrocitária, induzindo à formação de um vacúolo e internalização das formas infectantes da Babesia. No interior da célula hospedeira, a membrana do vacúolo é destruída e os esporozoítos ficam em contato com o citoplasma (JACK & WARD 1981). Uma vez internalizados os esporozoítos se diferenciam em trofozoítos multiplicam-se assexuadamente por divisão binária originando os estágios evolutivos da Babesia, os merozoítos, que então saem para infectar outras hemácias (MEHLHORN & SHEIN, 1984). O ciclo se repete, com a diferenciação dos merozoítos em trofozoítos e divisão, a cada oito horas. Após alguns ciclos de replicação, parte dos merozoítos pode se desenvolver a gametócitos masculinos ou femininos que continuarão o ciclo da B. bovis no carrapato (JACK & WARD,

3 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite ). A análise da ultra-estrutura do merozoíto de B. bovis mostra que ele é circundado por uma película formada por dupla membrana associada à microtúbulos, e pode assumir a forma arredondada ou piriforme. Já o merozoíto da B. bigemina, possui forma ovóide sendo denominado, por alguns autores, como precursor de gameta com um nível diplóide de DNA, o que o diferencia do merozoíto de outras espécies de Babesia. Esse precursor só irá se desenvolver no organismo do carrapato (BOCK, et al., 2004). O ciclo de vida do protozoário tem continuidade no hospedeiro invertebrado e ainfectividade ocorre durante a hematofagia das teleóginas em animais com índices de parasitemia e por transmissão transovariana (FRIEDHOFF, 1988). A digestão dos eritrócitos parasitados ocasiona a liberação dos merozoítos no intestino da teleógina sofrendo alterações morfofisiológicas adaptativas preparando para a fase sexuada do ciclo biológico. À microscopia eletrônica, observam-se no epitélio intestinal da teleógina estruturas denominadas corpos estrelares, que são formas características do protozoário, associados à reprodução sexuada. Essas estruturas, de acordo com alguns autores, seriam os gametócitos que ao chegarem ao intestino das teleóginas sofrem múltiplos ciclos de replicação formando agregados de corpos estrelares, agora com nível haplóides de DNA, denominados gametas. As estruturas maiores e imóveis são caracterizadas como gametas femininos e os menores e imóveis os masculinos (MEHLHORN & SHEIN, 1984). Esses gametas sofrem singamia dando origem a uma estrutura esférica zigoto - diplóide, que por sua vez, infecta seletivamente as células digestivas do carrapato onde se multiplicam em células basófilas sintetizadoras devitelogenina. Dessa multiplicação surgem os oocinetos formas vermiculares que escapam para a hemolinfa. Na B. bigemina, os gametas diplóides sofrem o processo de meiose dando origem ao zigoto com metade do material genético. Nas células intestinais o zigoto passa pelo processo de esquizogonia (fissões multiplas, esporogonia) originando cinetos poliplóides (formas vermiculares, esporocinetos, amplos merozoítos) (MEHLHORN; SHEIN, 1984; FRIEDHOFF, 1988). Esses vermículos, de ambas as espécies de Babesia, são estruturas altamente moveis que ao escaparem para a hemocele invadem todos os órgaos e tecidos da teleógina, incluindo os ovários, e iniciam vários ciclos de esporogonia que se estendem até a morte do

4 126-1 st International Symposium of Dairy Cattle parasito. Dessa maneira, Babesia sp. infectam a progenie de teleóginas sendo esta via denominada transovariana, fundamental para a manutenção da endemia dessa parasitose no hospedeiro vertebrado (GUGLIELMONE et al., 1997; BOCK et al., 2004) Todas as larvas que eclodem desses ovos estão infectadas com Babesia, nesta fase, os vermiculos migram para as glândula salivares e sofrem esquizogonia de terceira geração dando origem as formas infectantes (esporozoítos) da Babesia (KESSLER, et al., 1998). A infecção dos animais com Babesia bovis ocorre pela picada do carrapato no estagio de larva e a Babesia bigemina é trasmitida quando o vetor encontra-se na fase de ninfa ou já na fase adulta e então o ciclo se repete. Anaplasma marginale Duas importantes espécies do gênero Anaplasma infectam os bovinos, Anaplasma marginale e A. centrale (THEILER, 1910). A primeira é altamente patogênica e a segunda por ser menos patogênica é utilizada, como vacina viva, para imunizar o gado susceptível à doença (De LA FUENTE, 2005). Apesar de a Anaplasmose apresentar descrição histórica, os mecanismos de transmissão e a importância epidemiológica das diferentes formas de transmissão e dos possíveis vetores, ainda é polêmica na literatura científica (GUGLIELMONE, 1995). Estudos experimentais tem demostrado diferentes formas de transmissão da Anaplasmose aos bovinos, dentre elas a iatrogênica, a transmissão biológica por carrapatos, insetos hematófagos e a transplacentária, sendo esta ainda foco de discussão (KOCAN, et al, 2003). Além destas, Ribeiro et al. (1995) relataram a forma congênita de transmissão ocasionando a anaplasmose neonatal. A transmissão biológica da A. marginale é bem descrita e já foi demonstrada experimentalmente em mais de 20 espécies de carrapatos da família ixodidae (KOCAN et al., 2004). Porém a relevância dos mecanismos de transmissão dessas espécies, em condições naturais, ainda não foi bem delineada (GONÇALVES-RUIZ et al., 2002). Uma importante consideração, em relação à transmissão biológica, feita por Kocan et al., (2002), é que alguns isolados de A. marginale, não infectam carrapatos, fato demonstrado experimentalmente com cepas isoladas no Brasil. Esta observação teve relação com a presença de estruturas denominadas apêndices, nos carrapatos, que se associavam à multiplicação da Rickettsia no epitélio

5 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite intestinal do B. microplus o que não acontecia quando esta estrutura estava ausente. Outra consideração, feita por Eriks et al. (1993), foi em relação à influência dos níveis flutuantes de parasitemia dos bovinos que contribui de forma direta para taxa de infecção dos vetores. Essa observação é importante, uma vez que colocam em evidência as demais formas de transmissão dessas Rickettsias na epidemiologia da Anaplasmose em bovinos (De LA FUENTE et al., 2005). Assim, a transmissão da Anaplasmose, realizada por dípteros hematófagos, tem sido relatada (Kocan et al., 2005). Esses vetores incluem diferentes espécies de tabanídeos Stomoxys calcitranse algumas espécies de mosquitos (KESSLER, 2001). Porém, Scoles et al. (2005), relatou que essa via depende fundamentalmente da parasitemia do sangue ingerido pelo inseto. Evidências epidemiológicas apontam que os principais vetores da doença em bovinos no país ainda são os carrapatos da espécie Boophilus microplus (GUGLIELMONE, 1995). E os mecanismos de transmissão dos agentes patogênicos por esses ectoparasitos ocorrem através das vias transovariana, transestadial (de larvas para ninfas e de ninfas para adultos) ou intraestadial (KESSLER, 2001; GONÇALVES- RUIZ et al., 2002). A transmissão transovariana ainda é bastante contestada na literatura científica (RIBEIRO & LIMA, 1996; GONÇALVES-RUIZ et al., 2002). Um estudo realizado por Moura et al. (2003), utilizando amplificação gênica pela técnica nested-pcr, detectaram a presença de DNA de Anaplasma na progênie de teleóginas de Boophilus microplus avaliada. Em concordância com este estudo Shimada et al. (2004), detectou pela mesma técnica a presença de DNA de A. marginale tanto em larvas presentes nas pastagens quanto nas teleóginas que realizavam o repasto sanguíneo em bezerros assintomáticos. Porém, não se pode afirmar que ovos e larvas de B. microplus transmitem a doença aos bovinos, apesar de estarem infectados (KOCAN et al., 2002). A transmissão transestadial (do estádio de larva para ninfa e de ninfa para adulto), pode ocorrer uma vez que o carrapato, apesar se ser um parasito monóxeno e realizar as ecdises sobre o hospedeiro, mudam frequentemente do local de fixação do instar anterior para fixarse novamente e iniciar a fixação e repasto sanguíneo em um novo instar (KESSLER, 2001).

6 128-1 st International Symposium of Dairy Cattle O mecanismo de transmissão intraestadial, de acordo com Potgieter (1981), é atribuído aos carrapatos machos. Eles são considerados um importante meio de transmissão dessas Rickettsia, e em virtude de sua grande movimentação e longevidade funcionando também como reservatório da doença. O ciclo de desenvolvimento da A. marginale é coordenado com as fases de repasto sanguíneo do carrapato, em relação à transmissão biológica. Os eritrócitos ingeridos de animais com altos níveis de parasitemia ao serem digeridos liberam a forma infectanteno epitélio intestinal do carrapato vetor. As Rickettsias então invadem as células do intestino médio do carrapato, mediada por receptores que de acordo com Davey & George (2002) representa o primeiro determinante da competência do vetor. Em seguida as Rickettsias sofrem replicação intracelular pelo processo de divisão binária. O processo continua com a invasão de outros tecidos, como as glândulas salivares onde ocorre uma nova fase de replicação culminando com o desenvolvimento da forma infectante da doença que representa o segundo determinante da competência do vetor (KOCAN et al., 1993; RIBEIRO & LIMA, 1996). Kocan et al (2004), relatou que em cada sitio de infecção, nos tecidos do carrapato, A. marginale desenvolve-se no interior de vacúolos formados pela invaginação da membrana da célula parasitada ou organizados em colônias. Dentro dessas colônias a primeira forma vista e a reticulada (vegetativa) que por sua vez, dividem-se por fissão binária formando grandes colônias com centenas de Rickettsias. Essas formas reticuladas evoluem paracorpos densos, que são as formas infectantes, capazes de sobreviver fora das células do vetor por um curto período de tempo (KOCAN et al., 2003). Esses corpos densos são as formas infectantes da A. marginalee são transmitidas ao hospedeiro vertebrado durante o repasto sanguíneo. Nos bovinos, elas infectam exclusivamente os eritrócitos e multiplicam-se por fissão binária produzindo rickttsemias persistentes. Bovinos constantemente infectados são considerados, dentro do rebanho, como fonte de infecção para os vetores, favorecendo a disseminação da rickéttsia (GUGLIELMONE, 1995). ESTRATÉGIAS DE CONTROLEDOS HEMOPARASITOS Inúmeros esforços têm sido concentrados, nas últimas décadas, no sentido de desenvolver técnicas mais efetivas para o controle de

7 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite hemoparasitoses. Porém, apesar dos avanços alcançados esse controle ainda representa um grande desafio. Os métodos profiláticos mais empregados para a erradicação dos parasitos da TPB envolvem premunição, o controle dos vetores por métodos químicos, biológicos e imunológicos, sendo o último, o meio mais eficiente de controle (PALMER & MCELWAIN, 1995; GONÇALVES, 2000). Premunição É um método bastante útil para o controle de hematozoários utilizado com a finalidade de promover imunidade especialmente em casos de animais provenientes de áreas de instabilidade enzótica e recém introduzidos nos rebanhos. Esse método consiste primariamente na exposição dos animais aos agentes transmissores da TPB, seguidos de tratamento adequado com objetivo de ativar as células de defesa do sistema imunológico do animal (KESSLER et al., 2002). O processo é baseado na inoculação de sangue de animais portador dos agentes da TPB em animais susceptíveis a doença, seguido de tratamento à base de drogas específicas (GONÇALVES, 2000). De acordo com Kessler et al (1991), o método mais correto de premunição do rebanho consiste da utilização padronizada de cada agente (A. marginale, B. bigemina e B. bovis), com inóculos produzidos em bezerros esplenectomizados, congelados em nitrogênio líquido com o número de parasitos quantificados em aproximadamente 100 hemácias parasitadas. É importante manter esse número, uma vez que o percentual de parasitos inoculados é diretamente dependente da virulência da amostra, além de tornar previsível o período em que os animais apresentarão os sinais clínicos da doença e a intensidade das infecções (KESSLER et al., 1987). É visto ainda como uma maneira de otimizar o tratamento dos animais com parasitemia, que se baseiam nos parâmetros de medida da temperatura corpórea, parasitemia, hematócritos, patogenicidade das amostras e por último a avaliação da resposta imune através de testes sorológicos. Após a primeira inoculação e recuperação dos animais é recomendado um reforço com mais duas ou três inoculações como forma de reforçar a imunidade adquirida. Em seguida é necessário realizar o primeiro desafio dos animais com a infestação por carrapatos da propriedade em que eles serão introduzidos antes de solta-los nas pastagens. Esse procedimento é de fundamental importância em razão

8 130-1 st International Symposium of Dairy Cattle da existência da diversidade antigênica entre as amostras existentes no país, porém deve ser feito de forma gradativa sempre seguida por tratamento (KESSLER et al., 1991; KESSLER et al., 1987). Foi observado que essa medida de premunição é capaz de determinar proteção contra a infectividade por hemoparasitos da TPB, apesar das variações entre as amostras das diferentes espécies. Porém, ela apresenta alguns inconvenientes como alto custo e principalmente riscos de disseminação de doenças especialmente entre os bezerros (MENDONÇA, et al., 2002). Outra importante limitação relatada por Kessler et al., (2002), é o risco da transmissão de outros tipos de afecções transmissíveis através do sangue, que acometem os bovinos, como a leucocitose bovina, a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), a diarréia viral bovina (BVD), tuberculose e leptospirose que se tornaram endêmicas, principalmente, nos rebanhos leiteiros. Apesar dos inconvenientes o uso desse método é recomendado, porém deve ser associados a outros métodos de controle. Controle químico dos vetores As estratégias de controle químico é uma das formas mais antigas para erradicação dos vetores causadores de doenças ao gado leiteiro (KOCAN, 2005). São dependentes do uso de acaricidas, como forma de controle profilático e terapêutico. Há relatos na literatura cientifica que o primeiro método eficiente usado no controle dos carrapatos ocorreu com produtos a base de arsênio (DAVEY, et al., 2002). Esse foi empregado por mais de 50 anos em vários países do mundo onde o carrapato representava uma ameaça à bovinocultura antes da resistência ao produto químico tornasse um problema. Como alternativa a essa droga foram criados os organoclorados que envolvem praticamente todos os grupos químicos de agrotóxicos existentes na atualidade, desenvolvidos para o controle de carrapatos (RAJPUT, et al., 2006). Essas drogas ainda são relatadas como sendo relevantes por alguns autores, no entanto sabe-se que essa prática acarreta inúmeras desvantagens, pois, além de dispendiosa, favorece a contaminação dos produtos de origem animal pela produção de resíduos químicos, causa poluição das cadeias alimentares, do meio ambiente contribuindo de maneira significativa para o surgimento de linhagens resistentes de

9 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite hemoparasitos reduzindo o período de proteção dos animais e aumentando o custo com o tratamento (DAVEY & GEORGE, 2002). De acordo com Kocan (2000), a resistência dos vetores causada pelos acaricidas é vista de forma bastante dinâmica especialmente em carrapatos de um único hospedeiro, como os do gênero Rhipicephalus Boophilus microplus, agentes das babesioses, fato que pode ser justificado devido ao menor período de tempo entre as gerações de acaris nos bovinos. A evolução da resistência desses vetores aos acaricidas tem sido um fator determinante na busca de novas formas de controle com maior eficácia e baixas taxas de infectividade. Controle biológico dos vetores As formas de controle biológico representam uma alternativa ao emprego de produtos químicos nas pastagens. Ela é baseada na compreensão das relações existentes entre os vetores e o meio ambiente, principalmente durante o estágio de vida livre, sua relação com os predadores e no possível uso de compostos naturais para controle dos mesmos (GONZALES, 2003). O ponto crucial para viabilidade dos ectoparasitos na fase de vida livre está diretamente relacionado à temperatura e umidade do ar. Dessa maneira o clima tem um papel crucial no equilíbrio das populações desses vetores, sendo capazes de alterar de maneira significativa o número de larvas viáveis em determinadas localidades (GINDIN, et al., 2002). Gonzales (2003) ao estudar o controle biológico de ectoparasitos relatou também a efetividade de manejo na rotatividade das pastagens, como uma estratégia que visa à diminuição de larvas infectantes. Além disso, pode-se utilizar ainda da inserção de microorganismos potencialmente patogênicosaos vetores da TPB nas pastagens para o controle dos ectoparasitos como bactérias Erwinea sp que agem produzindo infecções no trato genital das teleóginase alguns fungos entomopatogênicos dos gêneros Beauveria e Metarhizium que já apresentam eficácia estimada em aproximadamente 50% a 60% em relação à viabilidade infectiva dos ectoparasitos (GINDIN, et al., 2002). Outra importante estratégia relatada por Sonenshine (2004) seria o uso de ferormônios de carrapatos ou a introdução de machos estéreis entre os ectoparasitos como uma das ferramentas mais importantes de

10 132-1 st International Symposium of Dairy Cattle controle, semelhante às empregadas para o controle de alguns insetos, as quais têm sido relatadas como sendo efetivos (RAJPUT et al., 2006). Por fim, observa-se que um dos fatores chave nesse tipo de controle diz respeito ao estudo da ecologia dos parasitos. Esse representa uma das formas mais eficientes que contribui de maneira eficaz, para a otimização, tanto dos tratamentos químicos, quanto da manipulação ambiental e das estratégias utilizando da imunidade dos hospedeiros, tomando como base flutuações de picos sazonais de abundancia desses parasitos (SPICKETT, 1994). Controle imunológicodos vetores O uso de vacinas representa o método mais efetivo já avaliado, tanto em função de minimizar as perdas econômicas, quanto melhorar a qualidade de vida dos animais mantendo a produtibilidade dos mesmos (BABIUK, 2002; ANDRÉ, 2001). Além disso, esse método é visto como uma tecnologia promissora, alternativa aos métodos de controle tradicionais, premunição, sendo capaz de gerar memória imunológica, maior eficiência e segurança. De acordo com os estudos de Schenk et al., (1993), a estratégia de imunização é essencial, dentre outras condições, sempre que houver a transferência de animais de uma região em que as condições ambientais e ou químicas contribuem para a diminuição drástica dos vetores, para outra em que o vetor permanece nas pastagens o ano todo, ou ainda quando os mesmos são transferidos de uma região livre dos agentes para uma região endêmica. É recomendada a vacinação de todo o rebanho nessas condições, porém cuidados especiais devem ser tomados em casos de animais em fase reprodutiva, e vacas prenhes. Diversos tipos de vacinas desenvolvidas têm sido descritas e testadas, tanto em condições de laboratório quanto de campo, com o propósito de aumentar a resistência dos bovinos aos agentes da TPB e reduzir os efeitos clínicos da doença (BOCK et al., 2004). No entanto muitas delas ainda são incapazes de induzir um grau de proteção desejável provocado por uma infecção natural. Em resposta a isso o controle imunológico vem sendo explorado baseado em interações do parasito com o hospedeiro, que representa uma das formas mais importantes de imunomanipulação. Nesse sentido, um número crescente de moléculas protéicas provenientes tanto de extrato dos vetores, quanto de proteínas purificadas tem sido sugerido como

11 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite antígeno em potencial ao desenvolvimento de novas vacinas. Esse tipo de experimento já pôde ser observado nos estudos realizados por Da Silva Vaz Júnior et al., (1998) no qual foi descrito que a taxa de fecundidade das teleóginas alimentadas em bovinos imunizados com ovos, larvas ou tecidos adultos de R. microplus apresentavam-se mais baixas comparados as que alimentavam-se em bovinos não imunizados. Esses achados levantam a importância de novos estudos na busca de imunógenos candidatos a alvos vacinais. IMUNIZAÇÃO CONTRA OS AGENTES DA TPB Vacinas com cepas vivas atenuadas O rápido desenvolvimento da biotecnologia tem proporcionado o desenvolvimento de vacinas vivas atenuadas desde as décadas de 80 e 90. Essas passaram a representar uma alternativa ao método clássico de premunição como forma de prevenção de agentes patogênicos aos bovinos (BOCK et al., 2004). Essas vacinas estimulam tanto a imunidade local quanto sistêmica e algumas são eficientes na presença da imunidade materna (MADRUGA & ARAÚJO, 2001) Dois tipos de vacinas trivalentes produzidas pela Hemopar denominada Eritrovac refrigerada e Eritrovac N2congelada, ambas constituídas com imunógenos vivos contendo cepas atenuadas contra os agentes da TPB são utilizadas para imunização do rebanho no Brasil (KESSLER; SCHENK, 1998). A primeira é distribuída pronta para o uso, porém apresenta o inconveniente da necessidade de ser consumida em um período de no máximo cinco dias, após sua fabricação, o que inviabiliza testes prévios antes de sua liberação. Além disso, pode apresentar risco do produto conter agentes virulentos e ou outros contaminantes. Já a segunda depois de produzida, pode ser conservada por um longo período de tempo, o que favorece o teste prévio antes de sua liberação. Pode ser transportada para longas distâncias e aplicada simultaneamente em um número relativamente grande de animais sem necessidade de acompanhamento intensivo (KESSLER et al., 2000) Quatro anos depois da fabricação dessas vacinas, avanços tecnológicos produzidos pela Embrapa Gado de Corte em associação com o laboratório Hemopar RS, possibilitou a síntese de outra vacina, disponível no mercado com nome de Embravac Hemopar, com um

12 134-1 st International Symposium of Dairy Cattle grau de imunogenicidade um pouco maior que as já desenvolvidas (KESSLER, 1991). De acordo com Sacco et al. (2001) a imunização com essas cepas atenuadas demonstrou ser inócua imunogênica e eficiente, no entanto devem-se considerar, ao imunizar o gado, as diversidades fisiográficas do país e de cada região. Apesar de haver relatos em relação a eficiência conseguida com esse tipo de vacinação, algumas desvantagens têm sido relatadas como a dificuldade de estoque, risco de transmissão de outras doenças infecciosas e proteção parcial dos animais vacinados. Assim novas tecnologias à produção de vacinas são amplamente requeridas. Vacinas com cepas Inativas e exoantígenos Esse tipo de vacina, composta por microorganismos mortos, vem sendo estudado desde a década de 60, como forma de imunização do gado contra a Babesia bovis (Mahoney, 1967). Muitos inconvenientes têm sido relatados tanto em relação a sua produção, quanto ao transporte e grau de imunidade conferida ao rebanho imunizado (BOCK et al., 2004). Foi observado que bovinos inoculados com uma cepa de parasito inativado com adjuvante completo de Freund apresentaram apenas uma imunidade parcial, principalmente do tipo humoral e pouca ou nenhuma imunidade celular (MAHONEY, 1967). Desde então a comunidade científica, busca uma alternativa ao uso dessas vacinas. Resultados promissores tem sido relatados, ao empregarem exoantígenos provenientes do sobrenadante de cultura celular como forma de imunização do gado leiteiro (PATARROYO, et al., 1995). Por outro lado, vários grupos relatam que o período de duração da imunidade conferida por esses antígenos são consideravelmente inferiores quando comparado a imunizacao com vacinas com cepas vivas atenuadas, inviabilizando seu uso. Porém um achado interessante, observado por esses mesmos autores, foi que a pré-vacinação do gado com exoantígenos homólogos administrado antes das vacinas com cepas atenuadas, apresentavam capacidade em reduzir riscos de reacções (JORGENSEN et al, 1993). Novas pesquisas estão sendo realizadas na busca de novos antígenos, inativos, como possíveis alvos vacinais. Nesse sentido Wright et al. (1992) realizaram um sonicado de merozoítos de babesias para que fosse possível a realização de uma abordagem empírica. Seguindo essa mesma estratégia Brown et al. (2001) obtiveram os

13 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite antígenos através do método de eletroforese de fluxo contínuo. Tais métodos objetivaram encontrar alguns grupos de proteínas que possivelmente estivessem envolvidas no processo de invasão celular desses protozoários, além de identificarem novos imunógenos capazes de estimular clones de células T, aprimorando o sistema de defesa dos animais infectados (Palmer & Mcelwain, 1995). Vacina contra o carrapato Uma variedade de materiais antigênicos de diferentes tecidos do carrapato Boophilus microplus vem sendo descritos durante décadas (WILLADSEN, 2004). Dentre essas, destacam-se a identificação de antígenos provenientes de macerados do carrapato como um todo, antígenos larvais, extratos de antígenos das glândulas salivares, precursores de enzimas proteolíticas, proteínas do epitélio intestinal (Bm86, Bm91, BmA7), antígenos protéicos da vitelina e algumas glicoproteínas dos ovos das teleóginas (BYC), das cutículas, calreticulinas, dentre outras (DE LA FUERTA & KOCAN, 2006; TRIMNELL et al., 2005). Os estudos desses antígenos tiveram inicio com Willadsen et al., (1989) que isolaramglicoproteínasdas microvilosidades do epitéliointestinalde cepasaustralianas de R.(B.) microplus denominada Bm86. Desde a caracterização da Bm86, a primeira vacina comercial com um antígeno recombinante dessa glicoproteína (Bm86r), constituída por clonagem em Eschericia coli, produzida por pesquisadores australianos, foi liberada para consumo no ano de 1994, comercializada como TickGARD (Hoeschst Animal Health Austrália), e subsequentemente determinada TickGARD Plus (SMITH et al., 1995; WILLADSEN et al., 1989). Dez anos depois pesquisadores cubanos, usando o mesmo antígeno, desenvolveram nova formulação e sintetizaram a vacina Gavac (Heber Biotec AS, Havana, Cuba) e Gavac Plus atualmente comercializada em toda a América Latina (Gárcia-Gárcia, et al., 1998). O grau de efetividade da Gavac, relatada por Soares et al,(1998) conferiu uma proteção variandoentre 40% a 90%. Esses autores utilizaram como método de avaliação a quantificação do número de teleóginas no gado vacinado, comparado ao grupo controle, e a mensuração do peso das fêmeas de R.(B.) microplus. Observou-se ainda diminuição na postura e fertilidade dos ovos, com significativo comprometimento em todos os estágios de desenvolvimento do

14 136-1 st International Symposium of Dairy Cattle parasito, e consequentemente diminuição do número de carrapatos nas gerações subseqüentes (Rodriguez et al., 1994). O mecanismo de ação desse imunógeno ocorre por meio da produção de anticorpos anti-bm86, que contribuem para alterar os processos biológicos, e metabólicos da digestão. Durante o repasto sanguíneo em bovinos imunizados, os parasitos ingerem também esses anticorpos, que por sua vez, reconhecem os antígenos presentes em suas células intestinais e os neutralizam. Esse processo culmina com lesões irreversíveis na parede intestinal do parasito afetando o potencial reprodutivo do mesmo. Esses danos têm efeito acumulativo sobre as gerações de carrapatos, levando à redução da população nas pastagens e nos animais (PRUETT et al., 2006). Além da redução da população de carrapatos, os principais benefícios dessa vacina incluem redução significativa da freqüência de banhos com carrapaticidas, diminuição das doenças e mortalidade por hemoparasitoses. Por ser um produto Biológico não ocasiona malefícios ao homem, aos animais e ao meio-ambiente, os carrapatos não desenvolvem resistência, e os animais aumentam a produção de leite e carne, não havendo carência para uso dos mesmos (DE LA FUERTA & KOCAN, 2006). De acordo com Bock, et al., (2004) é importante desenvolver um programa de vacinação do rebanho associado aos métodos de controle convencionais até se chegar a um nível baixo de infestação, diminuindo progressivamente os intervalos de uso de acaricidas. E Soares, et al, (1998) relatou que a imunização do rebanho a cada seis meses é capaz de garantir proteção suficiente aos animais, convivendo com populações mínimas de parasitos, com riscos mínimos a saúde dos mesmos. Vacinas experimentais Vacinas derivadas de cultura in vitro: a técnica é vista, em muitos países, como uma alternativa à produção de antígenos contra os agentes da TPB (MANGOLD, et al., 1996). É tida ainda como uma valiosa ferramenta em pesquisa, no entanto, é utilizada para produção de vacinas apenas nos países em que são encontradas dificuldades àobtenção dessas cepas (BOCK, et al., 2004). Alguns inconvenientes têm sidorelatados em relação à virulência ou imunogenicidade das mesmas. Isto foi observado em relação a B. bovis, quando mantidas em cultura por longos períodos de tempo. Esse achado foi realizado por

15 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite Lew et al. (1997), que ao utilizar a técnica de PCR observou que as subpopulações de B. Bovis da cultura mudavam continuamente ao longo do tempo. Dessa maneira, há indícios de que, a proteção conferida aos animais imunizados com essas vacinas, provenientes de cultura em longo prazo, não são capazes de conferir proteção viável. Contudo, não é recomendada, a menos que se utilize técnicas de monitoração para averiguar mudanças e testar e imunogenicidade das cepas (Bock et al. 1995). Vacinas de Peptídeos sintéticos: novas tecnologias têm sido desenvolvidas, tanto para o descobrimento, quanto para aplicabilidade de peptídeos sintéticos como forma de prevenção, diagnóstico e controle de doenças hemoparasitárias (PATARROYO; GONZÁLES, 2004). Esses peptídeossão derivados de um grupo de proteínas que de acordo com Patarroyo & Guzman (2004), são alvos vacinais em potencial pela sua capacidade em simular sítios antigênicos ou receptores protéicos. Essa técnica tem se tornado mais vantajosa em comparação as vacinas tradicionais, uma vez que têm a vantagem de ser produzida em alta escala, a baixos custos, com alto grau de purezae estabilidade, além de permitir a manipulação da resposta imunológica (PATARROYO et al., 1995). Além disso, esses peptídeos se comportam como proteínas nativas representando dessa forma, ótimos imunógenos (PATARROYO; GONZÁLES, 2004). Vacinas com Proteínas associadas à roptrias (RAP): Proteínas de merozoítos íntegros ou de organelas do complexo apical, especialmente associadas à roptrias, têm-se mostrado importantes no processo de invasão e sobrevivência do parasitona célula hospedeira (BROWN, et al., 1996; PALMER & McELWAIN, 1995). Além disso, Palmer et al., (1991) ao avaliarem diferentes isolados geográficos, já haviam constatado que a RAP é uma das proteínas conservadase com alto potencial imunogênico, sendo importantes no processo de imunidade humoral e celular. Porém, essa constatação foi mais fortemente relacionada em isolados de B. boviscomparado aos de B. bigemina (BROWN, et al.,1996). Esta importância imunológica da RAP, segundo Figueroa; Buening (1991) pôde ser comprovada pela inibição do desenvolvimento in vitro da B. bovis, utilizando anticorpos monoclonais específicos contra esse imunógeno, e pela capacidade do anticorpo emconferir imunidade em relação às alterações de parasitismo no gado.

16 138-1 st International Symposium of Dairy Cattle Essas características da RAP a torna forte candidata a uma vacina especialmente contra B. bovis. Vacinas com proteínas principais de superfícies (MSPs) de Anaplasma marginale: Uma nova geração de vacinas com imunógenos da membrana externa desse parasito tem sido extensivamente estudada, por sua capacidade em induzir resposta imune protetoracontra desafio homólogo e parcialmente contra desafio heterólogo (TEBELE & PALMER, 1991). Já foram caracterizadas seis dessas proteínas (MSP1a; MSP1b; MSP2; MSP3; MSP4 e MSP5) como antígenos potenciais (TEBELE et al. 1991; OBERLE et al. 1993). Dessas a MSP1a e MSP2 vem demonstrando grande potencial imunogênico contra isolados virulentos de A. marginale, apesar do polimorfismo apresentada por MSP1a e da variabilidade genética de MSP2. Estudos observaram que a resposta imune de bovinos imunizados com MSP1a e MSP1b é do tipo humoral e os anticorpos contra esses imunógenos neutralizam a invasão da riquétsia às células do hospedeiro (McGarey & Allred, 1994). A MSP2, apesar de seu polimorfismo, possui epitopos conservados entre diferentes isolados. Tal fato foi verificado ao se constatar que células TCD4 específicas para MSP2 reconheciam epitopos comuns a vários isoladosde A. marginale. Desta forma a MSP2, é responsável por uma resposta humoral primária contra as distintas regiões variáveis (Brown et al. 2001). Bovinos imunizados com MSP3 mostraram uma resposta, frente a diversos isolados, semelhante à resposta a MSP2 A MSP4 está presente tanto na membrana interna quanto na membrana externa dessa riquétsia (Palmer & McGuire 1984), codificada por gene de cópia única (Oberle et al.1993), o seu potencial como imunógeno foi apenas parcialmente analisado. Já a imunização com a MSP5 nativa de acordo com Tebele et al. (1991) e Palmer et al. (1994), não conferiu proteção com isolado homólogo de A. marginale. Dessa forma as MSPs representam ferramentas promissoras no controle da doença

17 Controle integrado III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite Para a pecuária leiteira, é necessária uma abordagem pragmática tanto em relação aos carrapatos, quanto as doenças a eles associadas. De todas as formas de controle de hematozoários já abordadas, a maior efetividade ocorre quando elas são aplicadas de forma integrada. Nesse sentido, Perry et al., (1998), relataram um resultado significativo alcançado por meio da associação do uso estratégico de acaricidas, exploração da estabilidade endêmica e imunização do rebanho em condições endemicamente instáveis. Vale ressaltar que para melhor exploração dessas medidas de controle é de fundamental importância o conhecimento das diversas interações que regulam a epidemiologia dos agentes da TPB no gado leiteiro em diferentes regiões geográficas. Essa estratégia é indispensável tanto para aplicação quanto para o desenvolvimento de novas medidas de controle. Dessa forma consegue-se romper com a cadeia epidemiológica desses parasitos, diminuir a morbidade e mortalidade dos animais e consequentemente minimizar os grandes prejuízos à pecuária leiteira. TRATAMENTO As formas de tratamento do gado leiteiro, infectado com os agentes da TPB, especialmente em regiões enzóticas, devem ser focados, sobretudo no equilíbrio entre parasito hospedeiroe recuperação dos sintomas clínicos da doença (FARIAS, 1995). Para adoção de um tratamento adequado, é de fundamental importância que os animais sejam monitorados constantemente de maneira criteriosa, o que facilita o diagnóstico precoce da doença, quando as lesões ainda podem ser revertidas. Além disso, o tratamento deve ser instituído assim que a doença for diagnosticada, atentando paraa instituição de um protocolo adequado e por pessoal treinado. Cuidados devem ser tomados em relação às condições metabólicas e ao peso dos animais, antes de iniciar o tratamento. Isso é importante para adequar à dosagem dos medicamentos, evitando desta forma, a subdosagem ou a superdosagem. Diversas drogas são relatadas na literatura científica como forma de minimizar os impactos sistêmicos causados pela doença.

18 140-1 st International Symposium of Dairy Cattle A quimioterapia aos agentes da TPB pode ser direcionada especificamente aos parasitos associada a uma terapia de suporte para recuperação mais rápida dos animais, visando melhora do quadro clínico da doença especialmente em animais mais debilitados. Desta forma, o tratamento é feito com drogas de efeito babesicida (derivados de diamidina), anaplasmicida (tetraciclinas), ou de ação dupla (associação de diamidina com tetraciclina ou imidocarb) e nos casos mais graves, há necessidade de uma medicação de suporte associada a administração de drogas para melhora do quadro clinico dos animais (FARIAS, 1995). Quimioprofilaxia da TPB Babesicidas derivados da Diamidina Uma série de quimioterápicos babesicidas tem sido descritos na literatura. No entanto, poucos são disponíveis comercialmente (De Vos & Potgieter, 1994). Duas dessas drogas, mais amplamente comercializadas, é o aceturato de diminazeno e dipropionato de imidocarb, as quais podem ser usadas tanto para o tratamento da Babesia sp. quanto para anaplasmose. Esse complexo de drogas derivados de Diamidinas constitui na atualidade os babesicidas mais utilizados com eficácia comprovada e baixo nível de toxicidade para os animais. O método de atuação dessas drogas ocorre diretamente sobre os ácidos nucléicos do protozoário, distorcendo sua estrutura helicoidal e nas espécies de Babesia ela atua provocando vacuolização do citoplasma, redução dos ribossomos e dilatação da cisterna do núcleo. Após a administração dessas drogas a parasitemia sanguínea da B. bigemina diminui consideravelmente e em relação a B. bovis grande parte dos parasitos é degenerada. A dose e o número de aplicações do medicamento são dependentes da espécie causadora da doença. Assim para a B. bigemina baixas doses e uma única aplicação são suficientes já para B. bovis são necessárias no mínimo duas aplicações do medicamento com intervalo de 24 horas (FARIAS, 1995). O aceturato de diminazeno deve ser administrado na dose de 3,5 mg/kg, por via intramuscular, conferindo proteção por um período aproximado de 2 a 4 semanas (De Vos, 1979). Já o dipropionato de imidocarb, deve ser administrada por via subcutânea na dose de 1,2 mg/kg para tratamento das babesioses conferindo proteção contra B.

19 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite bovis aproximadamente por 4 semanas e B. bigemina, por um período de até dois meses e 3 mg/kg no caso da anaplasmose (De Vos & Potgieter, 1994). Em doses mais altas, foi relatado que o dipropionato de imidocarb pode ainda ser capaz de eliminar a B. bovis e B. bigemina em animais portadores, além de contribuir no desenvolvimento da imunidade após vacinação dos animais (De Vos, Dalgliesh, & McGregor, 1986). É recomendável repetir o tratamento somente após sete dias da primeira aplicação, não administrar o medicamento em vacas prenhes ou que estejam produzindo leite para consumo humano (FARIAS, 1995). Anaplasmicidas A antibioticoterapiaé o tratamento mais eficaz no combate aos sintomas clínicos da anaplasmose. Dentre as drogas mais utilizadas as tetraciclinas representam o maior grupo, apresentando eficácia comprovada contra muitas espécies de bactérias, tanto Gram-negativas quanto positivas, e até contra alguns protozoários (Kocan, et al., 2000). As tetraciclinas agem especificamente inibindo os ribossomos dos procariotos (bacteriano) bloqueando receptores na subunidade ribossomal 30s o qual se liga as trna durante o processo de traduçãogênica. Dessa maneira, essas drogas conseguem inibir a sintese de proteínas bacterianas impedindo dessa forma a replicação e consequentemente levando a morte celular (BOCK et al., 2004). O diagnóstico precoce e a administração da droga ainda na fase aguda da doença,contribui para supressão das fases de multiplicação, seguida da degeneração do parasito. Esse por sua vez, passa de uma forma distendida, vacuolizada a uma forma bastante reduzida e compactada com destruição gradativa das hemácias parasitadas. A droga deve ser administrada via intramuscular, e para controlar a infecção é necessário a dosagem de 10 mg/kg em no mínimo duas aplicações (FARIAS, 1995). Dos medicamentos mais conhecidos, que ainda fazem parte de grupo das tetraciclinas, são as Clortetraciclinas e Oxitetraciclinas. Sua importância está na capacidadeem controlar cepas resistentes com um simples ajuste de dosagem, o que não acontece com os outros antibióticos comumente utilizados, os quais facilmente atingem dosagens tóxicas. A dosagem recomendada de Clortetraciclina é de 5

20 142-1 st International Symposium of Dairy Cattle mg/kg com no mínimo cinco aplicações com intervalos de 24 horas. Já para Oxitetraciclina para um efeito de curta duração, a dosagem recomendada de 3-5 mg/kg com aplicações diárias ou 20 mg/kg para um efeito de longa duração em uma única aplicação é suficiente para provocar aregressão do quadro clínico. Medicação de Suporte O tratamento com drogas, especialmente quando a clínica da doença se apresenta de forma mais branda, é suficiente para reverter o quadro clínico. No entanto, recomenda-se a hidratação por meio da administração de um energético como o Stimovit associado à vitamina B12 a esses animais. E como forma de minimizar a sobrecarga hepática causada pelo excesso de hemoglobina metabolizada é comum o uso drogascom função hepatoprotetora,como o Antitoxil (FARIAS, 1995). Cuidados especiais devem ser tomados em relação à soroterapia, especialmente quando a clínica da doença apresenta sinais extremos. Ela se torna contra indicada especialmente em casos de anemia grave. Pois, uma vez que nesses casos, a viscosidade diminuída do sangue do animal somada à diminuiçãoda resistência do fluxo nos vasos periféricos contribui para aumento o debito cardíaco e consequentemente de sobrecarga cardíaca, podendo agravar ainda mais o quadro clinico do animal (Kocan, et al., 2000). Nos casos mais graves da doença, na maioria das vezes é necessária a transfusão sanguínea, como forma de evitar que ocorra choque hipovolêmico. Além disso, ela aumenta as possibilidades de potencializar o efeito das drogas. O limite de sangue a ser transfundidos é de no máximo dois litros a cada 250 Kg de peso do animal, considerando sempre a intensidade da anemia. Apesar de a anemia ser um dos agravantes causados pelos agentes da TPB, não há necessidade de suprimento de ferro. Pois, na anemia do tipo hemolítica a hemoglobina liberada é incorporada pelas células do sistema reticulo endotelial, e o ferro liberado é reutilizado para a formação de hemoglobina, ou armazenada no pool de ferritina (FARIAS, 1995). Podem ainda ser associados ao tratamento antiinflamatório/antitérmico associados a meios de controle dos parasitos. Porém de modo geral, a eficácia do tratamento envolve o

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