RESISTÊNCIA DE DIFERENTES VARIEDADES DE TOMATE (Solanum lycopersicum) À CONTAMINAÇÃO FÚNGICA

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1 RESISTÊNCIA DE DIFERENTES VARIEDADES DE TOMATE (Solanum lycopersicum) À CONTAMINAÇÃO FÚNGICA M.H.P. Rodrigues 1, K. C. Massarolo 2, A. Christ-Ribeiro 2, E. Badiale-Furlong 3 1- Escola de Química e Alimentos Universidade Federal do Rio Grande Avenida Itália, km 8 Rio Grande RS Brasil, Telefone: (53) (marcyheli@hotmail.com) 2- Escola de Química e Alimentos Universidade Federal do Rio Grande Avenida Itália, km 8 Rio Grande RS Brasil, Telefone: (53) (kellymassarolo@gmail.com) (anelise.christi@hotmail.com) 3- Escola de Química e Alimentos Universidade Federal do Rio Grande Avenida Itália, km 8 Rio Grande RS Brasil, Telefone: (53) (dqmebf@furg.br) RESUMO O tomate, Lycopersicon esculentum, apresenta propriedades nutricionais e funcionais que motivam a realização de estudos quanto a sua resistência a danos físicos e microbiológicos Neste trabalho os compostos fenólicos solúveis em metanol e etanol, seus perfis de ácidos fenólicos e a capacidade de inibir a atividade de α-amilase foram determinados para inferir sobre a resistência de variedades de tomate à contaminação fúngica. Foram escolhidas as variedades longa vida e italiano que foram submetidas a estas determinações para verificar verificar diferença entre as elas. Ambas as variedades mostraram-se boas fonte de compostos fenólicos (1,2 a 32 mg.g -1 ), que que estão relacionados com a resistência celular contra danos endógenos e exógenos, pois os extratos fenólicos atuaram como protetores da degradação hidrolítica, mostrando reduções ao redor de 43% da ação da α-amilase. ABSTRACT The tomato, Lycopersicon esculentum, presents nutritional and functional properties that motivate a study of its resistance to physical and microbiological damages. In this work the phenolic compounds soluble in methanol and ethanol, their profiles of phenolic acids and the capacity to inhibit an activity of α-amylase were determined to infer a resistance of tomato varieties to fungal contamination. They were chosen as varied long and final that were submitted to these determinations to verify the difference. Both of these were found to be good sources of phenolic compounds (1.2 to 32 mg.g-1), which are related to a cellular substance against endogenous and exogenous damages, since phenolic extracts act as protectors of hydrolytic degradation, showing reductions around 43% of the α-amylase action. PALAVRAS-CHAVE: compostos fenólicos; tomate; α-amilase. KEYWORDS: phenolic compounds; tomato; α-amylase.

2 1. INTRODUÇÃO A busca por novas técnicas de cultivo e modificação genética de variedades de tomate tem sido adotada para prolongar a vida pós-colheita deste fruto, uma vez que durante o amadurecimento ocorrem reduções drásticas n qualidade, demonstrada pela degradação das paredes celulares, na síntese do etileno e de carotenoides, aumento das atividades respiratória, hidrolítica e oxidativa. Fatos que também propiciam a degradação exógena, pois facilitam a contaminação microbiana (ZAO et al., 2010). O tomate, Lycopersicon esculentum, é um fruto muito popular e consumido in natura ou processado, é considerado um alimento funcional, pois contém antioxidantes, como ácido ascórbico, vitamina E, carotenoides, flavonoides, licopeno e ácidos fenólicos, além de sabor, cor e aroma agradáveis que propiciam seu uso em uma série de formulações alimentícias. (DAVIS et al., 2003). A composição química de tomates tem norteado a realização de diversos estudos com intuito de demonstrar o potencial funcional da fruta, mas neste contexto os compostos fenólicos do tomate tem sido pouco explorados quanto às suas propriedades protetoras contra a ação microbiana. No entanto, tecidos que possuem estes compostos tornam-se mais resistente a contaminação fúngica pois eles atuam segundo diversos mecanismos, tais como constituindo barreira física ou inibindo ação enzimática de hidrolases (α-amilase) e oxidorredutases (peroxidades), que além de diminuir a velocidade de amolecimento e escurecimento endógeno dificultam o crescimento fúngico e a manifestação de toxicidade de espécies toxigênicas (BEMVENUTI, 2014; MENDES et al., 2015; PAGNUSSATT et al., 2014). A concentração e distribuição de compostos fenólicos também é um indicativo de diferenças varietais, de condições de manejo da cultura e de meio ambiente. Desta forma, para melhor compreensão dos fatores que afetam a vida útil de tomates, neste trabalho foram determinados os compostos fenólicos solúveis em metanol e etanol, seus perfis de ácidos fenólicos e a atividade inibitoria de α-amilase para inferir sobre a resistência desta fruta a contaminação fúngica. 2. MATERIAL E MÉTODOS Foram coletados aleatoriamente tomates das variedades Italiano e Longa vida coletados aleatoriamente no comércio local de Rio Grande, RS. Os tomates foram higienizados e liofilizados previamente às determinações. 2.1 Determinação das Frações Fenólicas Os compostos fenólicos solúveis em etanol foram extraídos segundo SCAGLIONI et al. (2014) com modificações que consistiram em pesar 1 g de amostra liofilizada, agitar em mesa agitadora orbital a 200 rpm com 20 ml de etanol 80% por 10 min. Os extratos foram centrifugados a 3220 g por 10 min. A mistura foi filtrada e avolumada para 25 ml de etanol 80%. Os compostos fenólicos solúveis em metanol foram extraídos segundo SOUZA (2012) com modificações, que consistiram em tomar 5 g de amostra, homogeneizar com 50 ml de metanol em agitador orbital por 60 min a 200 rpm. O extrato foi evaporado em rotaevaporador a 60 C e ressuspenso com 10 ml de água destilada, 5 ml de hidróxido de bário 0,1 mol.l -1 e 5 ml de sulfato de zinco 5% para clarificação avolumando (25 ml).

3 Em ambas as frações a quantificação dos compostos fenólicos foi realizada por colorimetria após a redução do reagente Folin-Ciocalteau. A leitura das unidades de absorvâncias foram realizadas a 750 nm com auxílio de uma curva de calibração de ácido gálico (y = 0,0145x µg. ml -1 ) Perfil de ácidos fenólicos das frações fenólicas Para separação, identificação e quantificação cromatográfica dos compostos fenólicos foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado a detector DAD, empregando uma coluna de fase reversa C 18 (4,6 x 250 mm, 5 μg, Discovery, EUA) e como fase móvel metanol: água 1:1 Os padrões cromatográficos para a determinação de compostos fenólicos (ácido caféico, clorogênico, cumárico, ferúlico, gálico, hidroxibenzóico, protocatecóico, siríngico e ácido vanílico) foram injetados separadamente para determinar o tempo de retenção, em mistura para estabelecimento das curvas analíticas de cada um deles. 2.3 Inibição da atividade da α-amilase Foi empregada a enzima comercial α-amilase de Aspergillus oryzae (Fungamyl 800L, CEE 2006/121, Novozymes Latin America, Paraná, Brasil). A atividade da solução enzimática foi determinada pela degradação do amido estimada pelo método iodométrico (GARDA-BUFFON; BARAJ; BADIALE-FURLONG, 2010). O procedimento consistiu preparar reatores contendo 1 ml de tampão citrato-fosfato 0,1 M (ph 6,0), 1 ml de inibidor (extratos fenólicos em 3 níveis de concentração), 1 ml de solução de enzima, 1 ml solução de amido 1%. Após 10 minutos a reação foi inativada com 0,05 ml de HCl 0,5 M seguindo se adição de 0,1 ml de solução de Iodo 0,5% em KI e 0,85 ml de água destilada. No reator controle não foram adicionados os extratos fenólicos. A porcentagem de inibição de cada inibidor foi estimada pela relação da atividade enzimática sem inibidor (100%) com a atividade determinada na presença de cada inibidor. A inibição específica foi definida com o percentual de inibição promovido por 1 µg de compostos fenólicos no meio de reação. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO O conteúdo de compostos fenólicos solúveis em metanol e etanol dos tomates longa vida e italiano (Tabela 1) diferiram estatisticamente (p < 0,05) quanto ao tipo de solvente e entre as variedades. Os extratos etanólicos dos tomates apresentaram os maiores teores de compostos fenólicos. Os tomates longa vida são modificados geneticamente com o intuito de proporcionar maior conservação pós-colheita permanecendo firme por um maior período de tempo, oferecendo maior flexibilidade ao produtor quanto ao período da colheita, menor perda nas operações de embalagem e transporte dos frutos e menor perda na comercialização dos frutos no varejo. Por esta razão esperava-se que as frações alcoólicas do tomate longa vida apresentassem os maiores conteúdos em compostos fenólicos. Tendo em vista que alguns ácidos fenólicos tem demonstrado atividade antimicrobiana (ácido gálico) (RAVN et al., 1989) e atividade antifúngica (ácido caféico) e antioxidante (FERNANDEZ-PINTO et al., 2008) que são importantes para prolongar a vida útil de tecidos vegetais, o que o sinaliza como longa vida.

4 Tabela 1 Conteúdo fenólico das frações metanólicas e etanólicas de tomates Variedades Ext. Metanólico (mg.g -1 ) Ext. Etanólico (mg.g -1 ) Italiano 5,6 a 32,7 b Longa Vida 1,2ª 28,5 b Ext: extrato; letras diferentes no sobrescrito indica diferença estatística significativa (p < 0,05) A quantificação de compostos fenólicos solúveis em extratos alcoólicos pelo método espectrofotométrico mostrou maiores concentrações de compostos redutores do reagente de Folin Ciocalteau do que a soma dos ácidos fenólicos separados, identificados e quantificados por cromatografia líquida (Tabela 2). Este fato é uma evidência da presença de outros compostos com caráter redutor, tais como fenóis não ácidos, os quais também podem possuir atividade biológica de interesse, como, por exemplo, a classe dos flavonoides. Considerando que os ácidos fenólicos são usualmente associados à ação antimicrobiana priorizou-se suas determinações neste estudo preliminar. Tabela 2- Perfil dos compostos fenólicos presentes nas frações metanólicas e etanólicas Variedades Ext metanólico Concentração Ext etanólico Concentração (mg.g -1 ) (mg.g -1 ) Longa vida Ac.protocatecoico 2,0 Ác.protocatecoico 5,6 Ác. clorogênico 0,4 Ác. clorogênico 1,1 Ác. idroxibenzoico 0,1 Ác.hidroxibenzoico 0.4 Italiano Ác. protocatecoico 3,3 Ác. protocatecoico 5,4 Ext: extrato Ac: ácido Ác. clorogênico 0,5 Ác. clorogênico 0,9 Ác.hidroxibenzoico 0,2 Ác.hidroxibenzoico 0.3 Geralmente os ácidos fenólicos estão presentes em altas concentrações nos tecidos sadios das plantas e, em alguns casos, como resultado da infecção de patógenos, podem ser convertidas em substâncias altamente tóxicas. Assim a identificação dos ácidos fenólicos nos extratos alcoólicos dos tomates foi realizada e mostrou que o principal ácido fenólico encontrado nos extratos fenólicos das variedades de tomate foi o ácido protocatecoico. Este é conhecido por ser um composto do metabolismo secundário pré-existentes nos tecidos vegetais cuja função é inibir a atividade microbiana, portanto envolvido na resistência da matriz contra fitopatógenos. Os resultados da atividade inibitória de alfa amilase dos extratos alcoólicos das variedades de tomate foram considerados, neste estudo, como indicativos de atividade antifúngica e estão apresentados na Tabela 3.

5 Tabela 3 Inibição percentual e específica de α amilase pelas frações fenólicas dos tomates Variedade (µg.ml -1 ) Extrato metanólico Extrato etanólico % Inibição Inibição especifica (% I. µg -1 ext) % Inibição Inibição especifica (% I. µg -1 ext) Italiano c ,5 0,6 0,5 Italiano c2 27,1 4,7 NI - Italiano c3 19,2 1,6 NI - Longa vida c1 19,3 17,5 7,7 7,0 Longa vida c2 29,0 5,1 NI - Longa vida c3 43,0 3,8 NI - O estudo da inibição da enzima α-amilase é importante porque os compostos inibitórios são encontrados naturalmente nas plantas, desempenhando papel no controle do acúmulo e uso de carboidratos, bem como na proteção contra ataques de patógenos, principalmente fungos e insetos (FRANCO et al., 2000; PAGNUSSATT et al., 2012). Assim, a atividade inibidora de compostos nesta enzima pode ser utilizada como indicador de eficiência antifúngica, e por isto empregada neste estudo para inferir sobre a resistência das variedades a este dano. Conforme o esperado os extratos contendo os compostos fenólicos do tomate longa vida extraídos com metanol mostraram maior poder de redução da atividade da α-amilase. Os compostos fenólicos dos tomates que foram extraídos com etanol não apresentaram efeito sobre a inibição de α-amilase marcante, com destaque para o menor nível de compostos fenólicos no extrato etanólico de tomate longa vida. Importante verificar que a maior inibição da atividade enzimática ocorre com proporções menores de fenóis em relação ao conteúdo de enzima no meio, sugerindo que ocorre inibição competitiva dela; indicando que pode ser viável empregar compostos fenólicos extraídos de tomate contra a contaminação fúngica longo da cadeia produtiva. A determinação da atividade inibitória da amilase mostrou-se um parâmetro interessante para estimar a vida útil de variedades de tomate, visto que permitiu identificar diferenças entre este potencial para cada variedade. Lembrando que a contaminação fúngica é uma das principais causas de perdas pós-colheita de frutas e hortaliças. 4. CONCLUSÃO As variedades de tomates possuem diferentes conteúdos de compostos fenólicos extratáveis com metanol e etanol, sendo nelas o composto mais abundante o ácido protocatecóico. As variedades estudadas são boas fontes de compostos fenólicos que conferem resistência celular contra danos endógenos e exógenos, conforme indicado pela

6 atividade inibitória dos extratos fenólicos contra a atividade hidrolítica de α amilase, até 3,8 % de inibição específica promovida pelo extrato metanólico de tomate longa vida. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bemvenuti, R. H. (2014). Inibição de linhagens do complexo Fusarium graminearum por compostos naturais e sintéticos f. (Tese de doutorado). Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande. Davis, A. R.; Fish, W. W.; Perkins-Veazie, P. (2003). A rapid spectrophotometric method for analyzing lycopene contente in tomato and tomato products. Postharvest Biology and Tchnology, Amsterdan, 28 (3); Fernandez-Pinto, V. E.; Termminiello, V. C.; Basilico, J. C.; Ritieni, A. (2008). Natural occurrence of nivalenol and mycotoxigenic potential of Fusarium graminearum strains in wheat affected by head blight in Argentina. Brazilian Journal of Microbiology, 39; Franco, O. L.; Rigden, D. J.; Melo, F. R.; Bloch, J. R. C.; Silva, C. P.; Grossi-Desá, M. F. (2000). Activity of wheat a-amylase inhibitors towards bruchid a-amylases and structural explanation of observed specificities. European Journal of Biochemistry, 267; Garda-Buffon, J.; Badiale-Furlong, E. (2010). Kinetics deoxynivalenol degradation by Aspergillus oryzae and Rhizopus oryzae in submerged fermentation. Journal of the Brazilian Chemical Society, 21; Mendes, G. L.; Pagnussatt, F. A.; Bretanha, C. C.; Badiale-Furlong, E. (2015). α-amylase inhibitors from wheat against development and toxigenic potential of Fusarium verticillioides. Cereal Chemistry, 92; , Pagnussatt, F. A.; Meza, S. L. R.; Garda-Buffon, J.; Badiale-Furlong, E. (2012). Procedure to determine enzyme inhibitors activity in cereal seeds. Journal of Agricultural Science; 4; Pagnussatt, F. A.; Del Ponte, E. M.; Garda-Buffon, J.; Badiale-Furlong, E. (2014). Inhibition of Fusarium graminearum growth and mycotoxin production by phenolic extract from Spirulina sp. Pesticide Biochemistry and Physiology, v. 108; Ravn, H.; Andary, C.; Kavacs, G.; Molgaard, P. (1989). Caffeic acid as in vitro inhibitors of plant pathogenic bacteria and fungi. Biochemistry Systematics and Ecology, 17; Scaglioni, P. T; De Souza, T. D.; Schimidt, C.; BADIALE-FURLONG, E. (2014). Availability of free and bound phenolic compounds in rice after hydrothermal treatment. Journal of Cereal Science, 60; Souza, M.M. (2012). Potencial antifúngico, antioxidante e inibidor da síntese de aflatoxinas dos extratos fenólicos de Chlorella sp. e Spirulina platensis. (Disseratção de mestrado). Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande, Rio Grande do Sul. Zao, Z.; Wang, Q.; Wang, K.; Brian, K.; Liu, C.; Gu, Y. (2010) Study of the antifungal activity of Bacillus vallismortis ZZ185 in vitro and identification of its antifungal components. Bioresource Technology, 101;