POLIMORFISMOS DO GENE EGFR E ASSOCIAÇÃO COM FATORES PROGNÓSTICOS DO CÂNCER DE MAMA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA E QUÍMICA MEDICINAL POLIMORFISMOS DO GENE EGFR E ASSOCIAÇÃO COM FATORES PROGNÓSTICOS DO CÂNCER DE MAMA MARCELO SOBRAL LEITE RIO DE JANEIRO 2012

2 Marcelo Sobral Leite POLIMORFISMOS DO GENE EGFR E ASSOCIAÇÃO COM FATORES PROGNÓSTICOS DO CÂNCER DE MAMA Dissertação apresentada à Pós-Graduação em Farmacologia e Química Medicinal do Instituto de Ciâncias Biomédicas da Universidade Ferderal do Rio de Janeiro, como requisito à obtenção do título de mestre em Farmacologia. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Rosane Vianna Jorge Rio de Janeiro 2012

3 Leite, Marcelo Sobral. Polimorfismos do gene EGFR e associação com fatores prognósticos do câncer de mama Rio de Janeiro: UFRJ/ICB, f. Orientadora: Profª. Drª Rosane Vianna-Jorge. Dissertação (Mmstrado) UFRJ/ICB/Pós-graduação de Farmacologia e Química Medicinal, Referências Bibliográficas: f Câncer de mama. 2.Polimorfismo. I. Título. CDD:

4 ...à minha mãe.

5 AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer primeiramente a todas as mulheres, pacientes de câncer de mama do Hospital do Câncer III do INCA, pelo carinho, sorrisos, forças, emoções e aprendizados. Sinceros agradecimentos às pacientes que aceitaram participar deste estudo e se esforçaram para responder sinceramente ao questionário aplicado. Este trabalho não teria sido realizado sem o apoio dos diversos setores do Hospital do Câncer III do INCA. Muito obrigado a todos os colegas dos Serviços de Psicologia, Serviço Social, Fisioterapia, em especial ao Fisioterapeuta Ricardo Dias, Érica, Maria Gisele, Nayana, Elisângela, e a Zuleica, a Penha e tantos outros. Obrigado a todos do Laboratório de Análises Clínicas, a Tereza, Rita, Rosane; da Oncologia Clínica, ao Dr. Luis Guilherme, a todos da Farmácia, do Centro de Estudos, do Serviço de Quimioterapia e todas as enfermeiras. Agradeço imensamente a colaboração do prof. Rodrigo Moura-Neto e a todos de seu laboratório, Priscila, Tatiana; a colaboração da Dra Gisele Vigdinal do Serviço de Patologia do INCA; a colaboração do Departamento de Genética do CPq/INCA, em especial a Kelly, Leila, Priscila, Hanna, João; a colaboração do prof. Marcelo Alex, e de todos os colegas da farmacologia do INCA, Renata, João, Giu, Cínthias, Mateus, Fê, Vera, Vanessa, Thales; a todos da Pesquisa Clínica e BNT, Maurício, Fernandinha, Vivi, Haynna, Andrea e Valadão; e aos amigos do Grupo de Farmacologia Clínica e Assistência Farmacêutica: Ju, Carol, Diogo, Vanessa, Sheyla, João, Tales, Taiana, Padula, Hayra, Laura, Camila, Márcia... e em especial a Letícia Giacomin pela parceria e a Rosane pela orientação. Agradeço ao Departamento de Farmacologia e Química Medicinal da UFRJ, as professoras Tereza Sollero, Cláudia Benjamin, Cláudia Martins e Eline, os professores Paulo Melo e Newton, e a todos os alunos da pós pelo apoio incondicional. Agradeço a American Association for Cancer Research e a Avon Fundation pelo apoio, oportunidade e incentivo. Aos colegas da Perinatal, Chico, Simones, Adriano, Anna, Ana, Susana, Michael, Odália, Dr. Jofre e Dr. Fernando, Izaura, Marta, Fábia, etc... Agradeço a todos os meus amigos que me apoiaram e incentivaram, a minha irmã Gê, a Paulinha, Jô, Carol, Om, Clara, Gracinha, Chamusca, Torvi, Ariel, Blenda, Billy, Pryia, amigo Felipe, Enoque e todos da Mansão. Gio, obrigado, sua força chegou aqui. Por fim, minha eterna gratidão ao meu Mestre da Vida, Dr. Daisaku Ikeda, Presidente da Soka Gakkai Internacional; e a todos os amigos místicos

6 da Associação Brasil SGI, Simas, Monique, Selma, Joanas, Cida, Wal, Giovana, Ari, Naza, Earl Taylor, Márcia Nicolau e tantos maravilhosos companheiros! Forte agradecimento ao Paulo, Vitor, Tom e todos os membros do Tayio Ongakutai! A minha afilhada Letícia, meus cumpadres Lázaro e Yara, pela ausência necessária. A toda minha família, primo Augusto, Vanessa, prima Nina, Andrea tia Celita, Tania, minha Vó, Laís e Alexandre. Meus sinceros agradecimentos eternos ao meu pai, e a minha mãe.

7 "Se você quer descobrir alguma coisa, tem que acordar e dormir com essa coisa na cabeça. Não pode dispersar. Octavio Augusto Ceva Antunes

8 Lista de Simbolos º grau(s) marca registrada % porcentagem somatória menor ou igual maior ou igual < menor que > maior μ micro (10-6 ) Lista de Abreviaturas ác. ácido ajus ajustado Arg arginina cr crude IC95% Intervalo de confiança de 95% Lys lisina mg miligramas min minuto(s) N número de amostras p/v peso por volume pb pares de base pn status linfonodal pt tamanho tumoral ptmn estadiamento TNM p/ para s/ sem

9 Lista de Siglas ASCO American Society of Clinical Oncology CAP College of American Pathologists DNA ác. desoxirribonucleico EGF epidermal growth factor. EGFR receptor de EGF ERR Estimativa de Risco de Recorrência da Doença GSK-3ß glicogênio sintase cinase 3ß HBEGF heparin binding EGF like growth factor INCA Intituto Nacional do Câncer IP 3 trifosfato de inositol-1,4,5 MAPK cinases ativadas por mitógeno NPI Nottingham Prognostic Index NRG neuregulin OR odds ratio PCR polymerase chain reaction PI3K fosfatidilinositol trifosfato cinase PIP 3 fosfatidilinositol trifosfato RE Receptor de Estrogênio RFLP restriction fragment length polymorphism RNA ác. ribonucleico RP Receptor de Progesterona SNP single nucleotide polymorphism - TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TGFα transforming growth factor α UICC International Union Against Cancer WHO World Health Organization

10 SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO CÂNCER CÂNCER DE MAMA POLIMORFISMOS GENÉTICOS OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL E MÉTODOS DESENHO DO ESTUDO PACIENTES FORMULÁRIOS VARIÁVEIS CLINICO-PATOLÓGICAS ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS POPULAÇÃO ASSOCIAÇÕES GENÓTIPO X FENÓTIPO DISCUSSÂO CONCLUSÂO REFERÊNCIAS ANEXOS

11 RESUMO Introdução: O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) é um receptor tirosina-cinase que desempenha papel crucial no crescimento celular, regulando a diferenciação das células e tecidos. O EGFR encontra-se frequentemente super expresso em muitos tumores, inclusive no câncer de mama e contribui para uma proliferação anômala. Um polimorfismo do gene EGFR é uma sequência de repetição CA no intron 1 (rs ). Sequências mais curtas, i. e (CA)n 16 são associadas a maior atividade transcricional em tumores de mama. Outro polimorfismo, uma troca de um único nucleotídeo, R497K (rs ), localizado no exon 13, está associado a um prognóstico favorável em carcinoma colorretal e em câncer de pulmão.o objetivo deste estudo foi investigar a associação entre estes polimorfismos do gene EGFR e variáveis histopatológicas com valor prognóstico em câncer de mama. Materiais e métodos: A população de estudo foi formada por mulheres brasileiras ( 18 anos de idade), com diagnóstico confirmado de câncer de mama unilateral não metastático. O DNA genômico foi extraído de amostras de sangue e a análise do tamanho de fragmento do intron 1 foi determinado por eletroforese de capilar em 426 pacientes, enquanto o polimorfismo R497K foi identificado em 472 pacientes por reações de PCR seguidas de digestão com enzima de restrição. O perfil histopatológico foi determinado após a ressecção do tumor. A associação entre os genótipos do EGFR e as características histopatológicas foram analisadas pelo teste do chi-quadrado, com cálculo das razões de chance (odds ratio, OR) simples e ajustadas, com seus intervalos de confiança (IC95%). Resultados e discussão: Onze alelos diferentes foram encontrados para o polimorfismo (CA)n, variando de 14 a 24 repetições, formando 37 genótipos diferentes. O alelo mais frequente foi o de 16 repetições CA (0,425; IC95%, 0,398-0,460). A frequência do alelo variante do R497K (Lys), foi de 0,218 (IC95%, 0,192 0,245). Pacientes com os dois alelos longos, i.e (CA)n > 16 repetições, mostraram menor chance de apresentar status de receptor de progesterona negativo (OR ajus = 0,324; IC 95%, 0,124 0,845). Pacientes com pelo menos um alelo Lys mostraram menor chance de apresentar status linfonodal pn2 ou pn3 (OR ajus = 0,332 ; IC95%, ), o que contribui para melhor estadiamento TNM (OR ajus = 0,389; IC95%, 0,202 0,749) e melhor estimativa de risco de recorrência (OR = 0.470; IC95%, 0,278 0,794) quando comparados aos pacientes com genótipo R497K predominante (Arg/Arg). Pacientes com pelo menos um alelo Lys e com os dois alelos de repetição CA longos mostraram menor estimativa de risco de recorrência (OR = 0,210; IC95%, 0,063 0,695). Conclusão: A combinação dos dados dos dois polimorfismos do gene EGFR sugere que a presença das formas variantes contribui para melhor prognóstico no câncer de mama. Palavras-chave: EGFR, polimorfismo, câncer de mama, prognóstico.

12 ABSTRACT Introduction: The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a transmembrane tyrosine kinase receptor, which plays an essential role in growth by regulating the differentiation of cells and tissues. EGFR is frequently overexpressed in many tumors, including breast cancer, and contributes to unrestricted proliferation. One EGFR gene polymorphism is a (CA)n dinucleotide repeat sequence (rs ) in intron 1. Shorter sequences, i.e (CA)n 16 dinucleotide repeats are associated with increased EGFR transcriptional activity in breast tumors. Other, single nucleotide polymorphism, R497K (rs ), located in exon 13, is associated with favorable prognosis in colorectal carcinoma and lung cancer. The aim of the present study was to investigate the association between EGFR polymorphisms and histopathological variables with prognostic value in breast cancer. Material and method: The study population consisted of Brazilian women ( 18 years old) with a confirmed diagnosis of unilateral non-metastatic breast cancer. Genomic DNA was extracted from blood samples and the fragment length of the intron 1 was determined by capillary electrophoresis in 426 patients, whereas R497K was identified in 472 patients by PCR-RFLP. The histopathological profile was determined after tumor resection. The association between EGFR genotypes and histopathological features was evaluated by the Chi-square test, with calculation of the adjusted odds ratios (OR ajus ) and their 95% confidence intervals ( 95% CI). Results and discussion: Eleven different (CA)n alleles were found, ranging from 14 to 24 repeats, forming thirty seven different genotypes. The major frequent allele was (CA)16 (0.425; 95%CI, ).The frequency of the R497K variant (Lysi) allele was ( 95% CI; ). Patients with two long alleles, i.e. (CA)n > 16 repeats, showed a lower chance of being negative for progesterone receptor (OR ajus = 0.324; 95% CI, ). Patients with at least one Lys allele showed a lower chance of presenting lymph node status pn2 or pn3 (OR ajus = 0.332; 95% CI, ), which contributed for lower stages in TNM status, (OR ajus = 0.389; 95% CI, ) and lower estimated risk of recurrence (OR = 0.470; 95% CI, ), than those who were Arg/Arg. Patients with at least one Lys allele and with two long (CA)n alleles showed a lower estimated risk of recurrence (OR = 0.210; 95% CI, ). Conclusion: The combined data of R497K and (CA)n repeat polymorphism suggests that the presence of the variant forms of EGFR contribute for better prognosis in breast cancer. Key-words: EGFR, polymorphism, breast cancer, prognosis.

13 1 INTRODUÇÃO 1.1 CÂNCER Câncer é o nome genérico dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células que invadem tecidos e órgãos. Dividindo-se rapidamente, estas células tendem a ter um perfil metabólico anômalo e arranjo celular desordenado, determinando a formação de tumores malignos, que podem espalhar-se para outras regiões do corpo (Moore 1966). O câncer pode ser considerado uma doença genética, uma vez que é desencadeado por alterações no DNA da célula. No entanto, o câncer não é necessariamente uma doença hereditária. Os cânceres humanos são, na sua maioria, de origem somática, resultantes da interação de fatores genéticos e ambientais (Perera et al. 1997). A incidência de câncer no mundo vem aumentando rapidamente nos últimos anos em decorrência do envelhecimento da população mundial e da crescente exposição a fatores de risco ambientais. A Organização Mundial da Saúde estimou que, no ano 2030, podem-se esperar 27 milhões de casos incidentes de câncer, 17 milhões de mortes por câncer e 75 milhões de pessoas vivas, anualmente, com câncer (WHO 2010). Assim, terapias cada vez mais eficazes para o combate a esta enfermidade e a otimização de terapias utilizadas atualmente se fazem necessárias. No Brasil, as estimativas do Instituto Nacional do Câncer para o ano de 2012 (válidas também para 2013) apontam a ocorrência de casos novos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país (INCA 2011). O quadro 1 mostra os 10 tumores com maiores estimativas de incidência em 2012, excetuando-se o câncer de pele não melanoma, e suas respectivas distribuições percentuais de acordo com o sexo (INCA 2011). 13

14 Quadro 1: Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2012 por sexo, exceto pele não melanoma (números arredondados para 10 ou múltiplos de 10) (INCA 2011) Biologia do câncer A formação de um tumor é um processo complexo e frequentemente se estende por décadas. A maioria dos tumores humanos se desenvolve a partir de tecidos epiteliais. Os tumores oriundos destes tecidos são denominados carcinomas (Peto 2001). O aumento no grau de anormalidade tecidual de células em crescimento e proliferação exacerbada é um processo comum no caminho da progressão tumoral, no qual células consideradas normais se desenvolvem progressivamente em fenótipos malignos, passando por etapas que mantém o seguinte sentido: normal hiperplásico displásico neoplásico metastático. A ciência busca entender a relação entre causa e efeito destes eventos (Preston-Martins et al 1990). Hanahan et al. (2000) enumeraram as seis alterações celulares básicas que contribuem para a carcinogênese. Podem ser citadas: autossuficiência em relação aos fatores de crescimento; insensibilidade aos inibidores de crescimento; evasão à morte celular programada por apoptose; potencial ilimitado de replicação; angiogênese sustentada; invasão tecidual; disseminação à distância (figura 1). 14

15 Figura 1: Capacidades adquiridas na carcinogênese. Ocorrem de maneira semelhante nos processos de desenvolvimento dos tumores, através de funções originadas por diversos mecanismos e estratégias celulares. Adaptado de Hanahan et al. (2000). Assim, diversos genes associados a estes mecanismos e ao reparo aos danos do DNA são atualmente estudados buscando a compreensão do processo de carcinogênese (Hoeijmakers 2001; Wilson et al. 2002) Fatores de crescimento As células normais necessitam de sinais mitogênicos para desencadear seus processos de transformação do estado quiescente para os estados ativo ou proliferativo (Fedi et al. 1997). São sinais estimulatórios, mediados por fatores de crescimento, que se ligam a receptores transmembranares, que integram tal sinal de ligação a circuitos complexos dentro da célula (Alberts et al. 2004). Em sequência ao evento inicial de ligação entre o fator de crescimento e seu respectivo receptor, diversas moléculas mensageiras realizam a transdução de sinal via uma rede de proteínas transdutoras que irão desencadear atividades celulares, tais como a transcrição gênica no núcleo e o repasse destas informações para células vizinhas (Alvarado et al. 2010). Esta 15

16 cadeia de eventos se inicia com a fosforilação de resíduos de tirosina na porção intracelular do receptor e, para tanto, os domínios com atividade tirosina-cinase cumprem papel crucial no mecanismo de transdução de sinal proliferativo (Aaronson 1991; Avraham & Yarden 2011). A família ErbB de receptores com atividade tirosina-cinase consiste de quatro membros: receptor para fator de crescimento epidermal (EGFR; ErbB- 1), HER2 (ErbB-2 ou Her2-neu), HER3 (ErbB-3) e HER4 (ErbB-4) (figura 2); que desempenham funções envolvidas nos processos de migração, crescimento, adesão e diferenciação celular, eventos chaves na progressão tumoral (Shepard et al. 2008; Flynn et al. 2009; Da Silva et al. 2010). Figura 2: Representação esquemática dos ligantes da família ErbB de Homo sapiens. A semelhança entre as cadeia de aminoácidos dos os receptores varia de 53% entre EGFR e ErbB3 a 64% entre EGFR e ErbB2 (Jorissen 2003). Pelo ponto de vista tridimensional, as regiões extracelulares da região C-terminal se diferenciam mais entre os homólogos da família. Quando ligantes específicos interagem com o domínio cinase, ocorre a formação de dímeros e ativação dos domínios tirosina-cinase e promoção da atividade intracelular. A formação de homodímeros e heterodímeros é definida de acordo com os ligantes e a interação entre os homólogos (Olayioye et al. 2000). HBEGF: heparin binding EGF like growth factor; NRG: neuregulin; TGFα, transforming growth factor α; EGFR: epidermal growth factor. Adaptado de Avraham & Yarden (2011) EGFR O receptor do fator de crescimento epidermal (epidermal growth factor receptor EGFR), é uma estrutura transmembrana sensível a sinais proliferativos representados pelo fator de crescimento epidermal (epidermal growth factor EGF) e pelo fator de transformação e crescimento α (transforming growth factor-α TGF-α). O receptor do fator de crescimento Epidermal (EGFR) é uma glicoproteína transmembrana de 170 kda, com atividade tirosina-cinase, que tem um papel crucial na proliferação, 16

17 diferenciação e motilidade de células normais e tumorais (Jimeno & Hidalgo 2006). O EGFR é uma proteína codificada pelo gene EGFR, que está situado no braço longo do cromossomo 7, sendo codificado a 25 exons. É sintetizado a partir de um precursor polipeptídico de 1210 resíduos e, após clivagem de sequência da porção N-terminal, a proteína de 1186 resíduos é inserida na membrana celular (Jorissen 2003). A ligação de fatores específicos promove a formação de homodímeros ou heterodímeros com outros membros da família erbb, desencadeando a fosforilação de vários resíduos de tirosina do domínio intracelular (Olayioye et al. 2000; Modjtahedi & Essapen 2009) (figura 3). Aqui, são descritos alguns mecanismos que resultam na fosforilação de vários substratos intracelulares que irão ativar diversas cascatas intracelulares (Shepard et al. 2008; Spano et al. 2008). Figura 3: Um receptor de fator de crescimento epidermal funcionando normalmente emite sinais (em vernelho) em resposta à interação com o ligante Adaptado de Weinberg (2008). A cascata de fosforilação desencadeada pela ativação do EGFR vai atuar através da atividade de uma complexa rede de proteínas que atuam como mensageiras da transdução de sinais proliferativos (Mendelsohn & Baselga 2003; Jimeno & Hidalgo 2006; Flynn et al. 2009; Jorissen 2003) (figura 4). Um dos principais mecanismos do receptor envolve a ativação da proteína Ras via um fator de troca de nucleotídeo de guanina, levando à atividade de uma série de cinases ativadas por mitógeno (MAPK), como Raf, MEK, Erk1 ou 2, que irão regular a transcrição de genes e fatores de transcrição (c-myc, c- 17

18 Jun, JNK e p38) associados ao início do ciclo de divisão e transformação celular (Jimeno & Hidalgo 2006; Modjtahedi & Essapen 2009). Figura 4: Exemplo de associação intermolecular para ativação de Ras via associação com Sos, um fator de troca de guanina. Uma proteína adaptadora Grb2 utiliza seus domínios SH3 para ligar Sos e seu domínio Sh2 para ligarse a uma fosfotirosina numa proteína de sustentação Shc, que por sua vez, utiliza seu próprio domínio Sh2 para ancorar numa fosfotirosina do receptor EGFR quando este é ativado. Adaptado de Weinberg (2008). A ação da cascata de fosforilação do receptor EGFR desencadeia também a formação de trifosfato de inositol-1,4,5 (IP 3 ) e diacilglicerol, pela ação catalítica da enzima fosfolipase C sobre o fosfatidilinositol exposto na porção hidrofílica citoplasmática da bicamada lipídica. Estes eventos desencadeiam a formação de fosfatidilinositol trifosfato (PIP 3 ) pela ação da fosfatidilinositol trifosfato cinase (PI3K) (figura 5). PIP 3 torna-se um sítio de ancoragem de uma cinase treonina-serina chamada Akt/PKB que desencadeará o trabalho de uma série de fatores de síntese proteica, como mtor (mammalian Target of Rapamycin) e de estimulação da proliferação celular, como o glicogênio sintase cinase 3ß (GSK-3ß) (Kallergi et al. 2008; Gori et al. 2009). A ativação da via do PI3K via EGFR desempenha um papel central numa série de rotas sinalizadoras associadas ao crescimento, mobilidade, proliferação, diferenciação e a sobrevivência celular, além de influenciar a redução da possibilidade de ativação do programa de apoptose (Zhang et al. 2006; Dong et al. 2009; Matsubara et al. 2010). 18

19 Em células neoplásicas, alguns eventos como a superexpressão do receptor, mutações e amplificações de seu gene, podem resultar numa superatividade e retroalimentação das cascatas proliferativas (Moroni et al. 2005; Siena et al Wykosky et al. 2011). Estes são mecanismos oncomoleculares importantes para coordenação bioquímica da divisão celular, adesão, reparo, invasão e sobrevivência celular (Levin 2003; Gonçalves et al. 2008). Figura 5: A de atividade de PIK3 formando PIP 3, cria um sítio de ancoragem de Akt/PKB pelo seu domínio PH, que uma vez ancorado, sofre fosforilação de duas outras cinases (PDK1 e PDK2), estimulando uma série de substratos. Adaptado de Weinberg (2008). Diversos trabalhos mostram a associação entre superatividade desta via proliferativa e piores desfechos no tratamento de inúmeros tipos de câncer. O aumento do nível da expressão gênica do gene EGFR está relacionado a piores desfechos clínicos em diferentes neoplasias, inclusive em câncer de mama (Mendelsohn & Baselga 2003; Brandt et al. 2006; Agelopoulos et al. 2007). Entretanto, as causas e mecanismos neoplásicos que levam a esta superatividade ainda não são compreendidos por completo (Edwards et al. 2006; Liu et al. 2007; Rego et al. 2010). 19

20 1.2 CÂNCER DE MAMA Epidemiologia O câncer da mama é o tipo de câncer que mais acomete as mulheres em todo o mundo, tanto em países em desenvolvimento quanto em países desenvolvidos. Cerca de 1,4 milhões de casos novos dessa neoplasia foram esperados para o ano de 2008 em todo o mundo, o que representa 23% de todos os tipos de câncer (WHO 2010). Apesar de apresentar um bom prognóstico quando diagnosticado precocemente e tratado imediatamente, o câncer de mama é responsável por 18% dos óbitos por câncer, em mulheres, por ano (INCA 2009). De acordo com dados do INCA, esperam-se, para o Brasil, em 2012, casos novos de câncer da mama, com um risco estimado de 52 casos a cada 100 mil mulheres (INCA 2011). Dessa forma, o câncer de mama é considerado um problema de saúde pública no Brasil. No estágio atual do conhecimento, não existem medidas específicas de prevenção primária para o câncer de mama. A detecção precoce é o objetivo principal, visando à diminuição da mortalidade e o aumento da sobrevida livre de doença (Lee et al. 2012), com este objetivo, diversos países, inclusive o Brasil, implantaram programas de rastreamento da doença com exame mamográfico. (Boyle & Levin 2008; INCA 2011) Fatores de risco Embora não se conheça exatamente todo o mecanismo causal do câncer de mama, não há dúvida de que a interação entre os fatores genéticos e ambientais exerce papel fundamental na etiologia e na evolução dos casos (Mill et al. 2010). Dados clínicos, epidemiológicos e experimentais têm demonstrado que o risco de desenvolvimento de câncer de mama esporádico está fortemente relacionado à produção de esteroides sexuais. Condições endócrinas moduladas pela função ovariana, como a menarca precoce, menopausa tardia 20

21 e gestação, assim como a utilização de estrógenos exógenos, são componentes relevantes do risco de desenvolvimento do câncer de mama (MacMahon et al. 1970; Lambe et al. 1996; Greenlee et al, 2000). A utilização de contraceptivos hormonais orais e terapia hormonal pósmenopausa podem causar pequenos aumentos no risco de câncer de mama (Key et al. 2001). É controversa a hipótese de que o consumo de álcool (Kelsey et al. 1996), o sedentarismo, a obesidade e a dieta lipídica aumentam o risco de câncer de mama (Marchant, 1997; National Cancer Institute Bethesda 2008; Mill et al. 2010). Entre os fatores ambientais, a exposição à radiação ionizante é sabidamente associada ao câncer de mama. Os campos eletromagnéticos assim como os pesticidas também têm sido apontados como possíveis responsáveis pelo aparecimento deste tipo de câncer (Kelsey et al. 1996; INCA 2011). Estima-se que cerca de 5 a 10% dos casos de câncer de mama estejam ligados a causas hereditárias de desenvolvimento do câncer. Nestes casos é possível determinar claramente um padrão de herança familiar associada a mutações em genes determinantes de susceptibilidade ao câncer (Easton 1993; Ford 1998). Os casos de câncer de mama hereditários têm como importante característica o acometimento de mulheres jovens. Quando a doença se apresenta antes dos 35 anos, em 25% dos casos existe uma relação com fatores hereditários (Gomes et al. 2002; Anders et al. 2008). BRCA1 e BRCA2 são genes humanos que estão na classe dos genes conhecidos como supressores de tumor. Mutações nestes genes estão ligadas ao aumento do risco de câncer de mama hereditário e câncer de ovário (Dapic et al 2005). Mulheres com predisposição hereditária associada a mutações no gene BRCA1 têm um risco estimado de 56-80% para o desenvolvimento do câncer de mama (contra 11% na população geral) e de 16 a 60% para câncer de ovário (contra 1,4 a 2,5% na população geral) (Miki et al 1994; Spurdle et al. 2011). 21

22 1.2.3 Diagnóstico O advento da mamografia e sua modernização têm trazido benefício para o diagnóstico do câncer de mama. Diante de leões suspeitas detectadas pelos exames de imagem, a prática das biópsias percutâneas como punção aspirativa com agulha fina, core-biopsy ou mamotomia possibilitou a confirmação ou a invalidação de malignidade, evitando-se procedimentos mais invasivos (Fumagalli & Sotiriou 2010; Leong & Zhuang 2011). O diagnóstico do câncer de mama em estádio inicial tem sido associado a muitas variáveis, entre elas, a posição sócio-econômica e o acesso à saúde oferecido à população (Lanin et al. 1998; Richardson et al. 2001; Bradley et al. 2002; Lee et al. 2012). O sistema de estadiamento usado com mais freqüência é o de classificação TNM (T = tamanho; N = nódulos linfáticos comprometidos; M = metástases a distância) da International Union Against Cancer (UICC, 2002). Com relação ao Brasil, com base nos dados disponíveis de registros hospitalares, 60% dos tumores de mama, em média, são diagnosticados em estádio III ou IV (INCA 2005; Simon et al. 2009) Patologia As neoplasias de mama têm apresentação clínico-patológica e comportamento biológico extremamente heterogêneo, em parte pela variedade de tecidos envolvidos na gênese das lesões epiteliais, mesenquimais e mioepiteliais, em parte pela composição genética de cada tipo histológico. O conhecimento dos aspectos morfológicos, moleculares e bioquímicos tem sido importante no sentido de auxiliar nas estratégias de tratamento local e sistêmico (Peto 2001; Yenidunya et al. 2011). Dentre os fatores clínicopatológicos, o tamanho do tumor, o grau tumoral, o estado do envolvimento dos linfonodos regionais e a idade seguem sendo as variáveis de maior impacto no prognóstico do câncer de mama (Arriagada et al. 2006; Soerjomataram et al. 2008; Anders et al. 2008). O tipo histopatológico, o grau nuclear, o nível de expressão do receptor HER-2 e do receptor de estrogênio, entre outras 22

23 variáveis, também contribuem para refinar a classificação dos casos (Carvalho et al. 2011; Danova et al. 2011) Tipos histopatológicos A classificação histopatológica baseia-se em características celulares e padrão de crescimento de células sem considerar o local de origem da neoplasia. Adjetivos como ductal ou lobular definem padrões de apresentação morfológica com critérios definidos pela Organização Mundial de Saúde (Travassoli & Devilee 2003) e pelo College of American Pathologist (Fitzgibbons et al. 2000). Quanto ao aspecto morfológico, as neoplasias de mama se apresentam na forma in situ ou invasiva Carcinomas in situ Caracteriza-se por proliferação epitelial neoplásica, sem sinais de ultrapassagem da membrana basal (Pinder & Ellis 2003). São comumente considerados como uma etapa na sequência que antecede o carcinoma invasivo, entretanto, é importante reconhecer que nem sempre o processo é contínuo, e nem todos os carcinomas in situ evoluem para a forma invasiva (Silverstein et al, 1996) Carcinomas Invasivos Apresentam-se geralmente constituídos por células epiteliais poligonais, com atipia variável, distribuídas em agrupamentos coesos com a tendência de formação de espaços em meio ao estroma com variáveis desmoplásicas e infiltrados linfoides (Fitzgibbons et al. 1999). O tipo mais frequente é o ductal, seguido de longe pelo carcinoma lobular. Entre os tipos especiais, alguns têm comportamento biológico mais favorável em relação ao tipo ductal, como os carcinomas tubular, mucinoso do tipo colóide, cribriforme infiltrativo, secretor e adenocístico, enquanto outros têm comportamento mais agressivo, tais como o metaplásico e o micropapilar invasivo (Di Saverio et al. 2008). 23

24 Grau Histológico Os carcinomas invasivos são subdivididos de acordo com o grau de diferenciação celular. Esta graduação busca estimar o quanto as células neoplásicas se distanciam de um fenótipo normal (E. A. Rakha, Reis-filho, et al. 2010). Dados clínicos e patológicos vêm mostrando que o grau histológico é um fator que, aliado ao status linfonodal, tem grande valor na predição de desfecho da doença. Sua caracterização é relativamente simples, com custo econômico baixo, requerendo apenas a avaliação de um patologista treinado para análise microscópica de um corte tecido tumoral corado em hematoxilinaeosina. (Galea et al. 1992; Walker 2003). Dentre os sistemas mais usuais de graduação histológica, destacam-se a classificação de Scarff-Bloom-Richardson, o sistema de graduação nuclear de Fisher e o sistema de Nottingham. Em todos eles, o aumento do grau é associado a piores desfechos clínicos (Harris et al. 2004). A UICC (2002) utiliza o sistema de Nottingham para graduação histológica de 1 a 3 de acordo com o arranjo tubular, o pleomorfismo nuclear e a contagem mitótica presente na análise microscópica tumoral (Elston & Ellis, 1991) (figura 6). A sobrevida em 20 anos entre pacientes com neoplasias 1, 2 e 3 é estimada, respectivamente, em 41%, 29% e 21% (Hutter 1990; Adly et al. 2010). Figura 6: Grau histológico definido pelo sistema de Nottingham para graduação histológica; a) tumor bem diferenciado (grau 1), alta homologia com a morfologia de um ducto mamário normal, formação tubular (> 75%), um pleomorfimo nuclear médio e baixo índice mitótico baixo; b) um tumor moderadamente diferenciado (grau 2); c) tumor com pouca diferenciação celular (grau 3), caracterizado por alto pleomorfismo nuclear, frequentes mitoses e sem formação tubular (< 10%). Adaptado de Rakha et al. (2010). 24

25 Nas últimas décadas, o grau histológico tem demonstrado imenso valor preditivo da progressão da doença e na definição da terapia adjuvante (Carvalho et al. 2011; Berruti et al. 2011) Tamanho tumoral O tamanho do tumor e a condição dos linfonodos axilares são os dois mais importantes indicadores de prognóstico para o câncer de mama e, portanto, constituem a base do estadiamento TNM, estabelecido e promulgado pela União Internacional Contra o Câncer (Carter et al. 1989). Com o advento da mamografia e a gradual difusão do método, associada a maior conscientização da população sobre sua importância, vem-se observando em alguns países desenvolvidos a redução significativa no tamanho dos tumores quando do diagnóstico (Abreu & Koifman 2002). É certo também que o tamanho do tumor está diretamente relacionado ao risco de recidiva, sendo que, nos casos de pacientes com ausência de comprometimento metastático dos linfonodos, o tamanho do tumor torna-se a melhor característica preditora de recidiva (Arriagada et al. 2006; Fumagalli & Sotiriou 2010). Os tumores de menor tamanho estão invariavelmente relacionados a melhor prognóstico tanto para sobrevida global quanto para sobrevida livre de doença, independentemente do tipo de tratamento aplicado (Abreu & Koifman 2002; Soerjomataram et al. 2008) Envolvimento linfonodal A circulação linfática participa do processo de drenagem de substâncias geradas pelo metabolismo celular, e, auxiliado pelo baço e pelo timo, compõe o sistema linfático. Todo este sistema se encontra bastante hiperativo durante o processo inflamatório, que é bem característico no câncer (Hirakawa 2009; Ji 2006). A detecção de células neoplásicas em linfonodos adjacentes a um tumor primário caracteriza-se pela ocorrência de metástase linfonodal (Nakamura et 25

26 al. 2009). O sistema linfático é, portanto o sítio mais comum de metástases (Wong & Hynes, 2007). Aparentemente, as células malignas chegam à linfa muito mais facilmente do que à circulação ou a outros órgãos distantes. A metástase linfonodal é, sobretudo, um marcador de prognóstico, pois existe uma associação entre número de linfonodos acometidos e a ocorrência de metástases à distância, com consequente redução da sobrevida em pacientes oncológicos (Nakamura et al. 2009; Zwaans & Bielenberg 2007). Os vasos linfáticos possuem menor densidade e pressão hidrostática do que o sanguíneo. Possuem também mais invaginações, menor revestimento muscular e lâmina basal descontínua, ao contrário do endotélio do sistema circulatório sanguíneo (Wong & Hynes 2007; Hirakawa 2009). Estes fatores contribuem para uma transferência de células neoplásicas do tecido primário para a linfa de forma razoavelmente permissiva. Aliado a isso, o fluxo da drenagem das células adjacentes ao tumor segue o fluxo em direção ao linfonodos regionais. (Weinberg 2008). O linfonodo sentinela é a primeira estrutura a receber as células cancerosas que se desprenderam do seu local primário. O método de pesquisa de células tumorais no linfonodo sentinela diminuiu substancialmente o número de esvaziamentos axilares desnecessários na cirurgia oncológica (Qian et al. 2006). Neste cenário, os nódulos linfáticos drenantes do tumor primário poderiam funcionar como áreas de preparação, como um nicho onde células tumorais ali permanecem em diferenciação, ganhando novas características malignas até atingirem a circulação sistêmica com mais facilidade (Ochi et al. 2007). Ou então, a chegada de células neoplásicas nos linfonodos já representaria um sinal de que as unidades celulares da massa tumoral primária estariam num nível de diferenciação e malignidade tal, que seriam capazes de invadir tecidos e nele se aderir (Nakamura et al. 2009; Hirakawa 2009). O status linfonodal é um dos fatores mais importantes no prognóstico do câncer de mama. O impacto negativo nas sobrevidas global e livre de doença é modulado pelo tamanho da metástase, número de linfonodos acometidos e localização das estruturas envolvidas (axilar, supra ou infraclavicular) (UICC 2002). 26

27 No câncer de mama, pacientes diagnosticados com invasão metastática linfonodal possuem um risco 60% maior de mortalidade quando comparados com pacientes sem invasão linfonodal (Schoppimann et al. 2004; Lee et al. 2006). A figura 7 mostra a correlação entre o número de linfonodos comprometidos com metástases e a redução da sobrevida global e pacientes com câncer de mama (Soerjomataram et al. 2008). Figura 7: Proporção da sobrevida cumulativa em 8162 pacientes diagnosticados com câncer de mama na região sul da Holanda entre 1970 e 1994, acompanhadas até 2004, e agrupadas de acordo com o status linfonodal (node): linfonodo negativo (- -); 1 a 3 linfonodos positivos (- -); de 4 a 9 linfonodos positivos (- -); 10 ou mais linfonodos positivos (-X-). Adaptado de Soerjomataram et al. (2008) Receptores Os receptores hormonais (RH) destacam-se dentre os marcadores moleculares como definidores de perfil tumoral. De acordo com o nível de amplificação, o status dos RH exibe uma associação com o perfil proliferativo da neoplasia (Berry et al. 2006). Existem diferenças na probabilidade de sobrevida e nas taxas e locais de recidiva entre o status positivo e negativo para receptores hormonais (de estrogênio, e em menor extensão o de progesterona). Estas diferenças aumentam de acordo com a fração de células positivas e negativas e o valor prognóstico desaparece após dois anos (Hess at 27

28 al, 2003). A presença de receptores hormonais com status positivo no tumor é indicativo para tratamento antiestrogênico, porém, a positividade não garante uma resposta favorável Receptor de estrogênio O receptor de estrogênio (RE) é um regulador de crescimento celular, proliferação e diferenciação. É o mais importante marcador biológico de resposta terapêutica para o tratamento adjuvante do câncer de mama (Partridge et al. 2003). Na década de 1990, foram descritas isoformas deste receptor, e hoje são descritos como receptor de estrogênio alfa (α) e beta (ß). São codificados por genes distintos, mas apresentam analogia estrutural. Ambos os receptores podem mediar transcrição gênica através do elemento de resposta ao estrogênio ou por meio dos fatores de transcrição jus e fos. Pela primeira via, ambos atuam estimulando atividade proliferativa, enquanto que pela via dos fatores de transcrição, o RE-α estimula a proliferação celular enquanto o RE-ß inibe (Paech 1997; Travis & Key 2003; Massarweh et al. 2008). Na última década, identificou-se uma isoforma deste receptor situada na membrana nuclear que pode estar ligada a uma rápida ação não genômica do estrogênio, mediada por ativação de fatores de crescimento celular (Hanstein et al. 2004). Os tumores com status RE- associam-se a maiores taxas de recidiva e óbito nos 2 primeiros anos após cirurgia. O status de RE+ é um fator determinante para indicação de terapia hormonal no câncer de mama (Hess at al, 2003; Partridge et al. 2003; Geiger et al. 2004; Fisher et al. 2005; Stingl 2011) Receptor de progesterona O gene PR que codifica o receptor de progesterona (RP) é regulado pela atividade de RE-α (Horwitz & McGuire 1975; Thakkar & Mehta 2011). Assim, quando o RP está presente nas células neoplásicas, frequentemente significa 28

29 que a atividade do RE-α está funcional (Allred 2010). O RP é crucial no desenvolvimento do lóbulo alveolar da mama, e é responsivo ao hormônio progesterona, ativando algumas funções celulares, incluindo proliferação. É representado por duas isoformas, RP-A e RP-B (Jacobsen et al. 2005). Maior incidência de câncer de mama também é notada em mulheres que realizaram terapia de reposição hormonal com estrogênio e progesterona, em comparação com mulheres que realizaram esta terapia apenas com reposição de estrogênio (Cui et al. 2005). Com relação ao desfecho clínico, mulheres diagnosticadas com tumores com status RP negativo (RP-) possuem pior sobrevida global do que quando o RP é positivo (Hoefnagel et al. 2012; Bardou et al. 2003). Porém, o status de RP sozinho tem um valor preditivo fraco (Allred 2010; Stingl 2011). Apesar de existir uma associação entre a expressão de RE e RP, suas expressões podem ter status diferentes nos tumores de mama (Rakha et al. 2010). O status do RP também tem valor preditivo de resposta à terapia hormonal adjuvante no câncer de mama: pacientes com status RP - apresentam pior tempo livre de recorrência para este tratamento, independentemente do status do RE (Bardou et al. 2003; Jacobsen et al. 2005; Jacobsen & Horwitz 2012) HER2 Em células normais, o gene erbb2 codifica a proteína do receptor de crescimento epidermal humano do tipo 2 (epidermal growth factor receptor type 2; HER2 ou ErbB2 ou ainda HER-2/neu), que irá desencadear respostas celulares semelhantes aos receptores de sua família (Jorissen 2003; Murphy & Modi 2009). Cerca de 15 a 30% dos tumores de mama superexpressam HER2 (Suo et al. 2002), o que implica em menor sobrevida global e livre de doença a estes pacientes (Yonemori et al. 2010). A superexpressão de HER2 é fator preditivo para indicação de terapia com anticorpo monoclonal trastuzumab e outras terapias-alvo (Gori et al. 2009; Yonemori et al. 2010;Sanpaolo et al. 2011). A associação deste anticorpo monoclonal à quimioterapia com antraciclinas e taxanos demonstrou 29

30 significativa redução da mortalidade, recorrência da doença e ocorrência de metástases (Viani et al. 2007). Porém, ainda é discutido qual tempo de uso do trastuzumab adjuvante poderia trazer a melhor relação de benefícios (Jahanzeb 2008) EGFR Em modelos de câncer de mama pré-clínicos, a superexpressão do EGFR leva uma transformação maligna de células de camundongos (Di Fiori et al. 1987). O EGFR encontra-se superexpresso em cerca de 20 a 40% dos carcinomas de mama (Meche et al. 2009). Em neoplasias de mama, o EGFR está associado à proliferação e à resistência a apoptose (Kersting et al. 2006; Edwards et al. 2006). Em 1987, já havia descrição da relação do status EGFR+ e pior prognóstico do câncer de mama (menor sobrevida livre de doença e menor sobrevida global) (Sainsbury et al 1987; Jones et al. 1996; Nieto et al. 2007). Modelos experimentas de análise do perfil genético do câncer de mama mostram que o gene EGFR está na lista dos principais genes associados à ocorrência de metástase cerebral no câncer de mama (Bos et al. 2009). Existem muitos estudos que fazem referência a pior desfecho no tratamento do câncer de mama com superexpressão tumoral de EGFR (Xu et al. 2005; Agelopoulos et al. 2007; Brand et al. 2011), sobretudo em pacientes com tumores classificados como triplo negativo (RE-, RP- e HER2-). Quando estas pacientes possuem status EGFR positivo, apresentam pior sobrevida e menor tempo livre de recorrência (Tischkowitz et al. 2007; Bouchalova et al. 2009). Porém, ao contrário do que ocorre em outros carcinomas, nos tumores de mama, a superexpressão do EGFR não está necessariamente associada à amplificação de seu gene (Yu et al. 2008). 30

31 1.2.5 Estimativas de Prognóstico O curso clínico do câncer de mama e a sobrevida variam de acordo com as características próprias do tumor e da paciente. Esta variação é determinada por uma série complexa de características que podem contribuir para um desfecho favorável ou trazer complicações (Kelsey & Berkowitz 1988). Fatores prognósticos em câncer de mama são parâmetros possíveis de serem mensurados no momento do diagnóstico e que possuem um valor preditor da sobrevida da paciente (Soerjomataram et al. 2008). A aplicação e o conhecimento dos fatores prognósticos em câncer de mama tem fundamental importância para a definição do tratamento. De uma forma geral, quando estes fatores indicarem um desfecho desfavorável, o tratamento seguirá para uma indicação mais agressiva. Por outro lado, pacientes que possuem características indicativas de bom prognóstico, receberão um tratamento mais conservador e de menor toxicidade (Chotteau- Lelièvre et al. 2004; Fryback et al. 2006). Sendo o câncer de mama uma doença bastante heterogênea, não é surpreendente que as respostas aos tratamentos também possam variar. Neste sentido, uma busca em construir modelos de predição de evolução clínica e resposta terapêutica têm sido objeto de vários estudos nas últimas décadas (Adly et al. 2010; Danova et al. 2011). Estes modelos contribuem para melhorar a qualidade de vida do paciente e para definições de políticas em saúde (Williams et al. 2006) As características histopatológicas são fatores prognósticos clássicos e continuam a ser a principal base de vários sistemas de agrupamento de casos, como o estadiamento TNM e a categorização de St Gallen (UICC 2002; Goldhirsch et al. 2005). Ao longo dos anos, os receptores hormonais passaram a ter grande importância preditiva e orientadora da conduta terapêutica, sendo incorporados aos modelos de classificação tumoral (Hind et al. 2007; Fisher et al. 2005). Com o desenvolvimento das técnicas de análise genética e moleculares, a identificação de diferentes grupos de câncer de mama veio ganhando 31

32 diversidade, o que resultou no reconhecimento de subtipos como: basalóide, HER2, luminais A e B (Bertucci et al. 2002; Voduc et al. 2010), que levam em conta o status dos receptores hormonais, HER2 e outras proteínas como as citoqueratinas. Os tipos luminais correspondem a 60% a 70% dos casos, enquanto o tipo HER2, a 15% a 20% e o basalóide, a 10% a 15% (Blows et al. 2010; Wang et al. 2011). Plataformas de testes genéticos que levam em conta o nível de expressão de inúmeros genes no tumor têm diversificado ainda mais as subclassificações biológicas, proporcionando modelos que verificam a assinatura genética tumoral e assim, predições sobre as características neoplásicas (Sørlie et al. 2001; Finak et al. 2006; Parisi et al. 2010). Atualmente, existem alguns métodos de fácil classificação que têm norteado os clínicos para decidir o tratamento. O Índice de Prognóstico de Nottingham (Nottingham Prognostic Index - NPI), estabelecido desde os anos 1980, leva em conta o tamanho tumoral, o grau histológico e o status linfonodal para inferir a provável sobrevida em 5 anos após cirurgia (Blamey et al. 1979; Haybittle et al. 1982; Adly et al. 2010). No Reino Unido, o Índice de Prognóstico de Oxford (Oxford Prognostic Index) foi elaborado para predição de sobrevida num mais longo prazo (Campbell et al. 2010). A plataforma eletrônica Adjuvant! ( possibilita ao usuário a inclusão de informações relevantes sobre o paciente e a doença e indica o melhor esquema de tratamento adjuvante. Por fim, o consórcio Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group (2012) publica meta-análises periódicas, avaliando estudos clínicos sobre respostas a esquemas de terapia antineoplásica sistêmica, hormonioterapia e radioterapia Tratamento Atualmente, o tratamento do câncer de mama é interdisciplinar. A correta associação do tratamento cirúrgico, da radioterapia e dos tratamentos sistêmicos é indispensável quando se pensa em maior sobrevida e controle local da doença (Leite 1999; Mauri et al. 2008; Lee et al. 2012). 32

33 O tratamento cirúrgico tem como objetivo controlar a doença locoregional, estadiar cirurgicamente para estabelecer os grupos de alto risco para recorrência local, orientar a terapia sistêmica, proporcionar maior sobrevida, identificar grupos de maior risco de metástase à distância e sempre que possível, evitar mutilação ou oferecer à paciente o benefício da reconstrução mamária (Franco et al, 1997). Dentre os tipos de abordagem cirúrgica, os principais são: cirurgias radicais (mastectomias), cirurgias conservadoras (tumorectomia, quadrantectomia) (Veronesi et al 1990) e linfadenectomia axilar (aliado ao estudo de linfonodo sentinela) (Piato 2002). A irradiação da mama é considerada recomendada às mulheres submetidas à cirurgia conservadora para o câncer de mama em estádios iniciais. O tratamento baseia-se na irradiação de ondas de energia originadas de material radioativo sobre o local definido pela equipe médica (INCA 2011). Com o desenvolvimento das técnicas radiológicas, surgiu a radioterapia tridimensional e a modulação de intensidade do feixe de radiação (IMRT), que permitem proteger o coração e outros órgãos, diminuindo a chance de toxicidade e proporcionando doses mais homogêneas (Vicini et al, 2002). O tratamento farmacológico do carcinoma de mama envolve, atualmente, a utilização de uma variedade de compostos, como quimioterápicos antineoplásicos, incluindo a quimioterapia de compostos citostáticos, compostos hormonais e modificadores de resposta biológica, em particular representados pelos anticorpos monoclonais e os inibidores de tirosina cinase (Goldhirsch et al. 2009; Bouchalova et al. 2010; Sanpaolo et al. 2011; Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group 2012). As abordagens mais comuns de terapia sistêmica curativa se dividem em neo-adjuvante e adjuvante Tratamento neoadjuvante O tratamento neoadjuvante ou tratamento primário, consiste na aplicação de procedimentos sistêmicos em pacientes portadores de carcinoma localmente avançado da mama, contribuindo para cirurgias menores, com 33

34 possível benefício na sobrevida (Fisher et al, 1997, von Minckwitz et al. 2008). Há, porém, discussões quanto ao risco de recorrência local em caso de cirurgia conservadora (Barnadas 2010; Beasley & Olson 2010). Estudos randomizados têm mostrado que a asssociação de docetaxel a esquemas com antraciclinas oferece melhor resposta ao tratamento neoadjuvante (Valero, 2002; Smith et al, 2002) do que os esquemas com antraciclinas apenas, porém ainda há dúvidas quanto aos riscos desta terapias, em decorrência da morbidade associada a reações adversas (Huober et al. 2010) Tratamento adjuvante: O tratamento quimioterápico adjuvante contribui para aumento do tempo livre de progressão da doença. Nos últimos anos, vários estudos clínicos e meta-análises vêm abordando o favorecimento do uso de agentes como as antraciclinas e os taxanos no tratamento antineoplásico adjuvante (Guimarães 2008; Jacquin et al. 2012). O uso da poliquimioterapia adjuvante por mais de quatro meses reduz o risco de recorrência em 41% e o índice anual de morte em 31% (Breast Cancer Study Group, 2002). A hormonioterapia no tratamento adjuvante do câncer de mama tem tido grande impacto positivo, beneficiando mulheres cujas neoplasias expressam receptores hormonais positivos. Inúmeros estudos têm demonstrado que a utilização de tamoxifeno, um antagonista do receptor de estrogênio, por 5 anos após tratamento cirúrgico, reduz efetivamente o risco de recorrência, a incidência de câncer de mama contralateral e a mortalidade em mulheres, independentemente da faixa etária. (Hind et al. 2007). Os inibidores de aromatase de terceira geração (anastrozol e letrozol) têm sido indicados para o tratamento de pacientes resistentes ao tamoxifeno, por terem melhor tolerabilidade do que os inibidores de progesterona, como o megestrol (Buzdar et al 2001; Cuzick et al. 2010). O advento da terapia anti-her2 trouxe uma nova linha de tratamento para inibir a progressão da doença (Gilmer et al. 2008). A partir daí, novos candidatos a terapia-alvo vêm sendo estudados. 34

35 Terapia anti-egfr O EGFR foi proposto como um alvo molecular nos anos de 1980 (Sato et al. 1983; Masui at al. 1984; Mendelson 2002). O Cetuximab é o anticorpo monoclonal anti-egfr que mais se destacou até agora e vem sendo utilizado no tratamento do câncer colorretal e de cabeça e pescoço (Mendelsohn & Baselga 2003; Flynn et al. 2009; Park et al. 2011). Outros inibidores de tirosina-cinase com atividade anti-egfr mostraram alguma importância no tratamento do câncer de pulmão de células não pequenas (Rosell et al. 2012), porém não obtiveram resultados promissores no tratamento do câncer de mama (Ciardiello et al. 2006). Na família dos inibidores de tirosina-cinase, o Lapatinib demonstrou efeito anti-egfr e anti-her2 e tem alcançado resultados na terapia do câncer de mama metastático quando associado a outros quimioterápicos (Bilancia et al. 2007; Gilmer et al. 2008). Buscando melhorar os resultados com esta terapia, estudos vêm sendo desenvolvidos para avaliar os valores preditivos do EGFR e HER2 na resposta ao uso do Lapatinib em câncer de mama, bem como suas prováveis vias de resistência (Polli et al. 2009; Andre et al. 2010; Bouchalova et al. 2010). 1.3 POLIMORFISMOS GENÉTICOS Polimorfismo genético é a ocorrência simultânea em uma mesma população de duas ou mais formas distintas de um gene (alelos), que se caracterizam por variações nas sequências de nucleotídeos, tais como substituições, deleções, inserções e duplicação ou deleção de genes. Por definição, um gene é considerado polimórfico quando o alelo menos frequente ocorre na população com uma frequência de pelo menos 1% (Miller et al., 2001). As variações alélicas podem resultar em alteração da expressão ou da funcionalidade dos produtos gênicos. 35

36 É muito comum a ocorrência de duas possibilidades de nucleotídeos na sequência do DNA do genoma humano, o que é chamado de substituição de um único nucleotídeo (single nucleotide polymorphism - SNP). As combinações possíveis geralmente formam 3 possibilidades de genótipos, que podem ou não diferir em fenótipos (Voet et al. 2000). Os polimorfismos de região microssatélites são trechos de DNA que consistem em unidades repetidas de dois, três ou quatro nucleotídeos. O número de unidades de nucleotídeos repetidos contidos dentro de qualquer microssatélite pode diferir entre os dois cromossomos homólogos de uma pessoa e entre pessoas na população (Easton et al. 2009). Uma determinada região microssatélite é, portanto, um locus polimórfico, e os diferentes números de unidades repetidas em um determinado microssatélite constituem os alelos deste lócus (Lewin 2001). A evolução das espécies é um fenômeno que possui relação com as características adaptativas individuais dos indivíduos (Darwin 1859). Polimorfismos são distribuídos por todo o DNA genômico dos organismos, e compõem os fatores que proporcionam a diversidade de fenótipos e as variabilidades adaptativas numa mesma espécie (Tan 2008). Com o Projeto Genoma Humano e com o advento das técnicas de mapeamento genético, um grande número de polimorfismos vêm sendo estudado (Marzolini et al., 2004; Pirmohamed et al., 2011). Perguntas quanto a frequência em determinadas populações, relação hereditária, possíves associações fenotípicas e causas de patologias vêm tentando ser respondidas (Thompson & Thompson 2002) Polimorfismos e câncer Vários estudos vêm sendo realizados buscando identificar os fatores de risco associados ao desenvolvimento e à progressão do câncer. Variações individuais na ativação ou detoxificação de carcinógenos exógenos, no metabolismo de hormônios e no reparo de DNA contribuem para diferentes perfis de susceptibilidade ao câncer (Irigaray et al., 2007). De forma 36

37 semelhante, variações na sensibilidade aos fármacos antineoplásicos podem afetar a eficácia e a segurança do tratamento. Por se tratar de uma doença complexa, com vários fatores causais, diferentes perfis moleculares e de evolução clínica e cujo tratamento envolve diversas abordagens terapêuticas, a avaliação de associação entre genótipos individuais e desfechos clínicos no câncer de mama requer a realização de estudos de epidemiologia molecular, com análise integrada dos fatores genéticos e ambientais Polimorfismos do gene EGFR Com relação às variáveis genéticas individuais, há especial interesse em alterações que possam interferir na atividade de alvos moleculares potencialmente envolvidos com o risco de progressão do câncer de mama, como é o caso do gene EGFR, que possui inúmeros de pontos de variabilidade genética. Buscando melhor compreender os fatores que interferem nos níveis de expressão de EGFR, sua estabilidade proteica, sua atividade e afinidade com ligantes e como elas se relacionam com a sinalização celular, dois de seus polimorfismos foram pesquisados. Uma vez que estes polimorfismos podem estar associados a determinadas funções gênicas e proteicas, a classificação genotípica poderia funcionar como um biomarcador de prognóstico da doença ou como preditor de resposta a terapias antineoplásicas Polimorfismo de Repetição CA Regiões microssatélites possuem valor ainda não completamente elucidado sobre a replicação, transcrição e leitura do código genético. Mecanismos envolvendo regiões microssatélites, regiões intrônicas e processos de transcrição têm sido alvo de inúmeros estudos (Kashi et al. 1997; Chorev & Carmel 2012). A função das regiões microssatélites não transcritas tem sido relacionada à formação de nucleossomos, interferindo na ligação de 37

38 proteínas relacionadas a transcrição nas regiões promotoras do gene (Buerger et al. 2001). No intron 1 do gene EGFR existe uma região microssatélite de repetição de dinucleotídeos chamada de CA simple sequence repeat 1 (CA SSR I), ou, polimorfismo de repetição CA (rs ), onde ocorre uma variação de 14 a 25 repetições CA (figura 8). Um mecanismo de regulação transcricional dependente do número de repetições CA tem sido descrito, com impacto sobre o nível de síntese de pré-mrna (Chi et al 1992). Gebhardt et al. (1999) estudaram polimorfismos relacionados com a expressão aumentada de EGFR nos tumores de mama, e demonstraram que o número de repetições CA no intron 1 deste gene estaria inversamente relacionado à síntese de seu prémrna. Evidências deste mecanismo foram reforçadas por estudo do mesmo grupo, que mostrou a associação entre alta expressão e ocorrência de alelos da repetição CA mais curtos (Buerger et al. 2000). Figura 8: Estrutura da região 5 do gene EGFR. O início do gene como na maioria dos genes estruturais, encontramos uma sequência tipo caixa GpC. O processo de transcrição do gene EGFR inicia pela ligação de promotores em múltiplas regiões ricas em GC. Fator de transcrição Sp1 entre outros contribuem para atividade do promotor. (Haley & Waterfield 1991). Dentre os fatores que influenciam neste nível de transcrição, a existência de uma região de repetição de dinucleotídeos (citosina-adenina) no intron 1 (CA SSR 1) logo antes de regiões enhancer 2 (+1,788 a +2,318) influenciam numa parada prematura de transcrição ou não. Adaptado de Brandt et al. (2006). A influência de uma proteína inibidora de transcrição do DNA nos alelos com maior número de repetições CA é um modo de explicar esta associação. Pode-se alternativamente especular que a região de repetição CA, por estar situada entre a região promotora e a região enhancer, onde existem sítios de ligação de elementos reguladores, a afinidade da formação de complexos estaria comprometida nos alelos com tamanhos mais longos (Burkhard Brandt et al. 2006). 38

39 Quadro 2: Painel dos estudos envolvendo o polimorfismo de repetição CA do gene EGFR e o câncer em diferentes populações. País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência Europa Itália pulmão (não pequenas células) pacientes em tratamento com Geitinib: 91 um alelo com 16 repetições versus (CA)n de outros tamanhos Os pacientes com alelo de 16 repetições CA se beneficiaram mais com uso de gefitinibe apresentando uma melhor curva de sobre vida do que os pacientes com (CA)n de outros tamanhos (p = 0,044). (Tiseo et al. 2010) França Colon amostras tumorais de pacientes: 42 pelo menos 1 alelo 20 CA versus dois alelos <20 CA Nenhuma associação entre tamanho dos alelos e intabilidade genômica foi encontrada. Bem como nenhuma associação com a expressão de EGFR mrna. (Buisine et al. 2008). Espanha Cabeça e pescoço pacientes genotipados para R497K tratados com químio e rádioterapia: 78 os dois alelos <17 CAn versus pelo menos 1 alelo 17 CAn O polimorfismo de repetição CA não apresentou associações com características histopatológicas ou sobrevida em 60 meses. (Bandrés et al. 2007) França Cabeça e pescoço tecidos normais e tumorais de pacientes em tratamento: 109 Homozigotos versus heterozigotos ou 2 alelos <17 versus 2 alelos 17 repetições Nos tecidos tumorais foi encontrada uma maior expressão de EGFR nos pacientes que tinham o polimorfismo (CA)n em homozigotos (p=0,02). Nos tecidos normais não houve diferença. (Etienne-Grimaldi et al. 2005) Alemanha Mama caso / controle: 2 alelos 18 versus sadios: 604 com 18 e 19 repetições versus 2 alelos 19 pacientes: 1063 repetições Pacientes com 2 alelos 19 repetições CA apresentaram uma OR=10,4 ( ,70) para chance de histórico de parentesco de 1º grau com câncer de mama (p=0.015). (Brandt et al. 2004). Alemanha Mama pacientes submetidas a mastectomia, em tratamento: 82 Homozigotos p/ repetição CA versus heterozigotos com ou sem desbalanceamento alélico Pacientes heterozigotos para repetição CA e com desbalanceamento alélico tiveram uma pior sobrevida de 5 anos do que os pacientes homozigotos e heterozigotos sem desbalanceamento alélico (p<0.001). (Tidow et al. 2003) Alemanha mama linhagens celulares: 7 menor alelo com 16 versus 17 versus 18 versus 20 versus 21 repetições A atividade transcricional do gene EGFR é diminuída em até 80% nos genótipos com alelos de 21 repetições. (Gebhardt et al. 1999) 39

40 Quadro 2: Continuação. País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência América EUA Tumores sólidos pediátricos pacientes de 5 estudos pediátricos em tratamento com gefitinib: 109 soma dos alelos 35 repetições CA versus soma dos alelos >35 repetições CA CASSRI não apresentou associações com a ocorrência de efeitos adversos no tratamento com gefitinib. Não foi realizada análise de resposta ao tratamento na população. (McKibbin et al. 2010) EUA pulmão (não pequenas células) pacientes tratados com Gefitinib: 92 homozigoto com 16 CAn versus os outros genótipos Pacientes homozigotos com 16 repetições CA nos dois alelos tiveram uma melhor sobrevida livre de progressão comparados com outros genótipos. Log-rank test: p=0.03). (Liu et al. 2008) EUA Colon metastático pacientes genotipados para R497K: mulheres: 141 homens: 175 pelo menos 1 alelo 20 CA versus dois alelos <20 CA CASSRI não apresentou associações. Pacientes mulheres Lys/Lys e alelo 20 (longo/-) apresentaram uma pior mediana de sobrevida (RR=1,90; IC95%; 1,10-3,29 p=0,008). (Press et al. 2008) EUA Vários linhagens celulares do painel de tumores NCI60: 58 16/16 versus 16/17 versus 16/18 versus 16/20 versus 20/20 CASSRI não apresentou associações com a maior expressão de RNAm do gene EGFR. (Liu et al. 2007) EUA pulmão (não pequenas células) pacientes: 157 soma dos alelos: >35 repetições versus 35 ou homozigotos versus heterozigotos Uma melhor média de sobre vida foi observada entre os pacientes com um mais de 35 repetições na soma dos alelos (p=0,03). Não houve significância quando comparados os homozigotos x heterozigotos. (Dubey et al. 2006) 40

41 Quadro 2: Continuação. País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência EUA Retal pacientes em tratamento adjuvante genotipados para R497K: 59 pelo menos 1 alelo 20 CA versus dois alelos <20 CA CASSRI não apresentou associações. Apenas quando consideramos os dois polimorfismos juntos, um pior tempo livre de recorrência para os pacientes com alelo Arg e os dois alelos <20 (curto/curto), p=0,05; log-rank test. (Zhang et al. 2005) EUA Cabeça e pescoço colorretal linhagens celulares: 13 amostras tumorais do sangue de pacientes tratados com gefitinib: 19 soma dos alelos 35 repetições CA versus soma dos alelos >35 repetições CA Células com a soma de repetições 35, tiveram um menor crescimento do que as células com >35 repetições quando ambas foram tratadas com inibidor de EGFR: Erlotinib (p=0,03). Mostrou que não houve diferença entre as repetições CA do sangue periférico e do tumor. Não foi encontrada amplificação do gene. Pacientes com > 35 repetições tiveram uma menor ocorrência de rash cutâneo durante o tratamento (p=0,04). (Amador et al. 2004) Ásia Taiwan câncer oral tumor e tecido normal de pacientes de Taiwan: 47 homozigotos versus heterozigotos. Pacientes homozigoto para CA SSR1 tiveram um pior prognóstico do que os heterozigotos (P < 0.001). (Lin et al. 2011) Taiwan esôfago pacientes chineses: 148 homozigotos <20 repetições CA versus homozigotos 20 repetições Pacientes homozigotos para alelo curto (<20CA) tiveram uma sobrevida mais curta do que os homozigotos para alelo longo ( 20). Hazard ratio of death=1.88; 95%CI, 1,02 3,49 (p=0,045). (Lee et al. 2011) 41

42 Quadro 2: Continuação. País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência China pulmão (não pequenas células) pacientes tratados com Gefitinib genotipados para *2A (3801 T>C) no gene CYP1A1: 115 pelo menos um alelo 16 repetições os dois alelos > 16 repetições Pacientes com alelo T/T para o gene CYP1A1 e curto/curto para CA SSRI ( 16 CAn) apresentaram uma melhor resposta (p = 0.002) comparado com os pacientes de alelos T/C ou C/C para CYP1A1 e longos para CA SSRI (os dois alelos >16 CAn). (Nie et al. 2011) Coreia Colorretal amostras tumorais de pacientes tratados com Cetuximab: 75 soma dos alelos 36 CAn versus soma > 36 CAn Não foi encontrada acossiação entre os grupo de polimorfismo de repetição CA e a sobrevida livre de progressão e sobrevida global. (Park et al. 2011) Japão Pulmão caso/controle em sobreviventes da bomba atômica no japão: soma dos alelos 37 repetições CA versus casos: 113 soma dos alelos 38 repetições CA controles: 2066 Indivíduos sobreviventes da bomba atômica com a soma das repetições CA 37 mostraram um maior risco relativo de diagnóstico de câncer de pulmão do que os indivíduos com a soma dos alelos 38 repetições CA (RR=1.79 IC95% 1,14 2,82) (Yoshida et al. 2009) Taiwan pulmão (não pequenas células) pacientes tratados com gefitinib: 52 2 alelos 18 versus Pacientes curto/curto apresentaram uma maior incidência de rash com 18 e 19 repetições cutâneo grau 2ou 3 do que pacientes com outros genótipos versus 2 alelos 19 (p=0,031). CASSRI não apresentou associação com resposta ao repetições tratamento. (Huang et al. 2009) China pulmão (não pequenas células) pacientes tratados com Gefitinib: 84 pelo menos um alelo 16 repetições versus os dois alelos > 16 repetições Pacientes com pelo menos um alelo 16 (CA)n tiveram uma maior taxa de resposta em tratamento com Gefitinib do que pacientes portadores de dois alelos longos >16 (CA)n (88,5% versus 48,3%, p<0,001). (Ma et al. 2009) Irã Mama caso x controle: 2 alelos 18 versus sadios: 216 heterozigotos 18 e 19 pacientes: 108 versus 2 alelos 19 repetições CA Mulheres com genótipo curto/curto (2 alelos 18) tiveram um maior risco de desenvolvimento de câncer de mama (OR= 1,86; 95% CI, 1,019 4,671 e p=0,043). (Jami et al. 2008) Japão pulmão amostras tumorais e amostras de tecido não neoplásico de pacientes: 74 média das repetições CA dos 2 alelos: <17 versus 17 Aumento do nível de expressão de RNAm nos tecidos normais de pecientes com alelos mais curtos (<17), comparado com os pacientes com alelos mais longos ( 17) (p=0,02). (Sueoka-Aragane et al. 2008) 42

43 Quadro 2: Continuação. País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência Coreia pulmão (não pequenas células) pacientes tratados com Gefitinib: 86 soma dos alelos > 37 repetições CA versus soma dos alelos 37 repetições CA Pacientes com a soma de repetições de alelos 37 tiveram uma melhor resposta objetiva ao Gefitinib (p=0,029) e um menor tempo de progressão nestes pacientes. Porém sem diferenças na sobrevida global. (Han et al. 2007) Multiétnicos EUA, Japão e Itália pulmão (não pequenas células) amostras tumorais: descendência européia: 306 do leste asiático: 331 média dos tamanhos de CAn dos 2 alelos comparados entre as etinias populacionais. Indivíduos do leste asiático apresentaram os dois alelos para CASSRI maiores do que de indivíduos de outras etnias (p = 0.001). (Nomura et al. 2007) Cingapura, EUA e Inglaterra Mama caso/controle em populões asiáticas: sadios 295 pacientes 22 frequência dos números de repetição CA entre as populações: curtos (15 e 16 repetições) versus longo (20 repetições) A frequência do alelo de 14 e 15 repetições CA foi maior na população asiática neste estudo do que em outros estudos feitos por Caucasianos. A frequência do alelo de 20 repetições nesta população asiática foi 5% menor do que em outros estudos. (Zhou et al. 2006) Alemanhã e Japão Mama amostras tumorais: Alemães: 180 Japoneses CA repeats versus >18 CA repeats Os japoneses apresentaram um perfil de tumor mais homogêneo com predominância dos alelos longos >18 repetições, numa frequência de 67% dos alelos. (p<0,001) ( Buerger et al. 2004) EUA Mama pacientes: caucasianos: 133 afro-americanos: 66 asiáticos: 66 Genótipo 16/16 versus 16/20 versus 20/20 A frequência do alelo de 20 repetições CA foi maior entre os indivíduos asiáticos comparado com a frequência dos caucasianos (p = 2 x ). O alelo 16, foi um alelo mais frequente em caucasianos e afro-americanos do que dentre os asiáticos (p = 10-7 ). (Liu et al. 2003) 43

44 Alguns estudos avaliando a associação deste polimorfismo com o risco de desenvolvimento do câncer, com o processo de carcinogênese e com a resposta à terapia antineoplásica foram desenvolvidos nos últimos anos. No quadro 2, podemos visualizar um painel dos principais achados nestes estudos. Nos trabalhos com populações ocidentais, o alelo de 16 repetições CA é descrito como o mais frequente, enquanto que os trabalhos que envolvem populações asiáticas descrevem a ocorrência do alelo de 20 repetições CA como o alelo mais frequente. Estes dados sugerem que indivíduos asiáticos possuem uma frequência de alelos maiores, ou com um maior número de repetições CA do que as populações ocidentais (Liu et al. 2003; Buerger et al. 2004). Não são conhecidos trabalhos com a análise deste polimorfismo na população brasileira. Analisando todos os trabalhos de forma global, nota-se uma dificuldade de classificação dos grupos genotípicos gerados pelos alelos de repetição CA. Nos quadros aqui representados, verificamos diferentes formas de agrupar os genótipos do polimorfismo de repetição CA. Não existe, portanto, um ponto de corte ou um limite de tamanho usual na literatura que classifique exatamente os alelos como curto ou longo Polimorfismo R497K O outro polimorfismo escolhido para este estudo representa uma mudança de um único nucleotídeo na região codificante (G > A), no exon 13, gerando uma substituição de uma Arginina (Arg) por uma Lisina (Lys) no códon 497 (R497K) (Moriai et al. 1993) (figura 9). Moriai et al. (1994) demonstraram que células expressando EGFR com Lys nesta posição apresentavam menor resposta ao crescimento na presença dos ligantes TGF-α e EGF, além de apresentarem indução reduzida dos efetores fos, jun, myc. O EGFR, por ser um receptor a ativado pela formação de homodímeros ou heterodímeros com outros homólogos de sua família, possui um mecanismo de acoplamento, atividade e ciclização ainda não completamente estabelecido (Endres et al. 2011). Estudos cristalográficos suspeitam que alguns 44

45 mecanismos refinados de acoplamento e dimerização entre os monômeros e seus domínios possam interferir na atividade do receptor (Alvarado et al. 2010) (figura 10). Suspeita-se que o polimorfismo R497K e outros polimorfismos em regiões adjacentes possam interferir na formação dos dímeros e a estabilidade destas ligações (Choura et al. 2010). Figura 9: Representação esquemática da estrutura do receptor EGFR e suas unidades. Os domínios extra celulares I, II, III e IV encontram-se destacados. No domínio IV, na posição 497, o sítio de troca de aminoácidos arginina (Arg) por um lisina (Lys) gerada pela ocorrência do polimorfismo R497K. Adaptado de Flynn et al. (2009) Alguns estudos avaliando a associação deste polimorfismo com o risco de desenvolvimento câncer, com a carcinogênese e com a resposta à terapia antineoplásica foram desenvolvidos nos últimos anos e estão compilados no quadro 3. Entre eles, Wang et al. (2007) observaram uma associação entre a forma variante R497K e uma diminuição no nível de fosforilação e de ativação do EGFR em tumores de pacientes com carcinoma colorretal. Estes pacientes portadores do alelo variante apresentaram menor envolvimento linfonodal, menor ocorrência de metástases e, portanto, um melhor prognóstico. 45

46 Figura 10: Representação esquemática dos domínios extra celulares do receptor EGFR (I, II, III, IV). Modelo de mecanismo para uma cooperação negativa da atividade do receptor. (A) Posicionamento de receptores EGFR em forma ligada em homodímeros ou na forma monomérica. (B) Ligação de um único ligante (rosa) na molécula da esquerda; o domínio I (azul) e o domínio III (amarelo) se deslocam para acoplar a molécula da direita pelo colapso entre os domínios II (verde) de cada receptor. (C) Quando outra molécula ligante se envolve com o receptor da direita, o espaço de acoplamento não é sensibilizado da mesma forma do que no primeiro evento, deixando a estrutura dimérica assimétrica e por conseguinte, não contribuindo para a ativação consistente da cascata de fosforilação. (D) Os dois ligantes realizando o mesmo acoplamento, contribuindo para uma dimerização simétrica. Adaptado de Alvarado et al. (2010). O único estudo encontrado envolvendo a pesquisa deste polimorfismo em pacientes com câncer de mama foi publicado por um grupo da Tunísia, (Kallel et al. 2009), que observou uma distribuição genotípica diferente entre as pacientes com linfonodos negativos. Quadro 3: Painel dos estudos envolvendo o polimorfismo R497K do gene EGFR e o câncer em diferentes populações. País Câncer Amostragem n Europa Alelo Lys Achados Referência França colon pacientes metastáticos tratados com cetuximab 32 23,4% Pacientes com a variante Lys e mostraram com melhor sobrevida do que os pacientes selvagens quando tratados com cetuximab. (p = 0,041) (Gonçalves et al. 2008) Espanha cabeça e pescoço pacientes tratados com quimio e radioterapia 76 29,6% Quando combinado com polimorfismo de repetição CA, os pacientes homozigotos selvagens e heterozigotos tiveram um pior resposta ao tratamento. (p = 0,034) (Bandrés et al. 2007) 46

47 Quadro 3: continuação País Câncer Amostragem n Alelo Lys Achados Referência América EUA Tumores sólidos pediátricos pacientes de 5 estudos pediátricos em tratamento com gefitinib: ,1% Nenhuma associação foi encontrada entre efeitos adversos ao uso de gefitinib e este polimorfismo. (McKibbin et al. 2010) EUA colon Pacientes metastáticos tratados com cetuximab ,6 % Pacientes homozigotos selvagem e heterozigotos tiveram uma melhor sobrevida livre de doença (1,8 meses) do que pacientes homozigotos selvagem (1,3 meses - p = 0,017). (Lurje et al. 2008) EUA Colon metastático pacientes genotipados para R497K: mulheres: 141 homens: 175 > 25%* Pacientes com genótipo Arg/Arg tiveram uma pior curva de sobrevida para o tratamento de câncer de colon metastático (p = 0,003) (Press et al. 2008) EUA Retal pacientes em tratamento adjuvante: 59 36,9 % Quando o polimorfismo R497K é analisado com o polimorfismo de repetição CA, é observado um pior tempo livre de recorrência para os pacientes com alelo Arg e dois alelos < 20 repetições, p=0,05; log-rank test. (Zhang et al. 2005) Ásia Tunísia mama caso x controle com estudo prospectivo: casos: 148 controles: 303 casos: 23,6% controles: 25,5% Pacientes com alelo variante Lys apresentaram menor incidência de presença de linfonodos positivos (p = 0,030) (Kallel et al. 2009) Taiwan pulmão (não pequenas células) pacientes tratados com gefitinib 52 50% Nenhuma associação foi encontrada entre efeitos adversos ao uso de gefitinib e este polimorfismo Huang et al China pulmão pacientes tratados ou não com gefitinib ,8% O polimorfismo R497K esteve associado a uma melhor sobrevida entre pacientes com linfonodo positivo (p = 0,004). Quando tratados com gefitinibe, a sobrevida entre os genótipos se igualou. (Sasaki et al. 2009) China colon Pacientes metastáticos ,0% Pacientes com a variante Lys e mostraram com melhor sobrevida do que os pacientes selvagens. (p < 0,001) ( Wang et al. 2007) Um panorama dos estudos nos mostra que o alelo variante Lys parece ser mais frequente nas populações da Ásia oriental do nas populações europeia e americana. 47

48 Zhang et al (2005) demonstraram que o variante Lys em combinação com o maior número de repetições CA do intron 1 em pacientes com câncer colorretal está associado a menor recorrência de doença durante tratamento com quimioterapia e radioterapia adjuvante. Sugere-se também, que a forma variante do polimorfismo R497K (Lys) pode estar associada a um prognóstico favorável em câncer avançado de pulmão. Sasaki et al. (2009) demonstraram que pacientes Lys tiveram uma melhor sobrevida entre os pacientes que fizeram quimioterapia à base de platina. Estes dados justificam a importância da análise da genotipagem do EGFR e suas associações com os fatores prognósticos em estudo clínico, e avaliação de sua contribuição como marcador de predição do desfecho do tratamento adjuvante da doença. 48

49 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Determinar a magnitude de associação entre polimorfismos genéticos do gene EGFR e variáveis clínico-patológicas com valor prognóstico para o câncer de mama. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar a prevalência dos polimorfismos de repetição CA e R497K do gene EGFR pacientes com câncer de mama. Determinar a magnitude da associação destes polimorfismos com o prognóstico de pacientes diagnosticadas com câncer de mama. 49

50 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 DESENHO DO ESTUDO Trata-se de um estudo observacional exploratório em coorte hospitalar de mulheres diagnosticadas com câncer de mama, no Hospital do Câncer III/INCA. A coorte consistiu de uma série de casos de pacientes com indicação de cirurgia curativa. As participantes deste estudo fizeram parte do projeto Polimorfismos genéticos e evolução clínica, resposta terapêutica e reações adversas em pacientes submetidas ao tratamento do câncer de mama, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do INCA, aprovado em 12 de fevereiro de 2009, sob registro nº 129/08 (Anexo 1). Esse projeto teve o intuito de documentar a ocorrência das principais complicações associadas ao tratamento antineoplásico em pacientes com câncer de mama, e avaliar a influência de variáveis sócio-demográficas, terapêuticas, clínicas e genéticas, relacionadas ao tumor e ao indivíduo. As pacientes aqui analisadas foram convidadas a participar deste estudo no período de 12 de fevereiro de 2009 a 1º de abril de Todas as participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (anexo 2). 3.2 PACIENTES Critérios de inclusão Foram consideradas elegíveis para o estudo mulheres com câncer de mama primário, não-metastático, que receberam indicação inicial de tratamento cirúrgico com intenção curativa, que aceitaram participar da investigação e conseguiram responder às perguntas durante entrevista inicial. As mulheres que, após a cirurgia, foram diagnosticadas com câncer de mama bilateral não foram incluídas no estudo. 50

51 3.2.2 Critérios de exclusão Foram excluídas do estudo as mulheres que solicitaram desligamento da participação no estudo. 3.3 FORMULÁRIOS Dados sócio-demográficos foram obtidos através de entrevista no momento do recrutamento (Anexo 3). As pacientes incluídas foram acompanhadas através de consultas ao prontuário para obtenção de informações sobre a cirurgia, tratamento adjuvante e laudo histopatológico (Anexo 4). Todos os dados foram registrados em formulário padronizado específico e em banco de dados eletrônico utilizando o programa Microsoft Office Excel (versão 2007). 3.4 VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS Idade: Foi considerada a idade na data do diagnóstico do câncer de mama. Na análise, a idade foi estudada como variável contínua e no formato dicotômico. Quando analisada no formato dicotômico, as categorias de idade foram definidas no momento do diagnóstico como superior a 36 anos, representando o grupo de melhor prognóstico versus menor ou igual a 35 anos de idade, representando o grupo de pior prognóstico (Aebi et al, 2000) Classificação histológica: A classificação histológica foi definida por médico patologista do Serviço de Patologia Clínica do INCA, com base na análise microscópica de cortes da peça cirúrgica. De acordo com a apresentação morfológica, e utilizando os critérios definidos pela Organização Mundial de Saúde (Tavassoli, 2003) e o College of American Pathologists (Fitzgibbons et al, 1999), os tumores das pacientes deste estudo receberam uma das seguintes classificações: 51

52 carcinoma ductal in situ; carcinoma lobular in situ; carcinoma ductal invasivo; carcinoma lobular invasivo; carcinoma misto. Quando analisada no formato dicotômico, a classificação histológica foi agrupada em pacientes diagnosticadas com carcinoma invasivo versus pacientes diagnosticadas com carcinoma in situ, representando os grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente. Neste formato, os pacientes diagnosticados com carcinoma misto foram retirados da análise Grau histológico: Seguindo as recomendações da UICC (2002), foi utilizado o sistema de Nottingham (Elston & Ellis, 1991) para graduação histológica, que prevê índices de 1 a 3 de acordo com as seguintes características microscópicas tumorais: arranjo tubular, pleomorfismo nuclear e contagem mitótica. No arranjo tubular, os índices se referem à proporção de estruturas tubulares na lesão. O pleomorfismo nuclear é avaliado levando-se em consideração o tamanho do núcleo, contornos, uniformidade da cromatina e variação de forma e tamanho, enquanto a atividade mitótica é avaliado contando-se o número de figuras em 10 campos microscópicos contíguos de grande aumento. O somatório dos índices pode variar de 3 a 9. A graduação final foi obtida através de laudo histopatológico do Serviço de Patologia Clínica do INCA que define como: grau 1: somatório de 3 a 5; grau 2: somatório de 6 a 7; grau 3: somatório de 8 ou 9 pontos. Quando analisado no formato dicotômico, o grau histológico foi agrupado em pacientes classificadas como grau 1 ou 2 versus pacientes classificadas 52

53 como grau 3, representando os grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente Tamanho tumoral: O tamanho tumoral foi anotado de acordo com o laudo histopatológico de cada paciente, divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do INCA. As medidas foram obtidas dos cortes histológicos da peça cirúrgica. A categorização do tamanho tumoral (pt) foi baseada na Classificação de Tumores Malignos TNM (UICC 2002). Para tal, foi levada em conta a medida de maior diâmetro do tumor invasivo relatada no laudo histopatológico. Nos casos onde foram encontrados tumores múltiplos, o valor de maior diâmetro foi levado em conta para fins de estadiamento pt nas seguintes categorias: ptis: presença exclusiva de carcinoma ductal ou lobular in situ independente da extensão; pt1: Tumor com 2 cm ou menos em sua maior dimensão; pt2: Tumor com mais de 2 cm, porém não mais de 5 cm em sua maior dimensão; pt3: Tumor com mais de 5 cm em sua maior dimensão; pt4: Tumor de qualquer tamanho com extensão direta à parede torácica ou à pele. Quando analisado no formato dicotômico, o tamanho tumoral foi agrupado independentemente da classificação histológica, em tumores com até 2 cm versus tumores maiores do que 2 cm, representando os grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente. 53

54 3.4.5 Grau de envolvimento linfonodal: O número de linfonodos axilares retirados foi obtido pelo exame histopatológico da peça cirúrgica oriunda da pesquisa do linfonodo sentinela e/ou durante linfadenectomia axilar. O número de linfonodos positivos para metástase regional foi anotado no laudo histopatológico divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do INCA, independentemente do nível do esvaziamento axilar (I, II ou III) secundário ou não à biópsia do linfonodo sentinela. O grau de envolvimento linfonodal (pn) foi categorizado de acordo com a Classificação de Tumores Malignos TNM (UICC 2002): pn0: ausência de metástase em linfonodos regionais. pn1: de 1 a 3 linfonodo(s) metastáticos; pn2: de 4 a 9 linfonodos metastáticos; pn3: metástase em 10 ou mais linfonodos. Quando analisado no formato dicotômico, o grau de envolvimento linfonodal foi agrupado como pn0 ou pn1 versus pn2 ou pn3, representando os grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente Status do Receptor de Estrogênio: O status de amplificação do Receptor de Estrogênio (RE) nos tumores pesquisados foi obtido através de reações de imuno-histoquímica em cortes tumorais parafinados, pelo método de incubação em panela de pressão, em solução de acido cítrico a ph 6,0, utilizando o anticorpo Clone SP1 (Neomarkers, Fremont, EUA). Foi anotada a porcentagem de marcação para RE, de acordo com o laudo histopatológico divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do INCA. Os tumores foram considerados RE-positivos quando o percentual de células marcadas foi igual ou superior a 1% (NIH Consens, 2000). 54

55 Está variável foi analisada no formato dicotômico, sendo os grupos categóricos definidos como RE-positivo versus RE-negativo, representando os grupos de melhor e pior prognóstico, respectivamente Status do Receptor de Progesterona: O status de amplificação do Receptor de Progesterona (RP) nos tumores pesquisados foi obtido através de reações de imuno-histoquímica em cortes tumorais parafinados, pelo método de incubacão em panela de pressão, em solução de ácido cítrico a ph 6,0, utilizando o anticorpo Clone 16 (Novocastra Laboratories, Newcastle, Reino Unido). Foi anotada a porcentagem de marcação para RP, de acordo com o laudo histopatológico divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do INCA. Os tumores foram considerados RPpositivos quando o percentual de células marcadas foi igual ou superior a 1% (NIH Consens, 2000). Esta variável foi analisada no formato dicotômico, sendo os grupos categóricos definidos como RP-positivo versus RP-negativo, representando os grupos de melhor e pior prognóstico, respectivamente Status HER2: O status de amplificação do Receptor do Fator de Crescimento Epidermal do tipo 2 (HER2) nos tumores pesquisados foi obtido através de reações de imunohistoquímica em cortes tumorais parafinados, pelo método de Incubação em forno de micro-ondas, em solução de ácido cítrico a ph 6,0, utilizando o anticorpo policlonal de coelho (Dako Denamark A/S, Glostrup, Dinamarca). A gradação da reação imuno-histoquímica à positividade foi definida em escores (0, 1+, 2+ e 3+) de acordo com as recomendações da American Society of Clinical Oncology e do College of American Pathologists (ASCO/CAP, 2007). No laudo histopatológico divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do INCA, o status HER2 foi definido da seguinte forma: 55

56 HER2 negativo: escore 0 ou 1+; HER2 indeterminado: escore 2+; HER2 positivo: escore 3+. Algumas amostras tumorais em que o status HER2 foi considerado indeterminado foram encaminhadas para pesquisa do gene HER2 por hibridização in situ por fluorescência (FISH), efetuando a razão da média de sinais do gene HER2 e da porção centromérica cr17, através do HER2 FISH DAKO pharmdx Kit (Dako Denamark A/S, Glostrup, Dinamarca). A presença de amplificação do gene HER2 foi considerada quando a relação HER2/Cr17 foi superior a 2,2. Quando a relação foi superior a 1,8 e inferior a 2,2, o teste foi determinado inconclusivo e quando igual ou inferior a 1,8, o gene HER2 foi considerado não amplificado (ASCO/CAP, 2007). O resultado do teste inconclusivo manteve o status indeterminado para o HER2 daquela amostra. O status HER2 foi assumido como positivo ou negativo quando os seguintes resultados foram encontrados; respectivamente: superior a 2,2 ou igual ou inferior a 1,8. Quando analisado no formato dicotômico, o status HER2 foi categorizado como HER2-negativo versus HER2-positivo, representando os grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente. Neste formato, as pacientes com status HER2 indeterminado foram retirados da análise Subclassificação biológica: A identificação de diferentes perfis fenotípicos do câncer de mama pode ser determinada segundo o nível de expressão de uma lista de genes, caracterizando subgrupos denominados: luminal A, luminal B, basal-símile e tipo HER2 (Sotiriou et al, 2003). Estes subgrupos fenotípicos possuem valor prognóstico e podem eventualmente definir candidatos a alvos terapêuticos (Sørlie et al, 2001). Neste estudo, com os resultados da análise dos receptores de estrogênio, progesterona e HER2 disponíveis no laudo histopatológico 56

57 divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do INCA, foi possível agrupar os tumores na seguinte subclassificação biológica (Huober at al, 2010): lumial A: tumores RE+, RP+, HER2 -; lumial B: tumores RE+, RP-, HER2- ou RE+, RP-, HER2+ ou RE-, RP+, HER2- ou RE+, RP+, HER2+; tipo HER2: tumores RE-, RP+, HER2+ ou RE-, RP-, HER2+; triplo negativo: RE-, RP-, HER Estadiamento: A União Internacional Contra o Câncer, através da Classificação de Tumores Malignos TNM, agrupa os estádios da doença de acordo com o tamanho tumoral, o grau de envolvimento linfonodal e o número de metástases à distância, no momento do diagnóstico. Uma vez que neste estudo não foram incluídos pacientes com tumores metastáticos, o estadiamento foi feito de acordo com o tamanho tumoral e o grau de envolvimento linfonodal obtidos nos laudos histopatológicos, sendo caracterizados os seguintes níveis: estádio 0: ptis, pn0; estádio I: pt1, pn0; estádio IIA: pt1, pn1 ou pt2, pn0; estádio IIB: pt2, pn1 ou pt3, pn0; estádio IIIA: pt1, pn2 ou pt2, pn2 ou pt3, pn1 ou pt3, pn2; estádio IIIB: pt4, qualquer N (exceto pn3); estádio IIIC: qualquer T, pn3. Quando analisado no formato dicotômico, os níveis de estadiamento foram agrupados em estádios 0, I, IIA ou IIB versus estádios IIIA, IIIB ou IIIC, representando os grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente. 57

58 Prognóstico de Nottingham O Índice de Prognóstico de Nottingham (NPI - Nottingham Prognostic Index) é usado para determinar o prognóstico/probabilidade da sobrevida global durante os 5 anos após a abordagem cirúrgica do câncer de mama (Haybittle et al, 1982; Galea et al. 1992). Seu valor ou índice é calculado usando três critérios patológicos, o tamanho do tumor ressecado, o status linfonodal e o grau histológico do tulmor, aplicados na seguinte formula: NPI = [0.2 x S] + N + G Onde: (S) = tamanho do tumor em centímetros; (N) = o número de linfonodos metastáticos; o pn0 = 2; o pn1 = 2; o pn2 ou pn3 = 3. (G) = o grau histológico: o grau 1 = 1; o grau 2 = 2; o grau 3 = 3; Dependendo do valor do score NPI encontrado com a aplicação da fórmula, cada paciente foi categorizada num grupo de prognóstico com base na estimativa de sobrevida em 5 anos de pós operatório (quadro 4). 58

59 Quadro 4: Definição dos níveis de Risco de Estimativa de Recorrência. Quando analisado no formato dicotômico, o NPI foi agrupado em moderado a excelente versus ruim, representando os grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente Estimativa de risco de recorrência: No momento atual, a escolha do tratamento adjuvante do câncer de mama envolve a observação do tipo e do grau histológico, tamanho do tumor, invasão linfonodal, expressão de receptores hormonais e HER2, idade e outros marcadores moleculares. A fim de nortear as condutas terapêuticas para o tratamento do câncer de mama, o Serviço de Oncologia do INCA (2011) utiliza consensos de dados da literatura (Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group, 2005) para definir uma Estimativa de Risco de Recorrência da Doença (ERR) que categoriza a paciente com base nos fatores prognósticos conhecidos (quadro 5). 59

60 Quadro 5: Definição dos níveis de Risco de Estimativa de Recorrência. Quando analisada no formato dicotômico, a ERR foi agrupada em risco baixo ou intermediário versus risco elevado. 3.5 ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS Colheita de sangue Uma amostra de sangue periférico de cada paciente (5 ml) foi colhida por profissional treinado, aproveitando a rotina hospitalar de exames laboratoriais já existente. Uma agulha acoplada a uma seringa foi introduzida na veia de mais fácil acesso e uma amostra do sangue colhido foi logo repassada para tubo apropriado. Todos os cuidados foram tomados, de forma a tornar mínimos os riscos de infecção, contaminação, sangramento e dor Extração do DNA genômico A extração do DNA genômico foi realizada a partir de células mononucleares de amostras de sangue periférico colhido de cada paciente, utilizando-se o sistema blood genomic prep mini spin kit (GE Heathcare, Buckinghamshire, UK), de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante. O DNA foi armazenado a -20 C. 60

61 3.5.3 Identificação do polimorfismo O método utilizado para amplificação das regiões de DNA estudadas neste trabalho foi a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase chain reaction PCR). Esta técnica permite-nos obter uma grande quantidade de DNA da região pretendida partindo de uma amostra relativamente pequena. As sequências nucleotídicas foram identificadas pelo programa BLAST disponível no portal do National Center for Biotechnology Information (NCBI, 2009). Os iniciadores senso e reverso utilizados para amplificação das regiões de interesse foram desenhados a partir da observação das sequências identificadas no portal do NCBI e confirmadas por análises de sequenciamento Genotipagem do polimorfismo de repetição CA Amplificação da região de interesse Para genotipar este polimorfismo situado no intron 1 do gene EGFR, tal região foi amplificada por PCR a partir de uma mistura de reação de 10 μl contendo: 0,4 μl de DNA genômico do paciente, 200 μm de dntps, 2,5 nm de MgCl 2, 50 mm de KCl, 10 mm de tris-hcl (ph 9.0), 0,25 U de Taq polimerase e 0,4 μm de cada oligonucleotídeo iniciador, sendo o senso: 5'- CTCCACCTGCAGCCCTTC-3', marcado com fluorescência 6-FAM TM (Life Thechnology, Carlsbad, EUA) e o reverso: 5'-CAAGGTCTGGGAACCACTGT- 3'. A mistura de reação foi processada em termociclador automático Veriti TM (Applied Biosystems, Foster City, USA) nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 5 min, seguido de 35 ciclos com 30 segundos de desnaturação a 95ºC, 30 segundos de hibridização a 60 ºC e 30 segundos de extensão a 72ºC; com uma etapa final de extensão a 72ºC por 5 minutos. Os produtos de reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% (p/v) na presença de brometo de etídeo e visualizados sob luz UV. O resultado foi a geração de fragmento(s) amplificado(s) de aproximadamente 200 pb (figura 11). 61

62 Figura 11: Observação sob luz UV do produto da amplificação de sequencia do intron 1 do gene EGFR de 3 pacientes (1 a 3) após eletroforese em gel de agarose 2% (p/v). Obtenção de produto esperado de aproximadamente 200 pb (p: padrão de peso molecular de 50pb) Análise de tamanho de fragmento Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese de capilar para obtenção dos tamanhos exatos referentes a cada alelo de cada paciente. Inicialmente, 1μL do produto amplificado foi diluído em 3μL de formamida high dye (ph 7,0). Utilizando placa de 96 poços, foram adicionados em cada um deles: 1 μl do produto diluído, 0,5μL de padrão de peso molecular GeneScan-400HD (Applied Biosystems, Foster City, EUA) e 8,5 μl de formamida high dye (ph 7,0). A placa foi incubada a 95ºC por 3 minutos e logo em seguida, mantida a 4ºC por 2 minutos. A placa foi inserida em aparelho sequenciador automático modelo ABI 3130 (Applied Biosystems, Foster City, EUA) onde as misturas foram submetidas à eletroforese de capilar de 30 cm em polímero POP7. Após aproximadamente uma hora e meia, os fragmentos de DNA marcados com a fluorescência FAM TM foram separados de acordo com seus 62

63 tamanhos, com a sensibilidade de diferença de um nucleotídeo entre cada fragmento. A detecção da fluorescência por comprimento de onda foi interpretada pelo sistema computacional do equipamento segundo códigos de cores ao passarem pela região de leitura ótica do sequenciador. Os eletroferogramas da separação foram gerados no programa GeneMapper v.3.7 (Applied Biosystems). Na figura 12, a área assinalada corresponde ao pico de detecção do tamanho do fragmento alélico. Figura 12: Eletroferograma de corrida de eletroforese de capilar de dois pacientes diferentes gerados pelo programa GeneMapper v.3.7. Na análise do primeiro paciente observamos fragmentos de 192 e 196 pares de base, enquanto no segundo, os dois fragmentos alélicos apresentam tamanho de 200 pares de base. Os outros picos adjacentes correspondem aos fragmentos gerados erroneamente pela Taq polimerase durante a amplificação dos alelos genômicos originais. É sabido que estes erros de polimerização durante as 63

64 reações de amplificação em cadeia geram fragmentos de tamanhos menores do que os originais genômicos (Ellegren 2004). As pacientes que apresentaram dois alelos de tamanhos diferentes na análise foram consideradas heterozigotas para o polimorfismo de repetição CA, ou seja, apresentaram número de repetições diferente em cada alelo. As pacientes que não apresentaram tamanhos de alelos diferentes na análise foram consideradas homozigotas para este polimorfismo Confirmação por sequenciamento direto A fim de estimar a correspondência entre o tamanho do fragmento amplificado e o número exato de repetições CA neste fragmento, sete amostras de pacientes homozigotas (figura 13) foram selecionadas para realização de sequenciamento direto do DNA genômico empregando o método de terminação em cadeia (Sanger et al., 1977). A reação de sequenciamento foi composta pela mistura de DNA genômico (1-3 ng), 1,5 μl de tampão de reação contendo os dideoxinucleotídeos fluorescentes ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp disponíveis no kit ABI PRISM Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, USA), 3,2 pmols dos iniciadores específicos senso ou reverso anteriormente descritos para amplificação de região de interesse do exon 13 do gene EGFR e água deionizada para volume final de 10 μl. As misturas de reação foram processadas em termociclador automático Veriti TM (Applied Biosystems, Foster City, USA) programado para uma desnaturação inicial por um minuto a 96 C, seguida de 25 ciclos de 15 segundos de desnaturação a 96ºC, 15 segundos de hibridização a 50 ºC e 4 minutos de extensão a 60ºC. 64

65 Os produtos amplificados foram submetidos à precipitação, realizada em placas de 96 poços com uma inicial centrifugação a 600 rpm por 1 minuto, seguida da adição de 30 μl de isopropanol a 75% (v/v) em água deionizada. A placa foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz e em seguida centrifugada a rpm, durante 45 minutos, a temperatura de 4 C. Posteriormente, o isopropanol foi cuidadosamente retirado e foram adicionados 50μl de etanol a 75% (v/v) em água deionizada. Em seguida, uma nova etapa de centrifugação foi realizada durante 15 minutos a rpm e 4ºC, objetivando a precipitação do DNA contendo os dideoxinucleotídeos marcados. Figura 13: Eletroferograma de quatro das sete amostras de pacientes homozigotas com tamanhos de fragmentos diferentes, selecionadas para análise por sequenciamento. Finalmente, o etanol foi removido por inversão cuidadosa da placa em superfície absorvente. Uma última etapa de centrifugação foi realizada com a 65

66 placa invertida até alcançar 600 rpm. A placa foi incubada a 60 C durante 10 minutos sob abrigo da luz para completa evaporação do etanol. Após esta etapa, a placa foi mantida a -20ºC até o momento de ser encaminhada a eletroforese em sequenciador automático. Os poços da placa contendo as amostras de produto amplificado e precipitado foram reconstituídos em 10 ul de formamida high dye (ph 7,0). A placa foi submetida à etapa de choque térmico a 95 C por dois minutos, objetivando a quebra de estruturas secundárias que possam impedir a correta separação dos fragmentos de DNA marcados e em seguida, foi submetida à eletroforese em capilar de 30 cm em sequenciador automático modelo ABI 3130 (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Após aproximadamente uma hora e meia, os fragmentos de DNA marcados foram separados de acordo com seus tamanhos (diferença de um nucleotídeo entre cada fragmento), e sequenciados por emissão de fluorescência em diferentes comprimentos de onda para cada nucleotídeo, ao passarem pela região de leitura ótica do sequenciador. Os comprimentos de onda eram interpretados pelo sistema computacional do equipamento segundo códigos de cores (azul, vermelho, verde e amarelo para cada nucleotídeo). As sequências obtidas foram analisadas pelo programa Geneious 5.5 (Biomatters Ltd, Auckland, Nova Zelândia). Após o emparelhamento das fitas geradas por cada um dos dois iniciadores, senso e reverso, foi possível estimar o número de repetições CA existentes nos fragmentos de tamanho conhecido analisados (figura 14). Figura 14: Eletroferograma de sequenciamento dos produtos amplificados do intron 1 do gene EGFR pelo programa Geneious 5.5. Emparelhamento da sequencia senso e reverso de um paciente com tamanho de fragmentos de 192 pares de base. Na análise é possível observar uma sequencia com 16 repetições CA. 66

67 A partir dessa análise, o programa GeneMapper v.3.7 (Applied Biosystems) foi configurado para assumir determinado número de repetições CA de acordo com o número de pares de base (pb) encontrado (figura 15). Figura 15: A eletroforese de capilar de amostras de duas pacientes diferentes geradas pelo programa GeneMapper v.3.7. O primeiro foi caracterizado como heterozigoto de alelos com 16 e 18 repetições CA. O segundo foi caracterizado como um paciente homozigoto de alelo com 20 repetições Genotipagem do polimorfismo R497K Amplificação da região de interesse Para genotipar o polimorfismo R497K situado no exon 13 do gene EGFR, tal região foi amplificada por PCR a partir de uma mistura de reação de 30 μl contendo: 1 μl de DNA genômico do paciente, 200 μm de dntps, 2,5 nm de MgCl 2, 50 mm de KCl, 10 mm de tris-hcl (ph 9.0), 1,5 U de Taq polimerase e 0,4 μm de cada oligonucleotídeo iniciador, sendo o senso: 5'- TGCTGTGACCCACTCTGTCT-3' e o reverso: 5'-CCAGAAGGTTGCACT- TGTCC-3'. A mistura de reação foi processada em termociclador automático Veriti TM (Applied Biosystems, Foster City, USA) nas seguintes condições: 67

68 desnaturação inicial, a 95ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 30 segundos de desnaturação a 95ºC, 30 segundos de hibridização a 56 ºC e 30 segundos de extensão a 72ºC; com uma etapa final de extensão a 72ºC por 5 minutos. Os produtos de reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% (p/v) na presença de brometo de etídeo e visualizados sob luz UV. O resultado foi a geração de um fragmento amplificado de 156 pb (figura 16). Figura 16: Observação sob luz UV do produto da amplificação de sequencia do exon 13 do gene EGFR de 3 pacientes (1 a 3) após eletroforese em gel de agarose 2% (p/v). Obtenção de produto esperado de aproximadamente 150 pb (p: padrão de peso molecular de 50pb) Digestão com enzima de restrição A digestão foi realizada em uma mistura de reação de 15μl contendo 5μl do produto de DNA amplificado do paciente, 5U da enzima de restrição BstNI (Bio Labs, New England, UK) e tampão de reação correspondente. A mistura foi incubada por uma hora a 60ºC. Logo após, receberam a adição de mais 2 U da enzima BstNI, seguido de mais 2 horas de incubação a 60ºC. Os produtos da digestão foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2% (p/v) corados com brometo de etídeo e visualizados sob luz UV. 68

69 Os produtos de digestão relacionados ao genótipo homozigoto selvagem (GG) apresentaram dois fragmentos: um de 50 e outro de 106 pb. Em contraste, os produtos pertencentes ao genótipo homozigoto variante (AA) apresentaram apenas um fragmento de 156 pb, com perfil idêntico ao padrão de produto não digerido. Em contraste, produtos pertencentes ao genótipo heterozigoto (GA), apresentaram os três fragmentos de 56, 100 e 156 pb (figura 17). Figura 17: Observação sob luz UV do produto da reação de digestão com enzima de restrição para genotipagem do polimorfismo R497K de 10 pacientes (1 a 10) após eletroforese em gel de agarose 2% (p/v). Os tamanhos dos produtos de reação determinam os genótipos de cada paciente (p: padrão de peso molecular de 50pb; c: controle, produto amplificado não digerido) Confirmação por sequenciamento direto Para confirmação dos dados encontrados nas reações de digestão com enzima de restrição, seis pacientes de cada grupo genotípico tiveram seu DNA genômico encaminhado para sequenciamento direto de acordo com a metodologia anteriormente descrita. As sequências obtidas foram analisadas pelo programa BioEdit v7.1.3 (Ibis Biosciences, Carlsbad, EUA). A leitura final mostrou similaridade entre os genótipos sequenciados e os obtidos através da reação de digestão com enzima de restrição em todas as amostras analisadas (figura 18). 69

70 Figura 18: Observação dos eletroferogramas dos sequenciamentos das amplificações do exon 13 do gene EGFR gerados pelo programa BioEdit v Observa-se a presença dos nucleotídeos G ou A na posição 1749 dos alelos examinados, determinando a presença de um aminoácido arginina ou lisina, respectivamente. (C: citosina; A: adenina; G: guanina, Arg: Arginina; Lys: lisina). A mudança de um nucleotídeo guanina (G) por adenina (A) na posição 1749 do gene EGFR (códon 497) resulta na substituição de um aminoácido arginina (Arg) quando a sequência determinante for AGG, por um aminoácido lisina (Lys), quando a sequência for AAG. 70

71 3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA Para gerenciamento das análises estatísticas, foi utilizado o programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, versão 15.0). Foi realizado um estudo descritivo da população em estudo, através da análise das medidas de tendência central e de dispersão e distribuição de freqüência para as variáveis independentes. Os resultados encontrados na identificação dos polimorfismos foram utilizados para estimar a frequência alélica. A aderência ao princípio de Hardy- Weinberg foi avaliada pelo teste do qui-quadrado. O teste do qui-quadrado foi usado para comparação de dados de frequência, com exceção das comparações com frequencia menor que 5, em que usou-se o teste de Fisher. O cálculo de tendência da incidência dos fenótipos de acordo com a presença da variante alélica polimórfica foi realizado por associação linear. A avaliação de associações entre as variáveis clínico-patológicas e a presença de polimorfismos foi realizada através do cálculo de razão de chances (OR - odds ratio), considerando um intervalo de confiança de 95%. Os ajustes nos cálculos de razão de chance pelas variáveis de interferência foram realizados por regressão binária. Neste estudo, o nível de significância para rejeição da hipótese de nulidade foi de 5% (p 0,05). Os resultados com valor de p menor do que 0,05 foram destacados em negrito. 71

72 4 RESULTADOS 4.1 POPULAÇÃO Recrutamento Durante o período de recrutamento, foi possível selecionar 540 pacientes com diagnóstico de câncer de mama, das quais 492 foram incluídas. Os genótipos para o polimorfismo de repetição CA e para o polimorfismo R497K foram obtidos em 426 e 472 pacientes, respectivamente (quadro 6). Portanto, dentre as 426 pacientes genotipadas para o polimorfismo de repetição CA, todas foram também genotipadas para o polimorfismo R497K. Quadro 6: Fluxograma de inclusão e análise da população do estudo Descrição da população As características clinico-patológicas das 472 pacientes que tiveram seu DNA analisado para pelo menos um polimorfismo são descritas na tabela 1. Não parece haver diferença no perfil descritivo da população quando as 48 72

73 pacientes que não foram elegíveis para o estudo são retiradas da análise descritiva. Tabela 1: Descrição das características clínico-patológicas da população com o DNA analisado estudo. Perfil clínico patológico N N Idade 472 anos Status Linfonodal 472 média 58,5 pn ,7 mediana 58 pn ,9 faixa 27 ~ 92 pn2 45 9,5 pn3 23 4,9 Idade 472 % < 35 anos 2,3 Receptor de Estrogênio anos 97,7 negativo 72 15,9 positivo ,1 Tipo histológico 472 % s/ informação (19) ductal invasivo ,6 ductal in situ 35 7,4 Receptor de Pregesterona 452 lobular in situ 2 0,4 negativo ,5 lobular invasivo 26 5,5 positivo ,5 misto 5 1,1 s/ informação (20) Grau tumoral 418 % HER2 432 grau ,9 negativo ,3 grau ,8 positivo 65 15,0 grau ,4 intermediário 16 3,7 s/ informação (54) s/ informação (40) Tamanho tumoral 450 % Subclassificação biológica 415 ptis 37 8,2 luminal A ,5 pt ,8 luminal B 73 17,6 pt ,4 tipo Her2 25 6,0 pt3 15 3,3 triplo negativo 41 9,9 pt4 1 0,2 s/ classificação (57) s/ informação (22) Utilizando as variáveis estudadas, os perfis de prognóstico da população incluída foram observados pelo estadiamento, pelo prognóstico de Nottingham e pela estimativa de risco de recorrência (tabela 2). Nota-se que existe um grupo composto por cerca de 20% desta população que tem um provável desfecho desfavorável. 73

74 Tabela 2: Descrição das características patológicas pelas estimativas de prognóstico. Estadiamento e prognóstico N Estadiamento (ptnm) 451 % ,2 I ,3 II A ,6 II B 66 14,6 III A 45 10,0 III B 1 0,2 III C 23 5,1 s/ classificação (21) Prognóstico de Nottingham 374 excelente 22 5,9 bom 72 19,3 moderado ,5 ruim 80 21,4 s/ classificação (98) Risco de Recorrência 427 baixo 25 5,9 intermediário ,0 alto 86 20,1 s/ classificação (45) Polimorfismo de repetição CA Observando os resultados dos ensaios de genotipagem de 426 pacientes para o polimorfismo de repetição CA, foi detectada a ocorrência de alelos contendo entre 14 e 24 repetições CA (gráfico 1). Os alelos de 16 e de 20 repetições foram os alelos mais frequentes na população e suas frequências alélicas podem ser observadas na tabela 4. A análise de todos os tamanhos alélicos encontrados na população indica 37 genótipos diferentes. 74

75 Gráfico 1: Gráfico mostrando a frequência alélica de acordo com o número de repetições CA. Assumiu-se o alelo mais frequente como limiar de corte para definir um alelo como curto ou longo. Assim, um alelo foi denominado curto quando apresentou número de repetições CA igual ou menor que 16, enquanto um alelo longo foi assim denominado quando apresentou mais de 16 repetições CA. A partir desta definição, foram caracterizados os grupos genotípicos curto/curto, considerado homozigoto predominante; curto/longo ou heterozigoto, e longo/longo, considerado homozigoto variante (tabela 3). Como não há consenso na literatura quanto à forma de definir os genótipos do polimorfismo de repetições CA, foi considerada também outra forma de avaliação, analisando o somatório de repetições CA dos dois alelos de cada paciente (gráfico 2). 75

76 Tabela 3: Descrição dos grupos alélicos e genotípicos do polimorfismo de repetição CA. Polimorfismo de repetição CA (rs ) Grupos alélicos 852 % longo/longo 124 % curto = CA ,7 18/ ,5 longo = CA > ,3 20/ ,0 18/ ,8 curto/curto % 19/ ,3 16/ ,0 17/20 8 1,9 15/16 6 1,4 17/18 7 1,6 14/16 4 0,9 17/19 6 1,4 14/15 1 0,2 17/ /21 6 curto/longo % 17/17 4 0,9 16/ ,4 19/19 3 0,7 16/ ,6 18/19 2 0,5 16/ ,5 20/ / ,0 18/21 1 0,2 16/ ,5 19/ / ,8 19/ /18 4 0,9 21/ /21 2 0,5 21/ / /23 2 Genótipos 426 % 14/24 1 0,2 curto/curto 96 22,5 15/17 1 curto/longo ,4 15/19 1 longo/longo ,1 15/ /22 1 Alelos frequencia IC 95% alelica 16 repetições 0,425 (0,398~0,460) 20 repetições 0,208 (0,180~0,236) Analisando as frequências dos somatórios das repetições CA e a linha de tendência de média móvel de dois períodos gerada pelo programa Microsoft Office Excel (versão 2007) no gráfico 2, podemos identificar dois grupos: um 76

77 grupo que apresentou soma igual ou maior ou igual a 36 repetições CA, e um grupo que apresentou soma de repetições CA menor do que 36. Gráfico 2: Frequência genotípica de acordo com a soma das repetições CA dos alelos de cada paciente. A tabela 4 mostra a proporção entre os grupos CAn < 36 e CAn 36, que apresentaram frequências semelhantes, 51,9% e 48,1%, respectivamente. Tabela 4: Descrição dos grupos genotípicos do polimorfismo de repetição CA agrupados pela soma das repetições. Soma das repetições CA Repetição CA 426 % CAn < ,9 CAn , Polimorfismo R497K A tabela 5 mostra a distribuição do polimorfismo R497K entre as 472 pacientes da população estudada. Observando os resultados dos ensaios de 77

78 genotipagem, foi encontrada uma frequência de 21,8% para o alelo variante A (adenina), representado pelo fenótipo Lys. Analisando a distribuição genotípica descrita na tabela 5, observamos que a população estudada encontra-se dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Tabela 5: Descrição dos grupos alélicos e genotípicos do polimorfismo de repetição CA agrupados pela soma das repetições. Grupos genotípicos R497K (rs ) Alelos 944 frequência alélica (IC 95%) Arg 739 0,782 (0,755~0,808) Lys 205 0,218 (0,192~0,245) Genótipos 472 % Arg/Arg ,4 Arg/Lys ,8 Lys/Lys 18 3,8 Equilíbrio de Hardy-Weinberg X 2 = 1, p = 0, ASSOCIAÇÕES FENÓTIPO X GENÓTIPO Polimorfismo de repetição CA A seguir analisaremos a distribuição dos grupos genotípicos de repetição CA em função das características clínico-patológicas. Na tabela 6, são apresentadas as variáveis de idade e de descrição morfológica dos tumores, não havendo diferenças significativas para a distribuição dos grupos genotípicos de repetição CA. 78

79 Tabela 6: Distribuição das características histopatológicas entre os grupos genotípicos do polimorfismo de repetição CA. Repetição CA Características Histopatológicas Total curto/curto CA 16 / CA 16 curto/longo CA 16 / CA > 16 longo/longo CA > 16 / CA > 16 p valor 426 N % N % N % Idade no diagnóstico 426 > 35 anos , , ,6 35 anos ,0 3 30,0 5 50,0 Tipo histológico 421 in situ , , ,4 invasivo , , ,8 Grau tumoral 377 grau , , ,5 grau 2 or , , ,7 Tamanho tumoral 385 T 2cm , , ,5 T > 2cm , , ,5 Status linfonodal 426 N0 ou N , , ,5 N2 ou N , , ,0 0,320 0,759 0,614 0,111 0,306 79

80 Tabela 7: Distribuição do status dos receptores hormonais e HER2 entre os grupos genotípicos do polimorfismo de repetição CA. Repetição CA Receptores Total curto/curto CA 16 / CA 16 curto/longo CA 16 / CA > 16 longo/longo CA > 16 / CA > N % N % N % p valor Receptor de estrogênio positivo , , ,6 negativo , , ,6 Receptor de progesterona positivo , , ,7 negativo , , ,8 Her2 status 375 negativo , , ,5 positivo , , ,6 0,492 0,039 0,497 80

81 Tabela 8: Distribuição das estimativas de prognóstico entre os grupos genotípicos do polimorfismo de repetição CA. Prognostico Total curto/curto CA 16 / CA 16 Repetição CA curto/longo CA 16 / CA > 16 longo/longo CA > 16 / CA > N % N % N % p valor Estadiamento (ptnm) 406 II , , ,2 III , , ,6 Prognóstico de Nottingham (NPI) 338 moderado a excelente , , ,8 ruim , , ,0 Risco de recorrência 387 baixo ou intermediário , , ,6 elevado , , ,1 0,473 0,282 0,308 81

82 Na tabela 7, estão apresentados os perfis de expressão de receptores e nota-se que a distribuição dos genótipos de repetição CA é diferente em função do status do receptor de progesterona. Na tabela 8, são avaliadas as variáveis de estimativa de prognóstico não havendo diferenças significativas para a distribuição dos grupos genotípicos de repetição CA. Dentre as características clinico-patológicas estudadas, o status de progesterona foi a única variável que demonstrou ter um p valor menor do que 0,05 para a diferença entre as distribuições genotípicas de repetição CA. No gráfico 3, observamos a tendência de diminuição da ocorrência do status RPentre os grupos genotípicos de repetição CA (p = 0,011). Gráfico 3: Tendência de diminuição da proporção de pacientes com status RP negativo entre os grupos genotípicos de repetição CA. Embora as razões de chance entre os grupos curto/longo e curto/curto ou entre os grupos longo/longo e curto/longo ultrapassem o valor de referência (OR = 1,0), as pacientes com genótipo longo/longo têm por volta de 50% menos chance de ter um status RP- do que pacientes com genótipo curto/curto ou curto/longo (tabela 9). Quando ajustamos o cálculo de OR para outras 82

83 variáveis que também poderiam estar associadas ao status de RP-, a associação entre genótipo longo/longo e o status RP- manteve-se estatisticamente significativa. Tabela 9: Cálculo de razão de chances para o status RP negativo entre os grupos genotípicos de Repetição CA.de repetição CA. Características Repetição CA curto/curto + curto/longo OR = 1,000 longo/longo OR cr (IC95%) OR ajus (IC95%) Receptor de progesterona 0,575 (0,344~0,961) negativo 0,324 (0,124~0,845) OR: odds ratio; ORcr: OR crude; OR ajus: OR ajustado: IC 95%: intervalo de confiança de 95% (RP) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, pt, pn, RE e HER2. A definição de pontos de corte para classificação dos alelos com repetição CA em curtos ou longos para este polimorfismo revela desafios devido à variabilidade dos tamanhos entre os alelos na população e a indefinição sobre a real associação entre determinado tamanho ou grupo específico de repetições CA e o perfil transcricional diferenciado. Assim, também foi analisada a influência das características clínicopatológicas sobre a distribuição os grupos genotípicos de repetição CA, divididos de acordo com a soma alélica de repetições CA de cada paciente: CAn < 36 versus CAn 36. Novamente, apenas o status de RP- afetou a proporção entre os grupos CAn < 36 e CAn 36 (tabela 10), isto é, as pacientes com genótipo CAn 36 têm por volta de 50% menos chance de ter um status RP- do que as pacientes com CAn < 36. Quando ajustamos este cálculo para outras variáveis que também poderiam estar associadas ao status 83

84 de RP negativo, a associação entre genótipo CAn 36 e o status RP negativo continua estatisticamente significativa. Tabela 10: Cálculo de razão de chances para o status RP negativo entre os grupos genotípicos de Repetição CA, agrupados pela soma alélica de cada paciente. Repetição CA Características CAn < 36 CAn 36 OR = 1,000 OR cr (IC95%) OR ajus (IC95%) Receptor de progesterona 0,536 (0,343~0,838) negativo 0,277 (0,125 ~ 0,613) OR: odds ratio; ORcr: OR crude; OR ajus: OR ajustado: IC 95%: intervalo de confiança de 95% (RP) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, pt, pn, RE e HER2. Visto que o diagnóstico de tumor com status RP- reflete pior prognóstico para o tratamento do câncer de mama, deste resultado infere-se que a ocorrência do genótipo variante do polimorfismo de repetição CA, representado pela presença de dois alelos longos (CAn > 16) ou pela soma dos alelos maior ou igual a 36 ( CAn 36), poderia estar associado a um perfil de melhor prognóstico da doença Polimorfismo R497K A seguir, analisaremos a distribuição dos grupos fenotípicos gerados pelo genótipo do polimorfismo R497K em função das características clínicopatológicas, estadiamento e estimativas de prognóstico. Os resultados de distribuição estão apresentados na tabela 11, 12 e

85 Tabela 11: Distribuição das características histopatológicas entre os grupos fenotípicos do polimorfismo R497K. R497K Características clínicopatológicas Total Arg/Arg Arg/Lys Lys/Lys p valor 472 N % N % N % Idade no diagnóstico 472 > 35 anos , ,1 18 3,9 35 anos ,4 7 63,6 0 0,0 Tipo histológico 467 in situ , ,4 1 2,7 invasivo , ,8 17 4,0 0,139 0,832 Grau tumoral 418 grau , ,2 2 3,4 0,958 grau 2 ou , ,0 15 4,2 Tamanho tumoral 424 T 2cm , ,1 8 4,0 0,464 T > 2cm , ,3 10 4,5 Status linfonodal 472 N0 / N , ,9 18 4,5 0,008 N2 / N , ,5 0 0,0 85

86 Tabela 12: Distribuição do status dos receptores hormonais e HER2 entre os grupos fenotípicos do polimorfismo R497K. R497K Receptores Total Arg/Arg Arg/Lys Lys/Lys p valor 472 N % N % N % Receptor de estrogênio 453 positivo , ,0 15 3,9 negativo , ,4 3 4,2 Receptor de progesterona 452 positivo , ,8 13 3,9 negativo , ,3 5 4,2 Her2 status 415 negativo , ,3 17 4,9 positivo , ,4 0 0,221 0,884 0,449 86

87 Tabela 13: Distribuição das estimativas de prognóstico entre os grupos fenotípicos do polimorfismo de R497K. R497K Prognostico Total Arg/Arg Arg/Lys Lys/Lys p valor 472 N % N % N % Estadiamento (ptnm) 451 II , ,7 18 4,7 III , ,1 0 Prognóstico de Nottingham (NPI) 374 moderado a excelente , ,4 15 5,1 ruim , ,3 2 2,5 Risco de recorrência 427 baixo ou intermediário , ,7 17 5,0 elevado , ,7 0 0,018 0,054 0,006 87

88 A única variável independente que mostrou associação com a distribuição dos grupos fenotípicos foi o status linfonodal. Entre as pacientes com status linfonodal N2 ou N3 houve menor prevalência do alelo variante para Lisina (Lys). Na tabela 13, a distribuição dos grupos fenotípicos gerados pelo genótipo do polimorfismo R497K é avaliada em função das variáveis de estimativa de prognóstico. Entre as pacientes com doença em estádio III ou consideradas com alto risco de recorrência houve menor ocorrência do alelo variante para Lisina (Lys). No gráfico 4, observamos a tendência da diminuição de status linfonodal pn2/pn3 em função dos genótipos R497K (p = 0,002). A proporção de status pn2/pn3 em relação ao status pn0/pn1 foi significativamente menor entre as pacientes Arg/Lys quando comparadas às pacientes com o genótipo/fenótipo de referência Arg/Arg com OR (IC 95%) = 0,468; (0,258 ~ 0,850). Entre as 18 pacientes homozigotas para o genótipo/fenótipo variante (Lys/Lys) não houve ocorrência de status linfonodal pn2/pn3, não sendo possível determinar a razão de chances nesse caso. Entretanto, tal ausência da categoria de pior prognóstico pn2/pn3 entre as pacientes Lys/Lys reforça a magnitude de associação entre o status linfonodal e o polimorfismo R497K. De acordo com esta noção, o estadiamento e a estimativa de risco de recorrência, que são variáveis afetadas pelo status linfonodal, também influenciaram significativamente a distribuição dos genótipos/fenótipos R497K (tabela 14). O prognóstico de Nottingham pareceu influenciar a distribuição dos genótipos/fenótipos R497K, embora tal associação não tenha alcançado significância estatística (p = 0,054). As variáveis que demonstraram ter um valor de p menor do que 0,10 para a diferença entre as distribuições fenotípicas de R497K foram selecionadas para avaliação das razões de chance considerando os genótipos/fenótipos variantes de forma agrupada (Arg/Lys + Lys/Lys) para comparação com o genótipo/fenótipo de referência (Arg/Arg). A tabela 14 mostra que as pacientes com genótipos/fenótipos variantes possuem menos chance de ter status linfonodal pn2/pn3 do que as pacientes Arg/Arg (OR = 88

89 0,419). Tal associação foi encontrada também para as variáveis definidoras de prognóstico, como o estadiamento, prognóstico de Nottingham e estimativa de risco de recorrência. Gráfico 4: Tendência de diminuição da proporção de pacientes com status linfonodal pn2 / pn3 entre os grupos fenotípicos do polimorfismo R497K. Quando ajustamos o cálculo das razões de chance para outras variáveis independentes, a associação entre a presença de pelo menos um alelo variante (Lys) e pior status linfonodal, pior estadiamento e pior prognóstico de Nottingham mantiveram-se estatisticamente significativas. Com relação à estimativa de risco de recorrência, o ajuste não se aplica, pois tal variável consiste de uma composição de todas as variáveis estudadas. Visto que o diagnóstico de tumor com status linfonodal pn2/pn3 possui um pior prognóstico para o tratamento do câncer de mama, este resultado sugere que a presença do alelo variante do polimorfismo R497K, alelo Lys (G A), poderia estar associado a um perfil de melhor prognóstico da doença. 89

90 Tabela 14: Cálculo de razão de chances para características histopatológicas entre os grupos fenotípicos do polimorfismo R497K. R497K Características Arg/Arg Arg/Lys + Lys/Lys OR = 1,000 OR cr (IC95%) OR ajus (IC95%) Status linfonodal 0,419 (0,231 ~ 0,759) N2 ou N3 0,332 (0,164 ~ 0,671) Estadiamento (ptnm) 0,479 (0,269 ~ 0,851) III 0,389 (0,202 ~ 0,749) Prognóstico de Nottingham (NPI) 0,523 (0,306 ~ 0,895) ruim 0,515 (0,294 ~ 0,901) Risco de recorrência 0,470 (0,278 ~ 0,794) elevado N.A. OR: odds ratio; ORcr: OR crude; OR ajus: OR ajustado: IC 95%: intervalo de confiança de 95% (pn) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, pt, RE, RP e HER2. (ptnm) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, RP, RE e HER2. (NPI) OR ajus p/ idade, tipo histológico, RP, RE e HER2. N.A.: não se aplica Modelo de grupos polimórficos do gene EGFR. Com a finalidade de avaliar a interação ente os dois principais polimorfismos do gene EGFR quanto à associação com variáveis de prognóstico do câncer de mama, buscou-se avaliar um modelo de predição de desfecho com base na análise combinada dos genótipos de repetição CA e R497K. Inicialmente, para construção do modelo foi preciso estabelecer os grupos considerados como referência ou variantes em cada caso. Para o polimorfismo de repetição CA foram analisados dois modelos: 1) o modelo 90

91 baseado no tamanho de cada alelo, definidos como curto (CA 16) ou longo (CA > 16), ou 2) o modelo baseado na soma dos dois alelos individuais, caracterizando dois genótipos, definidos como CAn < 36 ou CAn 36. Para o polimorfismo R497K, o genótipo/fenótipo predominante Arg/Arg foi considerado como referência para o modelo, enquanto os genótipos/fenótipos contendo Lys em hetrozigose ou homozigose foram considerados variantes. Foram avaliados a seguir dois modelos preditivos de interação entre os polimorfismos EGFR, EGFR 16 e EGFR 35, cuja diferença reside na forma de definição dos genótipos de repetição CA, seguindo, respectivamente, o modelo curto/longo para os alelos individuais ou o CAn Modelo EGFR 16 Neste modelo, os genótipos dos polimorfismos do gene EGFR foram agrupados como Referência 16 (Ref 16 ) e Variante 16 (Var 16 ), conforme descrito no quadro 7. Quadro 7: Definição dos grupos genotípicos de referência e variante do modelo EGFR 16. Grupos EGFR R497K Repetição CA Referência 16 Variante 16 Arg/Arg Arg/Lys ou Lys/Lys curto/curto ou curto/longo longo/longo 91

92 Modelo EGFR 35 Neste modelo, os genótipos dos polimorfismos do gene EGFR foram agrupados como Referência 35 (Ref 35 ) e Variante 35 (Var 35 ) de acordo com o quadro 8. Quadro 8: Definição dos grupos genotípicos de referência e variante do modelo EGFR 35. Grupos EGFR 35 R497K Repetição CA Referência 35 Arg/Arg CAn < 36 Variante 35 Arg/Lys ou Lys/Lys CAn Aplicação do modelo EGFR 16 A tabela 15 mostra as variáveis clinico-patológicas que apresentaram associação significativa com algum dos polimorfismos EGFR quando analisados de forma independente. Aqui, o modelo EGFR 16 é usado para avaliação de associação com tais variáveis selecionadas. Com exceção do status de RP, todas as demais variáveis afetaram significativamente a distribuição dos grupos genotípicos do modelo EGFR 16. Analisando a variável histopatológica que apresentou diferença na distribuição dos polimorfismos, o status linfonodal se apresentou estatisticamente diferente, e assim, observando as razões de chance, o grupo Var 16 /Var 16 é o único que difere do grupo referência. 92

93 Tabela 15: Cálculo de razão de chances para características histopatológicas entre os grupos genotípicos do modelo EGFR 16. Modelo EGFR 16 Características Total Ref 16 /Ref 16 Ref 16 /Var 16 Var 16 /Var 16 p valor N % N % N % , , ,4 Status linfonodal 426 N0 ou N , , ,1 N2 ou N , ,3 2 3,2 Receptor de progesterona 407 Positivo , , ,2 Negativo , ,7 9 8,2 Estadiamento (ptnm) 406 II , , ,5 III , ,3 3 4,8 Prognóstico de Nottingham 338 moderado a excelente , , ,9 Ruim , ,9 4 5,4 Risco de recorrência 387 baixo ou intermediário , , ,1 Elevado , ,9 3 3,9 0,015 0,125 0,042 0,027 0,011 Referência: Arg/Arg e CA 16 / CA 16 ou CA 16 / CA > 16; Variante: Arg/Lys ou Lys/Lys e CA > 16 / CA > 16 93

94 Na tabela 16, observamos a tendência da diminuição de status linfonodal pn2/pn3 em função dos genótipos EGFR 16 (p = 0,005). A proporção de status pn2/pn3 em relação ao status pn0/pn1 foi significativamente menor entre as pacientes Var 16 /Var 16 quando comparadas às pacientes Ref 16 /Ref 16 com OR (IC 95%) = 0,156; (0,036 ~ 0,674). Tabela 16: Tendência de diminuição da proporção de pacientes com status linfonodal pn2 / pn3 entre os grupos genotípicos do modelo EGFR 16. A tabela 17 mostra o cálculo das razões de chance para o genótipo EGFR 16 Var/Var, que reúne os dois polimorfismos, em comparação com os demais genótipos, aqui considerados em conjunto. Os resultados indicam que o genótipo EGFR 16 Var/Var está associado a uma menor ocorrência de mais de 3 metástases linfonodais e que está associado a índices de melhor prognóstico de Nottingham bem como ao menor risco de recorrência. Tais associações se mantêm após o ajuste para outras variáveis independentes. 94

95 Tabela 17: Cálculo de razão de chances para características histopatológicas entre os grupos grupos genotípicos do modelo EGFR 16. Modelo EGFR 16 Características Ref 16 /Ref 16 + Ref 16 /Var 16 Var16 /Var 16 OR = 1,000 OR cr (IC95%) OR ajus (IC95%) Status linfonodal 0,187 (0,044 ~ 0,788) N2 ou N3 0,216 (0,048 ~ 0,971) Estadiamento (ptnm) 0,299 (0,090 ~ 0,991) III 0,316 (0,092 ~ 1,091) Prognóstico de Nottingham (NPI) 0,302 (0,105 ~ 0,872) ruim 0,320 (0,108 ~ 0,951) Risco de recorrência 0,210 (0,063 ~ 0,695) elevado N.A. Ref 16 : Arg/Arg e CA 16 / CA 16 ou CA 16 / CA > 16 Var 16 : Arg/Lys ou Lys/Lys e CA > 16 / CA > 16 OR: odds ratio; ORcr: OR crude; OR ajus: OR ajustado: IC 95%: intervalo de confiança de 95% (pn) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, pt, RE, RP e HER2. (ptnm) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, RP, RE e HER2. (NPI) OR ajus p/ idade, tipo histológico, RP, RE e HER2. N.A.: não se aplica Aplicação do modelo EGFR 35 Dentre as características clinico patológicas estudadas, o status do envolvimento linfonodal, do receptor de progesterona, do estadiamento, do prognóstico de Nottihgham e da estimativa do risco de recorrência apresentaram uma associação significativa com algum dos polimorfismos 95

96 estudados. A distribuição destas características entre os grupos genotípicos do modelo EGFR 35 foram comparadas. Na tabela 18, observamos que o status do envolvimento linfonodal, o RP, o prognóstico de Nottihgham e a estimativa do risco de recorrência mostraram uma distribuição estatisticamente diferente entre os grupos do modelo EGFR 35. A incidência de pacientes com status RP negativo pareceu diminuir de acordo com a ocorrência do grupo de genótipos variante

97 Tabela 18: Distribuição das características histopatológicas entre os grupos genotípicos do modelo EGFR 16. Modelo EGFR 35 Características Total Ref 35 /Ref 35 Ref 35 /Var 35 Var 35 /Var 35 p valor N % N % N % , , ,7 Status linfonodal 426 N0 ou N , , ,8 N2 ou N , ,1 5 8,1 Receptor de progesterona 407 positivo , , ,2 negativo , , ,5 Estadiamento (ptnm) 406 II , , ,4 III , ,1 6 9,7 Prognóstico de Nottingham 335 moderado a excelente , , ,8 ruim , ,1 7 9,5 Risco de recorrência 387 baixo ou intermediário , , ,2 elevado , ,7 6 7,8 0,025 0,048 0,056 0,028 0,002 Referência: Arg/Arg e CAn < 36 Variante: Arg/Lys ou Lys/Lys e CAn 36 97

98 Na tabela 19, observamos que não houve tendência de diminuição da ocorrência de pacientes com status linfonodal pn2 / pn3 dentre os grupos do modelo EGFR 35 (p = 0,084). Porém, as razões de chance envolvendo a incidência de pacientes com status RP negativo foram estatisticamente diferentes entre o grupo Ref 35 /Var 35 e Var 35 /Var 35. Tabela 19: Tendência de diminuição da proporção de pacientes com status linfonodal pn2 / pn3 entre os grupos genotípicos do modelo EGFR 35. Também na tabela 19, observamos que houve uma tendência de diminuição da ocorrência de pacientes com status RP negativo dentre os grupos do modelo EGFR 35 (p = 0,015). Porém, as razões de chance envolvendo a incidência de pacientes com status RP negativo não parecem diferir entre os grupos. Dentre as características estudadas na tabela 18, o status do envolvimento linfonodal, do RP, do estadiamento, do prognóstico de Nottingham e da estimativa de risco de recorrência foram as a variáveis que demonstraram ter um valor de p menor que 0,10 para a diferença entre as distribuições dos grupos deste modelo. Para cálculo de odds ratio, os grupos foram dicotomizados em pacientes Ref 35 /Ref 35 e pacientes Ref 35 /Var 35 versus pacientes Var 35 /Var 35. A tabela 20 mostra que as pacientes com genótipo Var 35 /Var 35 têm por volta de 70% a menos de chance de ter status linfonodal pn2 / pn3 do que pacientes Ref 35 /Ref 35 ou Ref 35 /Var 35, com um OR (IC95%) = 0,297 (0,115 ~ 0,765). 98