UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA

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1 1 UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA Aspectos metabólicos e comportamentais de ratos desnutridos e em recuperação nutricional Bruna Almeida Junqueira de Abreu 2012 DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

2 Bruna Almeida Junqueira de Abreu ASPECTOS METABÓLICOS E COMPORTAMENTAIS DE RATOS DESNUTRIDOS E EM RECUPERAÇÃO NUTRICIONAL Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Fisioterapia, da Universidade Metodista de Piracicaba, para obtenção do Título de Mestre em Fisioterapia. Área de concentração: Intervenção Fisioterapeutica. Linha de pesquisa: Plasticidade Neuromuscular e Desenvolvimento Neuromotor: Avaliação e Intervenção Fisioterapêutica. Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto da Silva PIRACICABA 2012

3 Ficha Catalográfica A162a Abreu, Bruna Almeida Junqueira de Aspectos metabólicos e comportamentais de ratos desnutridos e em recuperação nutricional / Bruna Almeida Junqueira de Abreu. Piracicaba, SP : [s.n.], f.: il. Dissertação (Mestrado em Fisioterapia) Universidade Metodista de Piracicaba, Faculdade de Ciências da Saúde. Programa de pós-graduação em Fisioterapia, Piracicaba, Orientador: Carlos Alberto da Silva Co-Orientador: Denise Castilho Cabrera Santos Inclui Bibliografia

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5 5 Dedico este trabalho, sem dúvida, ao Homero e a Elizabeth, meus pais os quais me proporcionam condições para realizar meus projetos sempre com amor, responsabilidade, além da estrutura adequada para seguir em frente. Meu eterno amor

6 6 AGRADECIMENTOS À Professora Doutora Denise Castilho por ter me aceitado inicialmente no mestrado como sua aluna o que me possibilitou a trilhar o caminho com o Professor Doutor Carlos Silva. Ao Professor Doutor Carlos Silva pela dedicação ímpar, paciência e competência, realmente um exemplo de orientador. Aos meus queridos avós, eu sou sortuda por ter avós aos 27 anos, então agradeço à eles Marina, José e Wanda pelo carinho e dedicação. As minhas amigas de Poços de Caldas: Lara, Cynthia, Priscila, Dulce, Renata, Tahis, Kathianne e Luanna sempre presentes na minha vida de uma forma única, especial mostrando que a amizade é realmente algo valioso e que vale a pena cultivar sempre. As minhas amigas de Piracicaba Luana, Vanessa e Clarissa as quais dividiram apartamento comigo e a Dona Terezinha que me acolheu por quase dois anos na sua casa. Ao meu namorado Arison, apesar de ter feito parte da reta final da minha jornada no mestrado, agradeço por fazer das horas livres momentos especiais mostrando que a dedicação no trabalho sempre vale a pena no final. Ao meu amigo Rafael Calixto parceiro de estrada às 5 e meia da manhã. À minha professora de inglês Maria Tereza, por me ensinar a língua, desta forma sendo possível ler os artigos com facilidade. À laboratorista Patrícia que me ajudou a desenvolver a parte prática da minha pesquisa.

7 7 No que diz respeito ao desempenho, ao compromisso, ao esforço, à dedicação, não existe meio termo. Ou você faz uma coisa bem feita ou não faz Ayrton Senna

8 8 RESUMO A desnutrição infantil é um assunto relevante já que é uma das principais causas de mortalidade, geralmente inicia na fase intra-uterina ou no início da infância. A desnutrição protéico calórica em fases iniciais da vida causa alterações estruturais e funcionais no sistema nervoso, que podem ser permanentes, assim alterando o comportamento e prejudicando o aprendizado e a memória. A experimentação com animais é utilizada, pois permite análises à nível celular e molecular, já que por outros meios não seria possível. Desta forma o objetivo do estudo foi caracterizar o status nutricional de ratos recuperados após desnutrição e avaliar o comportamento com ênfase na memória e aprendizado. O estudo foi feito com ratos da linhagem Wistar e dividido em dois momentos; desnutrição 45 dias, alimentados com dieta 6% de proteína e recuperação nutricional 45 dias, alimentados com dieta 14%, os animais foram submetidos à vários testes para análise do comportamento.os resultados mostram que o rato desnutrido apresenta o cérebro imaturo tanto metabolicamente quanto funcionalmente, mesmo após a recuperação nutricional mostram ainda comprometimento no desenvolvimento corporal, na homeostase glicêmica, alterações morfológicas e neuroquímicas no sistema nervoso central, comprometendo de fato o aprendizado e a memória, o que pode ser comparado com população humana, ou seja, crianças que passam por períodos de desnutrição antes de dois anos de idade tendem a apresentar retardos no desenvolvimento cognitivo e no desempenho nas fases escolares. Conclui-se portanto que mesmo após uma reabilitação nutricional adequada os efeitos causadas pelo desnutrição são revertidos parcialmente, assim uma criança que passa por desnutrição pode apresentar alterações permanentes por toda a vida. Palavras-chave: Desnutrição infantil; memória; desenvolvimento infantil

9 9 ABSTRACT Malnutrition is a significant issue since it is the main cause of infant mortality, usually begins at intrauterine phase or at the beginning of childhood. The protein caloric malnutrition early in life causes functional and structural changes in the nervous system, which may be permanent, thereby changing the behavior and harming the learning and memory. Experimentation on animals is utilized, for it permits molecular and cellular analysis, since it wouldn t be possible in other ways. So the goal of the study was to characterize the nutritional status of recovered rats after malnutrition and evaluate their behavior emphasizing the memory and learning. The study was made with rats called Wistar and divided in two moments; 45 days malnutrition, fed with a diet of 6% protein and nutritional recovering 45 days, fed with a diet of 14%, the animals were submitted to several tests for behavior analysis. The results show the malnourished rat presents immature brain both functionally and metabolically, even after nutritional recovery they still show corporal development impairment, glucose homeostasis, changing in the Central Nervous System both morphological and neurochemical, really endangering the learning and memory. It can be compared to the human population; children who go through malnourished periods before two years of age tend to show delays in cognitive developments and in the performance in the school phases. It was concluded that, even after a convenient nutritional rehabilitation, the effects caused by bad nourishment are partially reverted. So a child who suffers from malnutrition may shows permanently changing in its entire life. Key words: Infant malnutrition; memory; child development

10 10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 11 2 OBJETIVO 22 3 MATERIAL E MÉTODOS 23 4 RESULTADOS 31 5 DISCUSSÃO 53 6 CONCLUSÃO 69 REFERÊNCIAS 70

11 11 1 INTRODUÇÃO A fome existe desde os tempos remotos, porém, cientificamente as consequências sobre o organismo humano a curto e longo prazo só tiveram o merecido destaque recentemente. Segundo Evans (2004) a fome afeta uma em cada cinco pessoas nos países em desenvolvimento. A fome e a pobreza causam diversos problemas de sobrevivência, desenvolvimento e crescimento da sociedade, sendo que um dos principais causas relacionadas com saúde pública é a desnutrição. A desnutrição protéico-calórica infantil é uma das principais causas de mortalidade infantil no Brasil. É definida segundo a Organização Mundial da Saúde como uma variedade de condições patológicas decorrentes das deficiências de energia e proteínas, em proporções variadas. É uma doença multifatorial cujas raízes se encontram na pobreza. Pode iniciar precocemente na fase intra-uterina ou no início da infância cuja principal causa é a interrupção do aleitamento materno antes do previsto. Mais de 10 milhões de crianças desnutridas morrem por ano em países pobres (BLACK et al., 2003). A principal causa da morte esta associada à doenças infecciosas, sendo a pneumonia e a diarréia as mais frequentes ( KALTER et al., 1990). Algumas outras condições, além da dieta deficitária, podem acarretar em desnutrição, como a má absorção intestinal, perda anormal de nutrientes através da diarréia, hemorragia, insuficiência renal ou sudorese excessiva (SCHAFER et al., 2008).

12 12 O papel materno é fundamental na infância, uma vez que, segundo D Ovídio (2007), os principais hábitos alimentares são adquiridos na primeira infância e são carregados por toda a vida. Estudos mostram que crianças de famílias com extrema baixa renda apresentam menor peso ao nascimento, maiores taxas de mortalidade, internações hospitalares e principalmente maiores índices de desnutrição (ISSLER et al., 1996). Neste sentido as crianças matriculadas em escolas municipais apresentam mais frequentemente déficit de peso para altura quando comparadas com crianças das escolas particulares (GUARDIOLA et al., 2001). Além disso, os efeitos são negativos por toda a vida do indivíduo, cerca de 20% dos desnutridos atingem a vida adulta com uma estatura inferior ao esperado e ainda quando inseridos no mercado de trabalho apresentam limitações no desempenho e por isso ganho inferior. Além disso, tendem a morar na região periférica das cidades e a criarem filhos com tendência a serem desnutridos (ISSLER et al., 1996). Por isso algumas soluções básicas podem diminuir a incidência como, por exemplo, a distribuição de renda e assim a disponibilidade de alimentos suficientes (LATORRACA et al., 1998). O primeiro passo do organismo frente à uma desnutrição é reduzir o gasto energético porém, quando esta medida não é suficiente, a gordura corporal passa a ser mobilizada, reduzindo a adiposidade e o peso corporal (BARAC-NIETO et al., 1978).

13 13 A desnutrição é classificada em três níveis segundo Gomez 1946: Primeiro grau é aquela a qual o déficit de peso é superior a 10% da média considerada normal, a de segundo grau 25% e a de terceiro grau 40%. A desnutrição de terceiro grau é a mais grave e pode ser subdividida em outras duas categorias. A primeira é o Marasmo caracterizado pela perda de tecido muscular e adiposo, com diminuição de 60% do peso corporal esperada pela idade (TRUSSWELL, 1981). E a segunda é Kwashiorkor caracterizada pela perda do tecido muscular, porém o tecido adiposo é preservado (WATERLOW, 1984). Os dados clínicos podem ser edema, dermatose, alterações dos cabelos e hepatomegalia (MARCONDES, 1976). A glicemia pode apresentar valores normais ou reduzidos em crianças que apresentam marasmo ou Kwashiorkor (WATERLOW e ALLEYNE, 1974). As proteínas plasmáticas são marcadoras da desnutrição já que estão diretamente relacionadas com a disponibilidade de aminoácidos para a síntese protéica (REID e CAMPBELL, 2004). O tipo da desnutrição está relacionado à sua origem, ou seja, se é deficiência protéica, vitamínica, calórica, de minerais ou ainda uma combinação destes componentes. Na literatura o tipo que se destaca é a proteica, onde a concentração de proteínas plasmáticas é marcadora da desnutrição (REID e CAMPBELL, 2004). É um nutriente de grande importância e as principais funções estão relacionadas com a formação de enzimas, anticorpos, hormônios, equilíbrio ácido-básico, transporte de oxigênio, coagulação do sangue e atividade muscular (NEIVA et al., 1999).

14 14 Em condições de nutrição normal a captação e utilização de nutrientes pelo organismo estão em equilíbrio assegurando, desta forma, o metabolismo celular adequado; crescimento, duplicação e maturação fenômenos que influenciam todas as fases do desenvolvimento desde a gestação até a fase adulta (ALVES et al., 2008). A falta destas substâncias causa consequências em todo o funcionamento do organismo e podem alterar inclusive aspectos do desenvolvimento. Desenvolvimento é a capacidade do ser humano em desempenhar funções cada vez mais complexas, este processo está diretamente ligado com os fatores biológicos, próprios da espécie e culturais, ou seja, meio no qual o indivíduo esta inserido. Os principais domínios são o desenvolvimento sensorial, linguagem e cognição que se refere aos processos mentais superiores como o pensamento, memória e aprendizado (MARCONDES, 1994). O crescimento e o desenvolvimento da criança dependem diretamente do ambiente e de três fatores extremamente importantes: nutrição, estimulação biopsicossocial e atividade física (MARCONDES, 1986). Uma alimentação que não supre as necessidades de proteínas e calorias provocam alterações em todo o metabolismo na criança e o organismo cria mecanismos eficientes para economizar energia, evitando assim risco para a sobrevivência, diminui a velocidade de crescimento e em alguns casos extremos anula completamente (MOYSÉS E LIMA, 1983). De fato a desnutrição infantil causa diversas consequencias já que ocorre em períodos críticos do desenvolvimento assim causando prejuízos

15 15 no desenvolvimento motor (SMART, 1993) e em casos mais graves pode ocorrer má formação do sistema nervoso consequentemente alterando o aprendizado (VALADARES, 2006). Além disso, alterações comportamentais, tendem a apatia, exploram menos o ambiente tanto em quantidade quanto em complexidade, o nível de desenvolvimento é baixo e o número de atividades desempenhadas por elas também são mais baixas quando comparadas com crianças nutridas (GRANTHAM et al., 1990). Tem sido demonstrado que em sala de aula a criança desnutrida apresenta dificuldade em concentração, coordenação motora, dificuldade em aquisição e formulação do aprendizado, ou seja, a fome reduz de uma forma geral o rendimento do aluno na escola (FROTA et al., 2009). Além disso, é possível gerar modificações comportamentais tais como alterações emocionais, motivação e ansiedade. Ocorrem também, alterações intelectuais, que prejudicam definitivamente o aprendizado e memória, a criança pode apresentar um desenvolvimento inferior esperado para a idade (LEVITSKY e STRUPP, 1995). Em suma a desnutrição é um fator de risco em potencial para o atraso no desenvolvimento neuropsicomotor em crianças, a identificação deste atraso é fundamental para a intervenção precoce (Miranda, 2003). Neste sentido a fisioterapia é de grande importância já que tem como objetivo trabalhar a funcionalidade da criança através de posturas e movimentos e, além disso, associar a terapia o processo ensino aprendizagem desta forma a tornando mais efetiva e completa (ALMEIDA et al., 2005; ADALBJORNSSON, 2001)

16 16 Mesmo assim, é fundamental a recuperação nutricional nas primeiras fases da vida, visando desta forma, o desenvolvimento e crescimento normal, antes que as alterações permanentes se instalem (GIGANTE et al., 2007). Mesmo após uma reabilitação nutricional adequada algumas consequências podem causar alterações estruturais, neuroquímicas e comportamentais irreversíveis, principalmente se ocorrer no período crítico de desenvolvimento considerado do terceiro trimestre de gestação até o segundo ano de vida (DOBBING e SMART, 1974). Três fatores são fundamentais para a maturação do sistema nervoso central e consequentemente capacidade cognitiva: componente genético, estímulo ambiental e alimentação adequada (MORGANE et al., 1993). Fatores exógenos, por exemplo a desnutrição altera a atividade de enzimas e interfere na síntese de proteína essenciais para o funcionamento adequado (LEVISTKY e STRUPP, 1995). A maturação do sistema nervoso central é compreendido em quatro estágios: gênese e migração celular, proliferação axonal e dendrítica, sinaptogênese e mielinização axonal (MORGANE et al., 2002). Estes processos são complexos e extremamente importantes inclusive logo nas primeiras fases do desenvolvimento do sistema nervoso periférico e central ocorrem processos fundamentais que se desenvolvem em grande velocidade como a hiperplasia (aumento do número de celular), hipertrofia (aumento do tamanho das células) e mielinização (revestimento dos axônios com mielina), fases que compreendem o período da amamentação, por isso o aleitamento materno é fundamental (MORGANE et al., 1992).

17 17 Assim, a desnutrição afeta o crescimento e desenvolvimento orgânico do sistema nervoso resultando em menor tamanho cerebral, menor número de células, menor quantidade de lipídios, com redução da mielina e alterações na atividade de vários sistemas enzimáticos, essas alterações ocorrem no período conhecido como vulnerável, ou seja, período pré-natal até aproximadamente dois anos de idade. Já se ocorrer em crianças mais velhas atrapalha as atividades intelectuais, mas não geram lesões cerebrais (MOYSÉS E LIMA, 1983). Existem estudos sugerindo que durante a desnutrição haja redução na neurogênese e gliogênese (DOBBING, 1976). Porém todas as consequências no desenvolvimento humano ainda não estão totalmente esclarecidas, ao contrário dos modelos experimentais com ratos, as quais estas alterações são mais evidentes. Os estudos com animais de laboratório são utilizados para avaliar os efeitos da desnutrição, já que em populações humanas existe uma grande dificuldade principalmente por questões éticas e também não menos importante por dificuldade de separar os efeitos devido à um grande número de variáveis (PARO et al., 1980). Em laboratório algumas técnicas podem ser utilizadas para induzir a desnutrição em ratos; restrição protéico-calórica, aumento do número de filhotes na ninhada e restrição do período de amamentação dos filhotes. A falta de proteína causa algumas alterações no organismo as principais estão relacionada com a redução do crescimento e do peso (SCHAFER et al., 2008).

18 18 A desnutrição afeta a formação de hormônios e enzimas que atuam diretamente no processo de desenvolvimento do peso e de crescimento (NEIVA e MELLO, 1999). O estudo de Nascimento et al., (1990), mostra que os ratos desnutridos apresentam redução do peso corporal em até 50% comparado com o rato nutrido, diminuição de pêlo, aumento da curvatura dorsal, são mais ativos e também agressivos, muitas vezes dificultando inclusive a captura. Ratos desnutridos no início da fase pós natal por um curto período de tempo possuem deficiências morfológicas e alterações em várias regiões do sistema nervoso central, principalmente os córtices frontal, visual e cerebelar. A formação hipocampal é bastante vulnerável a este período de desnutrição, que podem ir do nascimento a 150 dias de vida (MORGANE et al., 1992). A formação hipocampal é uma das estruturas mais afetadas pela desnutrição e pode promover alterações permanentes (DOBBING, 1976). Em relação ao aspecto histológico em todos os órgãos em menor ou maior intensidade ocorre uma atrofia celular universal, ou seja, massa citoplasmática reduzida, núcleo tumefeito posteriormente diminuído e hipercromático. E no sistema cardíaco e esquelético alterações também no volume das fibras sem alterações qualitativas (MADI e CAMPOS, 1975). O tecido muscular esquelético é um reservatório de proteína, por isso segundo Nascimento et al (1990), quando há déficit protéico na dieta o tecido é alvo de depleção, ou seja, diminuição. Algumas alterações foram observadas como, por exemplo, o diâmetro da fibra muscular foi reduzido,

19 19 nestas fibras encontraram os espaços intercelulares alargados contendo vasos capilares e fibroblastos e escasso colágeno fibrilar não houve aumento do colágeno intersticial e ainda estrutura miofibrilar e miofilamentar mantida. Alterações hormonais, também foram constatadas, para manter a homeostasia energética através da glicose e lipólise aumentadas, maior mobilização de aminoácidos, preservação das proteínas viscerais, através da maior utilização das proteínas musculares, diminuição do armazenamento de glicogênio, gorduras e proteínas e diminuição do metabolismo (SAMPAIO, 2009). Do ponto de vista funcional alterações relacionadas com a emoção, a motivação e ansiedade e, além disso, prejuízo nos processos que envolvem aprendizado e memória. Ratos desnutridos em laboratório demonstram excitabilidade neural elevada tais como reatividade aumentada à estímulos aversivos e facilidade para obter crises convulsivas induzidas experimentalmente (GUEDES et al., 2004). Em um estudo realizado por Nascimento et al. (1991) com ratos mostram que estes animais desnutridos de 21 dias de idade até a fase adulta são tão hábeis quanto os bem nutridos para aprender sobre o ambiente. Levitsky e Barnes (1970) mostraram maior sensibilidade em ratos desnutridos à situações aversivas e aumento da emoção no teste do campo aberto, já que apresentam maiores níveis de micção e defecação. E ainda aumento da agressividade quando comparados com os ratos nutridos (SILVA, 2000).

20 20 Além dos sinais evidentes de alterações no comportamento e aprendizado, os ratos desnutridos apresentam comportamento emotivo extremamente lábil, redução do comportamento exploratório e menor habilidade para solucionar problemas (MOYSÉS e LIMA, 1983). A memória é um ponto importante de ser tratado na desnutrição, já que ocorre prejuízo na retenção de memória espacial. No teste do labirinto aquático de Morris, ocorreu uma diminuição progressiva na latência de escape para a plataforma, não havendo diferença entre os grupos isso significa que os animais foram capazes de aprender no treinamento com o passar dos dias. Porém a redução na latência do escape foi mais evidente nos animais nutridos (HEMB, 2007). Em contradição no estudo de Campbell e Bedi (1989), nenhuma evidência de que a desnutrição precoce prejudica o aprendizado espacial, acredita-se que o cérebro tem a capacidade de funcionar normalmente mesmo com o déficit de algumas substâncias ou até mesmo distorções de algumas estruturas morfológicas do cérebro. Animais submetidos à desnutrição e posteriormente a reabilitação nutricional não apresentam diferença no peso cerebral, a diferença existe quando compara-se animais desnutridos e nutridos. Outro achado importante é em relação ao peso corporal, a diferença é menor no grupo desnutrido mesmo após a reabilitação nutricional (NUNES et al., 2002). É esperado o aumento significativo do peso, porém o restabelecimento pode ser total ou não, isso depende principalmente de dois fatores fundamentais: da duração da desnutrição e período do

21 21 desenvolvimento o qual foi iniciado. De fato quanto mais cedo for iniciada a desnutrição menor será a evolução do peso (GOBATTO, 1991). Segundo Melo et al, 1989 a reabilitação nutricional pode desempenhar um papel positivo na reversão de alguns efeitos causados pela desnutrição precoce na habilidade de memória espacial. Animais desnutridos após a reabilitação nutricional apresentam aumento na atividade exploratória nos braços abertos do labirinto em cruz elevado (Almeida et al., 1993). Ratos desnutridos apresentam o peso e diâmetro corporal menores, teores séricos de glicose, proteínas totais e albumina significantemente menor e níveis séricos de AGL e hepáticos, gordura e glicogênio significantemente maiores comparando com o rato nutrido. Após a recuperação nutricional os mesmos apresentam níveis séricos de glicose, proteínas totais, albumina e ácidos graxos livres e hepáticos de glicogênio e gordura semelhantes quando comparados ao rato nutrido, porém o peso e o comprimento corporal permaneceram inferiores (ROCHA et al., 1997). A desnutrição diminui a plasticidade cerebral consequentemente alterando o mecanismo do aprendizado e causando déficits cognitivos, após a reabilitação nutricional a plasticidade restaurada pode atuar de forma efetiva nas alterações cerebrais desencadeadas por um desequilíbrio nutricional (PAULSEN E MOSER, 1998). A possível hipótese para este estudo é que ratos recuperados nutricionalmente apresentam alterações permanentes nos testes do comportamento e ainda possivelmente alguns parâmetros bioquímicos alterados pela desnutrição não são revertidos completamente.

22 OBJETIVO GERAL Avaliar o impacto da desnutrição e reabilitação nutricional nos parâmetros bioquímicos e comportamentais com ênfase na memória e aprendizado. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Caracterizar a curva de peso dos animais durante as fases de desnutrição e recuperação nutricional. O peso da glândula supra-renal, fígado e músculo sóleo também foram investigados. Realizar um estudo bioquímico caracterizando as concentrações plasmáticas de Proteínas totais e Albumina. Realizar 3 testes comportamentais (teste de campo aberto, Labirinto em cruz elevada e teste de reconhecimento de objeto) no grupo desnutrido. Realizar um estudo hematológico nos grupos recuperados pósdesnutrição. Avaliar as reservas glicogênicas musculares de ratos desnutridos e recuperados pós-desnutrição. Realizar um estudo de sensibilidade a insulina e responsividade pancreática frente à sobrecarga de glicose no grupo recuperado pósdesnutrição. Realizar 5 testes comportamentais (teste de campo aberto, Labirinto em Cruz Elevada, Teste de reconhecimento de objeto, Teste de reconhecimento social e labirinto aquático) no grupo recuperado pósdesnutrição.

23 23 3 MATERIAL E MÉTODOS Animais Procedência e manutenção: Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var, albinus, Rodentia, Mamalia), desmamados no 21 dia de vida, pesando de 38 a 58 gramas, provenientes da empresa ANILAB (Paulínia). Os animais foram mantidos no Biotério em gaiolas coletivas contendo 4 animais cada uma, recebendo água e alimentação ad libitum e mantidos em ambiente com temperatura controlada de 23 C 2 C e iluminação adequada, ciclo claro/escuro de 12 horas, com luz acesa a partir das 6 horas. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética na Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), pelo protocolo 011/2011. Os animais foram aleatoriamente divididos em grupos experimentais com 10 ratos cada e assim denominados: Controle (alimentados com dieta normoproteica), Desnutridos (alimentados com dieta contendo 6% de proteína por 45 dias) e Recuperado do ponto de vista nutricional ( alimentado com dieta contendo 6% de proteína durante 45 dias e realimentados com dieta contendo 14% de proteína por mais 45 dias). O estudo foi dividido em dois momentos. Na primeira fase denominada desnutrição os animais do grupo controle foram tratados com dieta AN 93 - contendo 14% de proteína (normoproteica) enquanto o grupo desnutrido foi tratado com dieta contendo 6% de proteína (hipoproteica), por 45 dias. A segunda fase foi denominada recuperação nutricional, onde os animais do grupo controle continuaram recebendo a dieta AN 93-14% de proteína enquanto o grupo recuperado seguiu o protocolo de desnutrição por 45 dias e a partir deste período, passou a receber dieta AN 93-14% de proteína, por mais 45 dias. Na tabela 1 pode-se verificar a constituição da dieta. Durante o experimento foram empregadas dietas normoproteica (AN 93M - 14%) e hipoproteica (AN - 6%) comercializada por PragSoluções Serviços e Comércio Ltda; CNPJ: / / IE: ME (composição descrita na tabela 1).

24 24 Tabela 1. Composição das dietas (g/kg) utilizadas para desnutrição Dieta AN 93 M -14% Dieta AN - 6% proteína (desnutrição) Ingredientes p/1 Kg Ingredientes p/1 Kg Amido de milho Amido de milho Caseína Caseína Amido dextrinizado Amido dextrinizado Sacarose Sacarose Óleo de soja Óleo de soja Fibra (Cel. Microcrist.) Fibra (Cel. Microcrist.) L-cistina L-cistina Cloreto colina Cloreto colina Mix mineral G Mix mineral G Mix vitamínico Mix vitamínico TOTAL TOTAL Determinação do glicogênio muscular Amostras do fígado, músculo sóleo e gastrocnêmio porção branca foram coletadas e digeridas em KOH 30% a quente e o glicogênio precipitado a partir da passagem por etanol. Entre uma fase e outra da precipitação, a amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos e o glicogênio foi submetido à hidrólise ácida na presença de fenol, segundo a proposta de Siu et al. (1970). Os valores foram expressos em mg/100mg de peso úmido. Determinação do peso dos animais, tecidual e consumo de dieta O peso dos órgãos das amostras bem como da ingesta de dieta foram avaliados com auxílio de balança eletrônica (Filizola ).

25 25 Determinação da concentração plasmática de Proteínas totais e Albumina As concentrações plasmáticas de proteínas totais e albumina foram determinadas através de kit de uso laboratorial (Prototal Labtest). Parâmetros hematológicos A determinação dos parâmetros hematológicos (hematócrito, concentração de hemoglobina; eritrometria) foi realizada através de técnicas rotineiramente aplicadas em laboratórios clínicos. Teste de Tolerância à Insulina (ITT) Para a realização do ITT, os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg, ip) e após 10 minutos da indução anestésica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma alíquota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada através de fita usada em glicoteste determinando o tempo zero. A seguir foi administrado insulina (2 U/Kg, ip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO, ROMA, TABAGA et al., 2007). Teste de Tolerância à Glicose (GTT) Para avaliação do GTT, os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg, ip) e após 10 minutos da indução anestésica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma alíquota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada através de fita usada em glicoteste determinando o tempo zero. A seguir foi administrado glicose (2 g/kg, ip) seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO, ROMA, TABAGA et al., 2007).

26 26 Anestésicos Nos Procedimentos onde foram coletadas amostras, os animais foram anestesiados com Tiopental sódico (40 mg/kg/peso,ip). AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL Teste de Campo Aberto Para análise da movimentação exploratória, os animais foram expostos ao teste do campo aberto Open Field no início da noite, período de maior atividade da espécie conforme o protocolo descrito por Cruz e Graeff (1994). O teste é constituído por uma caixa (46x46x25cm), dividida internamente em nove quadrados uniformes, cada um com a dimensão de 225cm 2 (figura 1), os animais permaneciam durante 3 minutos. A observação foi direcionada a movimentação exploratória e adaptação do animal ao ambiente. Como parâmetro avaliativo foi utilizado a contagem de deslocamento a partir do posicionamento de três membros do rato em um quadrado, sendo que o número total de quadrados percorridos foi utilizado como índice de deambulação espontânea conforme descrito por Royce (1977). Neste experimento foram respeitadas as normas e cuidados no que se refere as condições onde se realiza o teste de campo aberto, tais como a intensidade de luz, minimização de barulho, etc (WALSH e CUMMINS, 1976).

27 27 Figura 1. Teste de open field que consiste em uma caixa com dimensão de 46x46x25cm, divididos em 9 quadrados com dimensão de 225cm 2 cada. Labirinto em cruz elevado Os animais foram colocados numa plataforma elevada em formato de cruz, composta de um corredor fechado e outro aberto e seus limites de cruzamento, o período experimental de observação foi de 5 minutos, realizado no período noturno, após as 19:30 h, devido a maior atividade da espécie, onde foram cronometrado o tempo de permanência do animal em cada estação (braço fechado ou braço aberto), conforme o modelo descrito por Pellow, et AL; (1985). Figura 2: Labirinto em cruz elevada usado na avaliação do grau de ansiedade.

28 28 Índice de reconhecimento de objeto O fundamento deste teste se deve ao fato de roedores quando apresentados à objetos familiares e novos, passam uma maior porção do tempo explorando o objeto novo. Este experimento é indicado na avaliação de memória declarativa sendo assim realizado, a saber: Em um aparato de campo aberto retangular, colocado em uma sala acusticamente isolada e com baixa luminosidade, o animal é habituado ao local durante 5 dias e durante 10 minutos para exploração. Nesta fase um objeto estará exposto para contato com o animal. Para avaliar a memória de curta duração o teste será realizado durante a segunda tentativa para avaliação da memória de reconhecimento. Na segunda fase os animais voltam ao campo por mais 10 minutos, no entanto, agora contendo 2 objetos sendo o primeiro já conhecido e um segundo objeto. No cálculo registra-se o tempo gasto na exploração do objeto A e o tempo de exploração de B na segunda tentativa. O índice de reconhecimento é expresso pela razão (Tempo B x 100 / Tempo A + tempo B) (OLTON e PAPAS, 1978). (figura 3). A B Figura 3. Animais submetidos ao teste de reconhecimento de objetos. A: desnutrido; B: controle. Memória reconhecimento social O paradigma intruso-residente é empregado em estudos para avaliar a memória de reconhecimento social em roedores. Ratos adultos (residentes) são expostos a dois encontros de 5 minutos cada com um

29 29 mesmo intruso juvenil ou com juvenis diferentes; o intervalo entre encontros é de 30 minutos. No segundo encontro a quantidade de comportamentos sociais do rato residente em relação ao intruso é menor comparado com o primeiro encontro, o que não ocorre quando o segundo encontro envolve um juvenil novo; esse resultado caracteriza memória de reconhecimento social (Thor e Holloway, 1982). O experimento foi realizado pela manhã que é a fase inativa onde o comportamento é exibido em maior intensidade (MOURA et al., 2009) (figura 4). Figura 4: Teste de reconhecimento social. O animal residente (desnutrido recuperado) recebe na sua arena um animal intruso para avaliação do comportamento social. Teste do Labirinto Aquático de Morris. O objetivo deste teste é avaliar a memória espacial em ratos. Neste teste os ratos foram colocados em um tanque onde foi colocado uma plataforma para fuga, sendo essencial que os animais precisavam aprender a encontrá-la, a principal motivação deste aprendizado é a fuga (LUCAS et al; 2005). O labirinto consiste em um tanque circular com 90 cm de largura; 57 cm de altura, preenchido com água até 39 cm e 2 litros de leite com o intuito de deixar a água turva evitando que os ratos enxergassem a plataforma. A temperatura da água foi mantida à 26 ± 2 graus com iluminação posicionada nas paredes da sala. Cabe ressaltar que foram colocadas pistas visuais, as quais foram alternadas. Os principais pontos avaliados no teste são: o tempo necessário para o animal encontrar a plataforma denominado de tempo de latência e a memória de localização espacial (D HOOGE e DE

30 30 DEYN, 2001). Diariamente cada rato teve quatro chances de encontrar a plataforma, durante cinco dias (vide figura 5 ) Figura 5. Ambiente aquático utilizado na avaliação de memória espacial. Os números mostram os quadrantes. Análise estatística Na análise estatística foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro- Wilk, seguido do teste t de Student, ou pós-teste de Tukey, de acordo com a comparação dos grupos experimentais, p<0,05.

31 Peso (g) 31 4 RESULTADOS Os resultados deste estudo foram divididos em momentos experimentais diferenciados, porém integrados visando à melhor compreensão dos eventos quimiometabólicos e comportamentais. Na primeira fase serão apresentadas as avaliações bioquímicas que contemplam a fase de desnutrição e resultados da avaliação comportamental. Cabe salientar que o ponto principal e foco da dissertação, são os parâmetros determinados na fase pós-recuperação nutricional. O trabalho iniciou-se analisando a evolução do peso dos animais e pode-se verificar na figura 6 que o grupo tratado com dieta normoproteica (AN93-14%) denominado controle, apresentou valores 40%, 60%, 65,6%, 72,9% e 74,7%, respectivamente maiores da 2º à 6º semana se comparado aos animais tratados com a dieta 6% (hipoproteica) utilizada para indução da desnutrição. O grupo desnutrido não apresentou variação significativa no desenvolvimento do peso, ressaltando que no início das atividades experimentais havia homogeneidade no peso dos animais C1 C2 C3 C4 C2 D2 C3 D3 C4 D4 C5 D5 C6 D6 Figura 6. Evolução do peso (g) dos animais controle (C) e desnutridos (D) durante as 6 semanas de tratamento (período da desnutrição). Os valores correspondem à média ± epm, n= 10. A notação C1 - C4 compõem o grupo inicial. p<0,05 comparado ao controle.

32 mg/100mg mg/100mg 32 Acompanhando a caracterização do status de desnutrição, foram avaliadas as concentrações plasmáticas de albumina e proteínas totais e como pode ser observado nas figuras 7 e 8, as concentrações plasmáticas de proteínas totais apresentaram-se 23% menores se comparado ao grupo tratado com a dieta 14% enquanto a concentração de albumina foi 12% menor, seguindo a mesma comparação Dieta 14% Dieta 6% Figura 7. Concentração plasmática de proteínas totais (mg/100mg) dos grupos tratados com a dieta 14% e com a dieta 6%. Os valores correspondem à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle. 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Dieta 14% Dieta 6%

33 Consumo de dieta (g) 33 Figura 8. Concentração plasmática de albumina (mg/100mg) dos grupos tratados com a dieta 14% (normoproteica) e com a dieta 6% (hipoproteica). Os valores correspondem à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle. Um parâmetro importante na avaliações do status nutricional é o índice de ingesta sólida. Pode-se verificar na figura 9, que a média de consumo diário da dieta foi 38% menor no grupo submetido a dieta hipoproteíca, se comparado ao controle Controle Desnutrido Figura 9. Consumo diário da dieta (g) dos grupos controle e desnutridos. Os valores correspondem à média ± epm, n= 10. p<0,05 comparado ao controle. A partir de observações iniciais que indicam comprometimento no peso corporal, optou-se por avaliar a evolução do peso de alguns órgãos importantes para o equilíbrio homeostático, sendo escolhidos: a glândula supra-renal, por ser um órgão primordial no controle do estresse, a qual no grupo desnutrido apresentou peso 51% menor se comparado com o grupo controle (figura 10), o fígado e o músculo sóleo, pela importância enquanto

34 Peso (g) Peso (mg) 34 reservas energéticas, os quais, também apresentaram peso reduzido atingindo 39% e 58%, respectivamente (vide figuras 11,12) Controle Desnutrido Figura 10. Peso da glândula supra - renal (mg) dos grupos controle e desnutridos. Os valores correspondem à média ± epm, n= 10. p<0,05 comparado ao controle Controle Desnutrido Figura 11. Peso do fígado (g) dos grupos controle e desnutridos. Os valores correspondem à média ± epm, n= 10. p<0,05 comparado ao controle.

35 Peso (mg) Controle Desnutrido Figura 12. Peso do músculo sóleo (g) dos grupos controle e desnutridos. Os valores correspondem à média ± epm, n= 10. p<0,05 comparado ao controle. Nesta fase experimental, o trabalho foi direcionado a avaliação do conteúdo de glicogênio muscular e hepático, importantes reservas mobilizadas de acordo com as condições homeostáticas teciduais. Iniciou-se avaliando o músculo esquelético sendo escolhido o músculo sóleo (fibras vermelhas, tipo I) e o músculo gastrocnêmio porção branca ( fibras brancas, tipo II ). Nesta avaliação foi observado que no grupo desnutrido, as reservas glicogênicas apresentaram-se 38% e 52 % menores, respectivamente como mostra a figura 13.

36 mg/100mg mg/100mg 36 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 CS DS CGB DGB Figura 13. Conteúdo de glicogênio (mg/100mg) do músculo sóleo (S) e gastrocnêmio porção branca (GB) dos grupos controle (C) e desnutridos (D). Os valores correspondem à média ± epm, n= 10. p<0,05 comparado ao controle. A mesma análise foi realizada com foco nas reservas glicogênicas hepáticas e também foi observado que o grupo desnutrido apresentou menores reservas atingindo 32%, se comparado ao controle (vide figura 14) Controle Desnutrido Figura 14. Conteúdo hepático de glicogênio (mg/100mg) dos grupos controle e desnutridos. Os valores correspondem à média ± epm, n= 10. p<0,05 comparado ao controle.

37 Número de campos deslocados 37 Avaliação Comportamental Esta fase experimental teve início com a avaliação do índice de deslocamento em campo aberto (Open Field). A figura 15 mostra que, quando submetido ao Open Field, o grupo desnutrido apresentou índice de deslocamento 25% menor se comparado ao grupo controle Controle Desnutrido Figura 15. Número de campos deslocados durante o teste de campo aberto. Os valores representam à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle. Na mesma esfera de pesquisa foi avaliado o índice de reconhecimento de objeto, sendo observado que o grupo tratado com a dieta hipoproteica apresentou redução de 66% neste comportamento como mostra a figura 17.

38 Índice de reconhecimento (%) Controle Desnutridos Figura 16. Porcentagem de reconhecimento de objetos do grupo controle (dieta AN 14%) e desnutridos (dieta AN 6%). Os valores correspondem à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle.

39 39 Recuperação nutricional Esta fase teve início após concluir o processo de desnutrição (6 semanas) condição em que os animais do grupo desnutrido passaram a ser alimentados com dieta contendo 14% de proteína (AN93-14%). A figura 17 mostra animais nas duas condições utilizadas no estudo Figura 17. Ratos Wistar durante as fases experimentais. 1- animal tratado com dieta normoproteica (AN 93-14%) durante 45 dias; 2- animal tratado com dieta ipoproteica (AN - 6%) durante 45 dias (desnutrido); 3- animal tratado com dieta

40 40 normoproteica (AN 93-14%) durante 90 dias; 4- animal recuperado com dieta normoproteica (AN 93-14%) durante 45 dias após a desnutrição. Um ponto importante a se considerar é o fato de se tratar de um modelo de desnutrição proteica seguido de recuperação nutricional, sugerindo a necessidade de avaliar as condições hematológicas, no intuito de verificar se há alterações indicativas de anemia. Neste sentido, a avaliação dos parâmetros hematológicos mostrou anemia gerada pela desnutrição representado por valores 16,7% menores no hematócrito, 17% na hemoglobina, 34% na eritrometria e 27% no volume corpuscular, fato não verificado após a recuperação nutricional, como pode ser observado na tabela 3. Tabela 3. Parâmetros hematológicos dos ratos controle, desnutrido e recuperados nutricionalmente. Os valores correspondem à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle. Controle Desnutrido Recuperado Hematócrito (%) 43.5 ± 0, ± 0,5 45,5 ± 1,5 Hemoglobina (g/dl) 11,5 ± 0, ± 0,2 12,5 ± 0,4 Eritrometria (células x10 6 ) ± ± ± 362 Volume Corpuscular (µm ) 73 ± 0,03 53 ± 0,01 68 ± 0,03 Acompanhando o perfil de apresentação previamente determinado, acompanhou-se a curva de peso do grupo controle, sendo observado valores crescentes ao considerar-se o período da 7º à 14 semana estando as porcentagens assim representadas sequencialmente: 30%;9%;5%; 9%; 7%; 9%; 9%; 9%; conferindo a média de ganho de peso em 10%/semana. Por outro lado, no grupo recuperado foi observado valores extremamente diferentes se comparado a evolução do controle e ao considerar-se da 7º à 14 semana, as porcentagens ficaram sequencialmente assim representadas: 13%; 6%; 26%; 15%; 28%; 21%; 8%; 8%, representado média de peso de 12,4/semana (figura 18).

41 Peso (g) C6 D6 C7 D7 C8 D8 C9 D9 C10 D10 C11 D11 C12 D12 C13 D13 C14 D14 Figura 18. Evolução do peso (g) dos animais durante a recuperação nutricional pós-desnutrição. Os valores correspondem à média ± epm, n= 10. p<0,05 comparado ao controle. Dentro da mesma proposta optou-se por demonstrar os pesos dos diferentes órgãos que estavam alterados pela desnutrição. Pode-se verificar na tabela 4, a reversibilidade do quadro imposto pela desnutrição, de forma que, o fígado e o músculo sóleo apresentaram valores 246% e 326% respectivamente maiores do que o grupo desnutrido, e ainda se comparado ao controle o peso é 110% maior no fígado e 39,8% no músculo sóleo. Tabela 4. Peso dos órgãos de ratos controle, desnutrido e recuperado. Os valores correspondem à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle e #p<0,05 comparado ao desnutrido. Supra-renal (mg) Fígado (g) Sóleo (mg) Controle 35 ± 2.2 6,24 ± 96.5 ± 8.4 Desnutrido 17 ± ,1 ± 40.7 ± 5.3 Recuperado 30 ± 0, ,3.# ± 173,5 ± 9,1 1.5.#.#.#, #

42 Glicogênio (mg/100mg) 42 A seguir, foram avaliadas as reservas glicogênicas musculares de ratos submetidos à recuperação nutricional na fase pós desnutrição, sendo observado que o grupo recuperado apresentou reservas maiores se comparado aos desnutridos não recuperados, atingindo valores 45% maiores no sóleo; 76% no gastrocnêmio porção branca (vide figura 19). 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 SD SR GBD GBR Figura 19. Conteúdo de glicogênio (mg/100mg) dos músculos sóleo (S). gastrocnêmio porção branca (GB) e gastrocnêmio porção vermelha (GV) de ratos desnutridos (D) e recuperados pós-desnutrição ( R ). Os valores correspondem à média ± epm. n=10. p<0,05 comparado ao desnutrido. Uma vez que o fígado é o principal órgão responsável pelas reservas glicogênicas, optou-se por avaliar as reservas hepáticas sendo observado valores 128% maiores no grupo recuperado, como mostra a figura 20.

43 Glicogênio (mg/100mg) ,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Desnutrido Recuperado Figura 20. Conteúdo Hepático de glicogênio (mg/100mg) de ratos controle e recuperados pós-desnutrição. Os valores correspondem à média ± epm. n=10. p<0,05 comparado ao desnutrido. Tendo em vista a melhora nas condições energéticas, a avaliação foi direcionada as provas de função pancreáticas sendo observado que o grupo desnutrido quando submetido ao teste de tolerância à glicose (GTT) apresentou área sob a curva 61% maior do que o grupo controle, fato acompanhado de redução de 63% na constante de decaimento de glicose (KITT), indicando comprometimento na sensibilidade das células beta pancreáticas e nos tecidos periféricos. Por outro lado, foi observado que o grupo recuperado apresentou área sob a curva 14% menor do que o grupo desnutrido enquanto o KITT apresentou-se 52,9% maior, indicando ressensibilização (vide figura 21 e 22).

44 KITT (constante de decaimento da glicemia) Área sob a curva (mg/dl/120min) ,# C D R Figura 21. Área sob a curva no teste de tolerância á glicose (mg/dl/120min) de ratos controle ( C ), desnutridos ( D ) e recuperados pós-desnutrição ( R ). Os valores correspondem à média ± epm. n=10. p<0,05 se comparado ao controle e #p<0,05 se comparado ao desnutrido ,# 0 C D R Figura 22. Constante de decaimento da glicemia (KITT) de ratos controle (C), desnutridos (D) e recuperados pós-desnutrição (R). Os valores correspondem à média ± epm. n=10. p<0,05 se comparado ao controle e #p<0,05 se comparado ao desnutrido.

45 Nº de campos deslocados 45 Análise comportamental Obedecendo a sequência experimental passou-se à avaliação do grupo submetido à recuperação nutricional sendo verificado que, no teste de campo aberto, este grupo se movimentou 33% a mais que o grupo desnutrido, porém 6% a menos que o controle como pode ser observado na figura ,# C D R Figura 23. Comportamento exploratório no teste open field. Os valores correspondem à média ± epm, n=18. p<0,05 comparado ao controle, #p<0,05 comparado ao desnutrido. Ainda no aspecto comportamental foi avaliado o comportamento no labirinto em cruz elevado sendo observado que o grupo desnutrido permaneceu por um tempo 20% maior no braço fechado se comparado ao controle. No mesmo contexto, observa-se que há redução de 40% no tempo de exploração do braço aberto. Por sua vez, o grupo recuperado do ponto de vista nutricional, apresentou redução de 20% no tempo de permanência no braço fechado e aumento de 133% na exploração do braço aberto, se comparado ao desnutrido. Os dados não mostram diferença do controle no que se refere ao braço fechado, porém, há elevação de 40% na exploração do braço aberto (vide figura 24).

46 Índice de reconhecimento % de tempo de permanência no LCE # CBA CBF DBA DBF RBA RBF Figura 24. Porcentagem de tempo de permanência no braço aberto (BA) e no braço fechado (BF) no labirinto em cruz elevado (LCE). Grupo controle ( C ), Desnutrido ( D ) e Recuperado ( R ). Os valores correspondem à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle e #p<0,05 comparado ao desnutrido. A seguir foi avaliado o índice de reconhecimento de objetos do grupo controle (90 dias), desnutridos e recuperados pós-desnutrição. Observa-se que o grupo desnutrido apresentou redução de 76 % na capacidade de reconhecer um objeto novo. Por sua vez, a grupo recuperado mostrou elevação de 183% no índice de reconhecimento se comparado ao desnutrido, no entanto, ainda permaneceu 42% abaixo do observado no grupo controle. ( figura 25 ) , # C D R Figura 25. Índice de reconhecimento (%) dos grupos desnutridos (D; dieta AN 6%) e recuperados pós-desnutrição (R). Os valores correspondem à média ± epm,

47 Cheirar o intruso (nº de vezes) 47 n=10. p<0,05 comparado ao controle. p<0,05 comparado ao controle e #p<0,05 comparado ao desnutrido. A seguir avaliou-se o reconhecimento social através do número de contatos entre 2 encontros consecutivos separados por um intervalo de 15 minutos e foi observado que o grupo tratado com dieta 14%, no segundo encontro, apresentou redução de 49%, 33%, 50% e 50% no comportamento social de cheirar, tocar, empurrar e lamber. Cabe ressaltar que este comportamento não foi observado no grupo que foi desnutrido e recuperado como mostram as figuras 26,27,28, C - 1º C - 2º R - 1º R - 2º Figura 26. Comportamento de cheirar (número de vezes) dos grupos controle ( C, dieta 14% ) e recuperados pós-desnutrição ( R ) no primeiro (1º) e segundo (2º) encontros. Os valores correspondem à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle.

48 Empurrar o intruso (Nº de vezes) Tocar no intruso (Nº de vezes) C - 1º C - 2º R - 1º R - 2º Figura 27. Comportamento de tocar o intruso (número de vezes) dos grupos controle ( C, dieta 14% ) e recuperados pós-desnutrição ( R ) no primeiro (1º) e segundo (2º) encontros. Os valores correspondem à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle. 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 C - 1º C - 2º R - 1º R - 2º Figura 28. Comportamento de empurrar o intruso (número de vezes) dos grupos controle ( C, dieta 14% ) e recuperados pós-desnutrição ( R ) no primeiro (1º) e segundo (2º) encontros. Os valores correspondem à média ± epm, n=10. p<0,05 comparado ao controle.