Controle de qualidade de produtos não estéreis

Controle de qualidade de produtos não estéreis Na elaboração de medicamentos é indispensável o controle completo da produção, para garantir ao consumidor alta qualidade nos produtos. Segundo as Normas de Boas Práticas de Fabricação e Controle, os medicamentos devem ser fabricados, preparados embalados, rotulados e ensaiados em locais apropriados, onde sua integridade não seja alterada por fatores extrínsecos. Controle de qualidade de produtos não estéreis Contaminação em ambiente industrial farmacêutico é proveniente do ar, materiais de embalagem, equipamentos utensílios, e principalmente dos colaboradores da área produtiva. Manter o status de ambiente livre de contaminantes indesejáveis, ou dentro dos limites aceitáveis, é sem dúvida um grande desafio. Entre os principais fatores de contaminação dos medicamentos estão: Pessoal - Os indivíduos, carregam consigo uma grande variedade de microrganismos - Estes mantém contato direto com as matérias primas, produtos intermediários e acabado. Ambiente - Instalações com umidade elevada apresentam maior crescimento de fungos e bactérias G - Instalações empoeiradas podem propiciar crescimento de bactérias G+, micobactérias... 1

Existem várias maneiras de prevenir ou reduzir a população microbiana existente em áreas produtivas Pessoal -Treinamento; -Uso correto de uniforme e EPIs; -Higiene e assepsia das mãos; Ambiente - Material de construção; - Equipamentos; - Limpeza das áreas; - Descontaminação; - Removação do ar. Limites de aceitação Os limites de aceitação de contaminantes de ambientes, são estabelecidos conforme o grau de risco e da suscetibilidade a contaminação de cada produto e por cada empresa. Os limites para produtos e matérias primas são estabelecidos em monografias farmacopéicas. Limites de aceitação Água de processo Água geralmente é utilizada como matéria prima e portanto também pode vir a ser uma fonte de contaminação para o produto. Monografias farmacopéicas preconizam como limite máximo 100 UFC/ml para microrganismos totais aerobicos e ausência como P aeroginosa, coliformes totais e fecais em 100ml de amostra. Metodologia analítica Métodos de análise envolvendo medicamentos não estéreis abrangem: - Descontaminação e descarte; - Lavagem e acondicionamento; - Esterilização; - Amostragem; - Diluentes e inativantes; - Preparo de meios de cultura; 2

Metodologia analítica Metodologia analítica Descontaminação e descarte de resíduos: -Todo material resultante da análise microbiológica é considerado contaminado portanto deve ser descontaminado em autoclave a Temperatura de 121 C por 30 minutos. -Os materiais devem estar bem acondicionados no interior do equipamento. -Utilizando a mesma autoclave para esterilização de materiais, meios de cultura e descontaminação estes devem ser realizados em ciclos separados. Lavagem: -Esta é uma etapa fundamental no preparo do material de laboratório. -Lava-se com detergente, caso necessário utiliza-se soluções sulfocrômicas,ácidas... -São recomendados seis enxágües com água corrente e posteriormente dois enxágües com água destilada, purificada. -É importante ressaltar que a lavagem de materiais contaminados é realizada após a descontaminação em autoclave. Metodologia analítica Metodologia analítica Acondicionamento: -O material lavado e seco deve ser bem acondicionado para posterior esterilização, as placas de Petri devem ser empilhadas e embaladas em papel kraft. -Pipetas devem ser embrulhadas em papel Kraft ; -Tubos de ensaio devem ser tampados com buchas de algodão e tapados com papel kraft ; -Demais utensílios como espátulas, bastão de vidro..., devem ser embrulhados em papel kraft, identificar extremidade a ser aberta no momento da análise. Esterilização: - Materiais como placas, pipetas ponteiras, tubos de ensaio, frascos,... deverão ser esterilizados antes do uso. - Métodos utilizados:- por calor seco em estufa (170 C/2h); - calor úmido em autoclave (121 C/30 minutos); 3

Metodologia analítica Amostragem -A amostragem deve ser representativa do lote ao qual pertence. -Deve ser realizado: - por pessoal treinado, - em local específico, - as embalagem devem ser limpas e desinfetadas com álcool 77% (v/v), ou outra preconizada pela empresa. Metodologia analítica O número de amostras para análise microbiológica deve seguir um programa estabelecido para cada empresa. A quantidade de produto por amostragem não deve ser inferior a 50g ou ml. Os recipientes de coleta devem ser estéreis e identificados. Produtos a granel devem ser homogeneizados antes da coleta, sempre que possível. Em linhas de envase deve-se realizar no inicio meio e fim do processo produtivo. Metodologia analítica Metodologia analítica No caso de amostras líquidas sempre desprezar as primeiras porções antes de coletar a amostra. Coleta de amostras de água, as torneiras, tubulações devem ser limpas e desinfetadas com álcool ou flambadas sempre que possível. Amostra de água clorada adicionar 0,1ml de uma solução a 10% de tiossulfato de sódio (para 100ml de amostra), antes da esterilização do frasco de coleta., este irá interromper a ação bactericida do cloro sobre a microbiota presente. Diluentes Os diluentes tem como função nutrir as células microbianas, possibilitando a retomada das funções metabólicas e permitir que os esporos germinem em: - Caldo peptonado; - Caldo caseína-soja; - Miristrato de isopropila; - Ringer tamponado ph7,2 (tampão fosfato). Acrescentar a estes substâncias inativantes dos conservantes. 4

Relação conservantes e inativantes Conservante Formaldeído Liberadores de cloro Quaternários de Amônio e tensoativos anfóteros Parabenos (fenois)e derivados Metais pesados Inativante 0,1% (p/v) histidina 0,5%(p/v) tiossulfato de sódio 3,0% (p/v) polissorbato 80+ 0,3% de lecitina de soja 1,0% (p/v) polissorbato 80 0,1% (p/v) de cisteína Fonte: Controle Biológico de Qualidade de Produtos Farmacêuticos,Correlatos e Cosméticos. Terezinha se Jesus Andreoli Pinto Metodologia analítica Utilização dos diluentes Devem ser autoclavados por 15min, ph final de 7,2 ± 0,2, com exceção do miristrato de isopropila que deve ser esterilizado por filtração em membrana. Na escolha do diluente deve-se considerar a solubilidade da amostra. Em amostra hidrossolúveis ou facilmente dispersíveis, utiliza-se caldos. Utilização de diluentes Quando não for miscivel ou não dispersíveis em água recomenda-se usar miristrato de isopropila. Amostras sólidas deverão sofrer umectação com polissorbato 80 antes da primeira diluição. Autoclavar os diluente em tubos de ensaio tampados, contendo 9,0ml de diluente. Deixar repousar as diluições, homogeneizar e só após realizar o plaqueamento. Meios de cultura mais utilizados Meios de enriquecimento: - Caldo caseína-soja; - Caldo infusão cérebro e coração. Meios para contagem total de microrganismos: -Agar caseína-soja (Meio l); -Agar nutritivo. 5

Meios de cultura mais utilizados Meios utilizados para análise de fungos e leveduras: - Ágar Sabouraud-dextrose (Meio II); - Ágar batata-dextrose. Meios específicos para Pseudomonas: -Ágar cetrimida; -Ágar para detecção de fluoresceína; -Ágar Infuso Cérebro e Coração. Meios de cultura mais utilizados Meios específicos para S aureus: - Ágar Vogel-jonhson; - Ágar desoxirribuneclease; - Ágar sal manitol vermelho de fenol. Meios especificos para Salmonella sp: - Ágar verde brilhante; - Caldo digesto pancreático de caseína; - Ágar de lisina-ferro(lia); - Ágar tríplice açúcar-ferro(tsi); - Ágar citrato de Simmons. Meios de cultura mais utilizados Meios específicos para E coli: -Ágar Mac Conkey; -Ágar peptona-ferro; -Ágar de eosina-cloreto de metiltioninio; -Ágar tríplice-ferro (TSI); -Ágar citrato de Simmons; Meios para pesquisa de clostridios: -Ágar seletivo para clostridios; -Caldo tioglicolato. Coloração de Gram É de suma importância para análise microscópica. Permite realizar a diferenciação dos microrganismos: - Gram positivos (azul) - Gram negativos (vermelho). 6

Coloração de Gram Coloração de Gram TÉCNICA - Com alça de platina esterilizada em chama coletar uma gota de água no centro de uma lâmina de microscópio; - Coletar um fragmento de colônia microbiana,espalhar em movimentos circulares junto com a água; - Secar ao ar; - Cobrir com solução cristal violeta,aguardar por 1 minuto; - Lavar com água corrente; Coloração de Gram Coloração de Gram - Cobrir a lâmina com lugol, aguardar por 1 minuto; - Lavar com água corrente; - Descorar com álcool ou álcool cetona; - Lavar novamente com água corrente; - Cobrir a lâmina com solução de fucsina, por 30 segundos - Lavar e esperar secar. - Observar ao microscópico com objetiva de imersão. Em Gram + (violeta) é o componente majoritário, podendo chegar a 90 % do peso da parede. 7

Contagem de microrganismos viáveis totais Capaz de determinar o número total de bactérias e fungos presentes em produtos e matérias Primas não estéreis. Método por filtração em Membrana Substâncias solúveis em água. 10ml FLUIDO l A determinação pode ser realizada por três métodos: - Método de Filtração por Membrana, - Método de Contagem em Placa - Método de Tubos Múltiplicos. 10g ou ml AMOSTRA TAMPÃO FOSFATO 90 ml ph 10ml 90 ML MEIO I 30 35 C MEIO II 20-25 C FLUIDO l 90 ML FILTRAÇÃO POR MEMBRANA Método por filtração em Membrana Utilizar membrana de nitrato de celulose ou acetato de celulose, com porosidade igual ou inferior a 0,45µm. O equipamento para filtração e as membranas devem estar esterilizadas. Transferir 10ml ou quantidade que represente 1g da amostra para sistema filtrante e filtrar. Lavar a membrana 3 vezes com 100ml de solução salina estéril, ou Fluido I e tranferir para uma placa de Petri contendo o Meio I. Método por filtração em Membrana Realizar da mesma forma para outra membrama e colocar em placa contendo Meio II. Incubar as placas Meio I a 30-35 C por 4 dias e Meio II 20-25 C por 7 dias. A contagem deve ser inferior a 100UFC/ ml, caso exceda realizar nova diluição. 8

RESUMO ESQUEMÁTICO DO MÉTODO POR FILTRAÇÃO POR MEMBRANA Copo de Filtração Membrana Filtrante Placa Porosa Kitassato Membrana Placa com meio estéril + Membrana Incubação AMOSTRA MÉTODO DE CONTAGEM EM PLACA Substâncias insolúveis ou parcialmente insolúvel em água 10g/10ml 10-1 1 ml 90 ml tampão 1ml 1ml 1ml 9 ml água 9 ml água 10-2 10-3 10-4 Contagem Total Pour Plate ou estria em superfície Método de Contagem em Placas de Petri Bactérias:empregar placas de Petri, adicionando a cada placa 1ml da mistura de amostras e 15-20 ml de Meio I, liquefeito a 45 C. Preparar 2 placas para cada diluição, incubar a 30-35 C durante 4 dias. A contagem é expressa em Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por ml, g ou tempo. Calcular o resultado empregando placas com o maior número de colônias, sem ultrapassar 300 por placas. Método de Contagem em Placas de Petri Fungos: empregar placas de Petri, adicionando a cada placa 1ml da mistura de amostras e 15-20 ml de Meio II, liquefeito a 45 C ou pode dispersar a mistura de amostras na superfície do meio solidificado na placa. Preparar duas placas para cada diluição, incubar a 20-25 C durante 7 dias. A contagem é expressa em Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por ml, g ou tempo. Calcular o resultado empregando placas com o maior número de colônias, sem ultrapassar 100 por placas. 9

Contagem de colônias Utilizar contador de colônias ou lupa apropriada. Somente as placas que apresentarem até 300 colônias para bactérias e 100 para fungos deverão ser consideradas para registro dos resultados. Calcular a média aritmética de cada diluição multiplicando o número de colônias da placa pela diluição usada e relatar a média aritmética dos resultados. Contagem de colônias Diluição Colônias p/ UFC/mL placas 1:100 293 2,93x10 4 1:100 100 1,00 x 10 4 1:1000 41 4,1x10 4 1:1000 12 1,2x10 4 Média: (2,93+1,00+4,1+1,2) x 10 4 = 2,3 x 10 4 UFC/ml ou g 4 Se o número de colônias em todas as placas forem inferior a 20 registrar a contagem correspondente à menor diluição. Se não apresentarem colônias registrar como uma vez a menor Diluição correspondente Ex.: 1:100, menor que 100 UFC/ml ou g. MÉTODO DOS TUBOS MÚLPIPLOS Utilizado quando se espera que o produto apresente densidade bacteriana baixa. Preparação das amostras: - Amostras sólidas 10g para 90ml de diluente. - Amostras líquidas 1ml para 9ml de caldo de caseína-soja. Preparar diluições 1:100 e 1:1000 a partir da diluição 1:10 MÉTODO DOS TUBOS MÚLPIPLOS Empregar uma série de 12 tubos contendo caldo de caseína soja. Incubar os tubos a 30-35º C por 4 dias. Positivo exame microscópio, formação de gás,se turvar meio confirmar repicando novamente. Determinar o número mais provável de microrganismos por g ou ml. Exige tabelas estatísticas para obtenção do resultado a partir das leituras. 10

MÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS- Amostra sólida 10g 1ml 1ml 90 ml diluente 9 ml 9 ml 1ml diluente AMOSTRA 10-1 10-2 10-3 10 ml Caldo caseína soja 30-35 º C 4 DIAS Método geral para pesquisa Permite detecção de -Salmonella sp; -E coli; -P aeruginosa; -S. aureus. Que devem estar ausentes em produtos farmacêuticos não estéreis e matérias primas de uso direto em sua fabricação. Conforme via de administração do produto é indesejável a presença dos seguintes microrganismos: Método geral para pesquisa Via oral (sólido e fluidos) -Bacillus cereus; -Enterobacter sp; -Candida albicans; -Aspergillus flavus e parasiticus; Via nasal ou respiratória: -Enterobacter sp; -Serratia marcescens; -Klebsiella sp; -Candida albicans; -Proteus sp; -Actinobacter sp; -Pseudomonas cepacia; -Pseudomonas maltophilia; -Pseudomonas stutzeri; 11

Método geral para pesquisa Via tópica - Serratia marcescens; - Klebsiellas sp; - Pseudomonas cepacia; - Pseudomonas maltophilia; - Pseudomonas stutzeri; - Streptococcus, grupo B; Método geral para pesquisa Via intramamária - Staphylococcus sp; - Streptococcus sp grupo B; - Bacillus cereus; - Serratia marcescens; - Corynebacterium pyogenes; - Klebsiella sp; - Mycoplasma sp; - Enterobacter sp; - Pseudomonas sp; - Citrobacter sp; - Nocardia sp; - Proteus sp; - Cryptococcus neoformans; - Candida sp. Método geral para pesquisa Método geral para pesquisa Substâncias solúveis em água. - Transferir 10g ou 10ml da amostra para frasco contendo 90ml de tampão fosfato ph 7,2, agitar até dissolução. - Filtrar em membrana de 0,45µm. Lavar com 100ml de Fluido I. - Colocar a membrana em frasco contendo 300ml de Caldo de enriquecimento. - Incubar a 30-35 C, durante 24-48 horas. Realizar Fase seletiva e testes de confirmação: 12

Método geral para pesquisa Método geral para pesquisa Substâncias solúveis em água Filtrar membrana S. aureus Ágar Sal Manitol 36ºC 48 h Vogel Johson 36ºC 48 h 10g/10mL OU Se positivo = colônias amareladas, lisas, consistência untuosa e circundada por zonas de amarelo forte. Se positivo = colônias negro-brilhantes e circundadas por zona amarela. 90mL Caldo de enriquecimento 300mL 0,5ml plasma de coelho Tampão fosfato ph 7,2 30-35 C 24-48horas GRAM Coagulase bm 30-37 C Cocos G + Forma semelhante a cachos de uva. Formação de gel em 2, 4 e 24 horas. A + - 0,5ml cultivo em meio liquido Desoxiribunuclease 30-37ºC 18 h Positivo formação de zona incolor ao redor de crescimento. Pseudomonas aeruginosa Citocromo oxidase Solução aquosa 1% de cloridrato de N-dimetilp-fenilenodiamina Método geral para pesquisa Ágar Cetrimida 30-35 C 24 h Colônias apresentam aspecto variado, colônias esverdeadas com fluorescência. Salmonella sp. Método geral para pesquisa Ágar Verde- Brilhante 35ºC 24 a 48 h Se positivo = colônias grandes com zona vermelha ao redor Caldo digesto pancreático de caseína 30-37ºC 24 a 48 h Adicionar reagente de KOVAC e agitar tubo Salmonella é indol negativo não desenvolve cor vermelha. Ágar Cetrimida Se positivo colônias ficam rósea, marrom passando a vermelho escuro a negro. Agar fluoresceína 30-37 C 24horas Examinar a luz UV 328 e 210nm 99% de P aeruginosa produz fluoresceína Crescimento a 41 C Agar de infusão cérebro e coração 48h 99% das cepas de P aeruginosas crescem a 41 C TSI 30-37ºC 24 h Se positivo = ápice vermelha e base amarela. Com ou sem a gás ou H 2S LIA 30-37ºC 24 h Se positivo = cor púrpura em todo o meio.com ou sem gás ou H 2S Ágar Citrato Simons 30-37ºC 4 dias Se positivo = cresce no meio mudando o ápice para azul Ágar uréia inclinado. 30-37ºC 4 dias Salmonella não produz uréase. Caldo lactose 30-37 C 24h Salmonella não fermenta lactose meio permanece inalterado. 13

Coliformes (E. coli) TSI 30-37 C -24h Se positivo = ápice vermelho,ou amarelo.base amarela, com ou sem formação de gás ou H 2S. Método geral para pesquisa Mac Conkey Mac Conkey 37ºC 24 a 48 h Colônias pretas, esverdeadas e brilhantes Se positivo = colônias vermelho-tijolo. Se o crescimento for heterogênio inocular colônias vermelhas. Agar eosina-cloreto de metiltioninio 30-37ºC 24 h Caldo digesto pancraático de caseína 30-37ºC 48 h Adicionar 0,5ml reagente de KOVAC e agitar tubo Cor vermelha indica presença de indol, E coli produz indol 37ºC 24 h Caldo vermelho de metila Voges-Proskauer 30-37ºC 18-48h Citrato de Simons 30-37ºC 4 dias E. coli não cresce. Agar peptona ferro 30-37 C 24h E. coli não produz gás Adicionar 5gts do indicador vermelho de metila SI por 5ml de cultura. E coli desenvolve cor de vermelha a alajanda INSTALAÇÕES - O laboratório deve estar em área separada dos demais. - As instalações devem ser de materiais lisos, laváveis e sanitizáveis. - Manter piso e bancadas sempre limpas e sanitizadas. - Antes de utilizar a estação de trabalho com fluxo de ar unidirecional sanitizar e deixar ligada por 30 minutos. Definir métodos e procedimentos; Todas as atividades devem estar descritas em POPs; Implantar programa de treinamentos permanentes; Programa de Calibração de instrumentos; Segurança: - Proibido manter alimentos, comer e beber em laboratório; - Vedado acesso de pessoas estranhas e/ou não autorizadas no laboratório; - Obrigatório uso de EPIs: luvas, touca, máscara, manguitos e óculos; - Monitoramento microbiológico do ambiente; - Realizar as análises na estação de trabalho com fluxo de ar unidirecional; - Analista treinado. 14

Equipamentos : - Autoclave: Realizar QI, QO e QP. Periodicamente executar o acompanhamento de performance da autoclave, utilizando indicadores biológicos durante os ciclos de autoclavagem. - Microscópio: utilizado para visualização do Gram. - Estufas: mantê-las limpas, contar com termômetro e registro diário de temperatura. - Geladeira: mantê-la limpa e com termômetro e registro diário de temperatura. -BicodeBunsen:para flambar alça de platina, nos repiques e provas de identificação. - Estação de trabalho com fluxo de ar unidirecional: deve-se realizar a certificação, por empresa especializada. - Contador de colônia: auxilia na contagem de UFC de bactérias e fungos. - Realizar Qualificação de Instalação e Operação em todos equipamentos e sempre que necessário a Qualificação de performance. Reagentes e meios de cultura: Preparar os meios conforme a necessidade do laboratório. - Dissolver os ingredientes do meio, ferver por 1 a 2 minutos conforme recomendação do fabricante. - Esterilizar a 121 C por 15 minutos, conservar sob refrigeração. Sempre etiquetar Meio de Cultura: Lote: Data do Preparo: / / Data esterilização: / / Conservar sob refrigeração (2 8 C). Validade: 2 meses após a data de esterilização. Preparado por: 15

Após esterilização dos meios verificar: - ph - realizar Teste de Fertilidade - Teste de esterilidade. ph: realizar a temperatura ambiente, utilizando para isto um copo de Becker onde será despejado ± 20 ml e verificar o ph com fita indicadora. Registrar o resultado encontrado em ficha e ajustar caso necessário. TESTE DE ESTERILIDADE - Incubar 02 tubos de ensaio ou 01 erlenmayer, contendo o meio de cultura preparado, a 30-35 C, durante 24 horas. Interpretação do resultado: 1- caso neste período cresça alguma contaminação desprezar o lote. Registrar o teste na Ficha de Controle de Esterilidade dos Meios de Cultura, como não esterilizado e abrir RNC para identificar os motivos. 2- se neste período não houver indícios de contaminação microbiana, registrar na Ficha de Controle de Esterilidade dos Meios de Cultura como esterilizado e esta pronto para uso. TESTE DE FERTILIDADE - Inocular uma espécie de bactéria e/ou de fungo, em uma placa ou tubo de ensaio contendo o meio de cultura preparado, incubar na estufa adequada pelo tempo necessário para o crescimento conforme recomendado para cada meio de cultura. - Interpretação do resultado: 1- caso não ocorra crescimento em 24 a 72hs desprezar o lote de meio de cultura e abrir uma RNC para identificar as causas. 2- Havendo crescimento, o meio apresenta capacidade nutritiva, estando portanto liberado para uso. A farmacopéia Brasileira recomenda o uso de cepas bacterianas identificadas e certificadas para: - Avaliar a capacidade seletiva e nutritiva dos meios de cultura; - Na validação do teste de identificação. 16

Cepas: - Diluir o liofilizado, 1ml de soro salino estéril. - Aspirar e colocar em tubo de ensaio contendo 15ml de TSB. - Incubar a 35-37 C por 24-48h. - Alicotar em eppendorf e congelar. - Aplicar 0,2 ml de suspensão bacteriana na superfície de ágar e incubar. - Após crescimento guardar as placas em geladeira, para realizar o teste de fertilidade e controle positivo quando necessário. - Realizar repiques mensalmente até a 5 geração. - Após 5 geração descartar e iniciar com novo eppendorf. CUIDADOS ESPECIAIS: Cepas padrão e materiais contaminados: somente manusear pessoal qualificado, autoclavar todo material que entrou em contato antes de descartar, ou lavar. Não tocar as mãos em superfícies contaminadas, durante análise microbiológica; Evitar conversar em sala ; Evitar tocar a parte externa dos tubos, frascos, com pipetas esterilizadas; Não coçar, tossir ou espirrar, quando estiver fazendo análise microbiológica; Não ficar entrando e saindo toda hora da sala. Metodologia para controle de contaminação microbiana em ambientes de produção O controle da contaminação microbiana em áreas produtivas preconizado pela Boas Práticas de Fabricação somente será obtido com Implantação de um Programa de Limpeza e Sanitização abrangendo os pontos críticos de contaminação. 17

Metodologia para controle de contaminação microbiana em ambientes de produção Sendo eles - As instalações; - Equipamentos e aparelhos; - Funcionários e colaboradores; - Materiais e utensílios de produção; - Produtos utilizados na limpeza e sanitização. Deve-se estabelecer materiais, procedimentos de limpeza e sanitização. Metodologia para controle de contaminação microbiana em ambientes de produção A verificação da eficácia do Programa de Limpeza e Sanitização é realizada através dos monitoramentos realizados em áreas produtivas como: - Controle microbiológico de superfícies; - Controle microbiológico de ambientes; - Contaminação das mãos dos colaboradores; - Contaminação dos uniformes dos colaboradores. Controle microbiológico de superfícies Indicada para análises de superfícies. Deve ser realizado após limpeza e sanitização dos equipamentos e ou locais; Utilizar swabs esterilizados e umedecidos em solução tampão fosfato ph 7,2 ou caldo peptonado,esterilizados. Realizar a coleta no local determinado como ponto crítico de cada equipamento. Controle microbiológico de superfícies Em superfícies planas, coletar em ziguezague em uma área de 25cm 2. Em tubos e mangueiras coletar da circunferência. Após a coleta do material o swab é colocado em um tubo de ensaio contendo solução tampão fosfato a temperatura ambiente por 20 minutos. 18

Controle microbiológico de superfícies Retirar 1ml de tampão fosfato e colocar em placas contendo os meios TSA, SDA,Mac Conkey (E. coli)e Manitol(Staphilococcus). Inverter e colocar as placas em estufa a 30-35 C TSA (4dias) Mac Conkey e Manitol (48horas). SDA colocar em estufa a 20-25 C (7dias). Decorrido o tempo realizar a contagem. Controle microbiológico de superfícies Esta mesma técnica pode ser utilizada para realizara análise das palmas das mãos dos colaboradores, uniformes... Neste caso expressar os resultados em UFC/área palmar. Os resultados são expressos em UFC/25cm 2. Controle microbiológico de superfícies Pode-se utilizar a técnicas de coleta por lavagem de superfície. Padronizar uma quantidade de solução salina a 0,9% (p/v) esterilizada e verter sobre a superfície. Aguardar alguns minutos e recolher a amostra em frasco esterilizado. Transferir 1ml desta amostra para placas contendo os meios de cultura. Inverter as placas e incuba-las. Esta técnica pode ser utilizada para análise de material de embalagem. Controle microbiológico de superfícies. Estabelecer limites de aceitação, alerta e ação. Resultados no limite de alerta abrir RNC (Registro de Não Conformidade) e investigar as causas. Resultados no limite de ação suspender o uso do equipamento, ou local até que as não conformidades sejam detectadas e corrigidas. 19

Controle microbiológico de ambientes A contaminação microbiana em ambientes é proveniente do ar, materiais de embalagem, equipamentos, utensílios, insumos e principalmente dos colaboradores. Todos os cuidados são muito importantes mas fundamental é o treinamento dos colaboradores envolvidos diretamente na produção. Controle microbiológico de ambientes Esta técnica proporciona a determinação quantitativa e qualitativa da microbiota predominante no ar do ambiente. A Técnica consiste na exposição de placas de Petri contendo os meios específicos. Controle microbiológico de ambientes Preparar 5 placas contendo 15ml de meio TSA para contagem e bactérias e 5 para SDA, para fungos. Aguardar a solidificação do meio de cultura. Expor as placas abertas, dispostas lado a lado, (TSA e SDA) de maneira a abranger toda área, por 30 minutos. Fechar as placas e incuba-las TSA 35 C por 5 dias, e SDA a 25 C por 7 dias. Controle microbiológico de ambientes Decorrido o tempo realizar a contagem. Os resultados são expressos em UFC/ 30min. Estabelecer limites de aceitação, alerta e ação para a média das contagens:bactérias +fungos. Identificar por microscopia as colônias suspeitas, se necessário realizar provas bioquímicas e em meios seletivos para identificar e assegurar a ausência de patógenos. 20

Controle microbiológico de ambientes Resultados no limite de alerta abrir RNC e investigar as causas. Resultados no limite de ação suspender o uso da sala até que as não conformidades sejam detectadas e corrigidas. Antes de liberar área realizar nova análise. 21