QBQ0316N: Bioquímica Experimental Farmácia São Paulo, 11 de setembro 2013 Separação e Cromatografia de Proteínas Universidade de São Paulo
QBQ0316N: Bioquímica Experimental Farmácia São Paulo, 11 de setembro 2013 Resumo da aula Separação por interações moleculares Efeito hidrofóbico Cromatografias: Filtração em gel ou exclusão molecular Troca Iônica Líquida de fase reversa Afinidade... Recuperação e Enriquecimento em separações Instituto de Química - Departamento de Bioquímica
QBQ0316N: Bioquímica Experimental Farmácia São Paulo, 11 de setembro 2013 Separação por interações moleculares Proteínas tem diferentes propriedades moleculares que podem ser usadas para separar misturas Propriedades exploradas: Solubilidade ( K ps ) e variação com ph, T, sais Tamanho Carga e variação com ph Hidrofobicidade Instituto de Química - Departamento de Bioquímica
QBQ0316N: Bioquímica Experimental Farmácia São Paulo, 11 de setembro 2013 Efeito hidrofóbico em proteínas Principal determinante da agregação e estabilidade É um balanço de forças fundamentais (van der Waals e eletrostática), responsáveis pela solvatação aquosa Solutos apolares quebram rede de ligações de H. Forma-se jaula de água em torno do soluto. Diminuem as interações favoráveis água água e a entropia Agregação diminui superfície da jaula e, logo, a quantidade de água congelada. A entropia do solvente aumenta e interações fortes água água são em parte restabelecidas. Instituto de Química - Departamento de Bioquímica
QBQ0316N: Bioquímica Experimental Farmácia São Paulo, 11 de setembro 2013 Colunas de cromatografia Suporte sólido fase estacionária Solução aquosa com proteínas fase móvel Instituto de Química - Departamento de Bioquímica
Sistema para FPLC amostra Coluna cromatográfica Detector UV 280nm Coletor de frações
Filtração em Gel ou Cromatografia de Exclusão Molecular Tamanho: 20 kd 100 kd Fluxo de solução tamponante através da coluna abs280 volume
5 µm
fluxo volume
Tipos de resina Sephacryl (dextrana + bis-acrilamida) 50 µm Sepharose (dextrana + epiclorohidrina) 10 120 µm
Cromatografia de Troca Iônica Carga líquida: Aminoácidos possuem cadeias laterais ionizáveis; Proteínas possuem terminais C e N ionizáveis. pi (ponto isoelétrico) = ph no qual o número total de cargas positivas é igual ao número total de cargas negativas. Logo, a proteína não tem carga líquida. Se o ph > pi, a carga líquida da proteína é negativa Se o ph < pi, a carga líquida da proteína é positiva
+ - Fluxo de solução tamponante com ph definido
- + Fluxo de solução tamponante com ph definido volume
Fluxo com solução tamponante contendo NaCl NaCl - Na + Cl - Na + Cl - Na + Cl - Cl - Cl - + Na + Cl - Na + Cl - Na + Cl- Cl - Na + volume
+ pi = 7 pi = 9 ph = 6 +++ F α q1.q2
NaCl +++ volume + +++
Tipos de resina
Cromatografia líquida de fase reversa Polaridade: (Material poroso apolar é a fase estacionária) 1 o. 2 o. Eluição: aumento da % de solvente orgânico na solução eluente Proteína ricas em aminoácidos mais apolares: mais retidas Proteínas ricas em aminoácidos mais polares: menos retidas
QBQ0316N: Bioquímica Experimental Farmácia São Paulo, 11 de setembro 2013 Recuperação em separações Medida de atividade (U) enzimática recuperada: Recuperação > 100% ativação da enzima Recuperação < 100% parte da enzima perdida Condições do meio, outras proteínas, etc podem modular atividade Ex.: Lisado com 0.1 ml com 10 U/mL foi filtrado. Das 25 frações de 0.5 ml obtidas, 2 frações tem 0.8 U/mL Instituto de Química - Departamento de Bioquímica
QBQ0316N: Bioquímica Experimental Farmácia São Paulo, 11 de setembro 2013 Enriquecimento em separações Medida da variação de atividade específica (U/mg): Enriquecimento > 100% pureza Enriquecimento < 100% pureza Diretamente proporcional à pureza da amostra Ex.: Lisado com 0.1 ml com 10 U/mL e [proteina] = 10 mg/ml foi filtrado. Das 25 frações de 0.5 ml obtidas, 2 frações com atividade 1 U/mL e [proteína] = 0.1 mg/ml Instituto de Química - Departamento de Bioquímica