ELABORADO: Luiz Artur

Transcrição

1 1/5 1. NOME DO TESTE Determinação do ácido trans,trans mucônico urinário; determinação AttM em urina. determinação de ttma em urina; 2. APLICAÇÃO CLíNICA O ácido trans, trans mucônico é utilizado como indicador biológico para a exposição ao benzeno. Indicador biológico de exposição pode ser a substância inalterada ou um metabólito (substância química, elemento químico, atividade enzimática ou constituinte do organismo) cuja concentração ou atividade em fluido biológico (sangue, urina), ar exalado ou em tecidos, possui relação com a exposição ambiental a determinado agente tóxico. A substância ou elemento químico determinado pode ser produto de uma biotransformação ou alteração bioquímica precoce decorrente da introdução deste agente tóxico no organismo. Para os agentes químicos preconizados na NR7, é definido o índice biológico máximo permitido (IBMP) como o valor máximo do indicador biológico para o qual se supõe que a maioria das pessoas ocupacionalmente expostas não corre risco de dano à saúde. A ultrapassagem deste valor significa exposição excessiva. O monitoramento biológico da exposição ao benzeno pode ser realizado através de diferentes indicadores, que vão desde aqueles com meia vida biológica curta como o benzeno no ar exalado ou seus metabólitos urinários, até os adutores formados a partir de proteínas do sangue e/ou de moléculas de DNA que podem persistir por meses no organismo humano. O desenvolvimento de metodologias analíticas vem oferecendo a possibilidade de avaliar uma série de indicadores biológicos de exposição. Dentre os mais estudados, podemos destacar os ácidos trans,trans-mucônico e fenil - mercaptúrico urinários, e o benzeno inalterado no ar exalado, na urina e no sangue. 3. PRINCíPIO DO MÉTODO A dosagem do ácido trans, trans-mucônico é realizada pelo método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), também conhecido por High Performace Liquid Cromatography (HPLC), em amostra urinária. Este é um método usado frequentemente em bioquímica e em química analítica para separar, identificar e quantificar diferentes compostos. Para tanto, utiliza-se colunas preenchidas com material específico que funcionarão como fase estacionária (neste caso a coluna será uma RP18 - octadecilsilano) e uma bomba que fará correr uma mistura de solventes (fase móvel) através desta coluna. Desta forma, a depender da polaridade das substâncias em análise e de suas interações com as fases móveis e estacionárias, as mesmas se deslocarão mais rapidamente ou mais lentamente, tendo cada uma seu próprio tempo de retenção (RT), sendo detectadas por um detector UV-VIS (ultravioleta visível) num comprimento de onda específico (no caso deste analito λ = 265 nm). A absorbância do analito gerará um sinal elétrico que será registrado ou por um integrador a papel ou pelo software TotalChrom. Estes sinais serão transcritos em forma de picos cromatográficos, cuja área e altura serão diretamente proporcionais à absorbância e à concentração desse analito. 4. AMOSTRA 4.1 Tipo de amostra: urina de início de jornada de trabalho, de final de jornada de trabalho ou amostra aleatória. 4.2 Armazenagem e estabilidade da amostra: as amostras devem ser coletadas em frascos de polietileno e acondicionadas de 2 o C a 8 o C por 5 dias ou congeladas por 20 dias Critérios para rejeição da amostra: amostras com creatinina urinária inferior a 0,3 g/l.

2 2/5 5. MATERIAIS REQUERIDOS 5.1 Coluna de vidro ou de plástico (tipo extração em fase sólida); 5.2 Lã de vidro para preenchimento das colunas supracitadas; 5.3 Tubo de plástico cônico de 15 ml; 5.4 Tubo de ensaio de 5 ml; 5.5 Pipeta automática de 100 ul a 1000 ul; 5.6 Ponteiras para a pipeta supracitada; 5.7 Pipeta graduada de 10 ml; 5.8 Pêra; 5.9 Béquer de 500 ml; 5.10 Béquer de 1000 ml; 5.11 Kitasato 2000 ml; 5.12 Bomba de sucção à vácuo; 5.13 Kit vítreo para filtração; 5.14 Membrana para filtração de solventes orgânicos e/ou aquosos; 5.15 Ultrassom; 5.16 Balão volumétrico de 1L; 5.17 Balão volumétrico de 250 ml; 5.18 Centrífuga 8 caçapas ou Manifold (aparelho adaptado para acelerar eluições à vácuo). 6. REAGENTES 6.1 Ácido clorídrico (HCl) concentrado; 6.2 Resina de troca iônica Dowex 1X4-200; 6.3 Acetato de sódio triidratado; 6.4 Metanol grau HPLC; 6.5 TRIS (hidroximetil)aminometano; 6.6 Ácido acético glacial; 6.7 Hidróxido de sódio NaOH. 6.8 Ácido fosfórico P.A. 6.9 Cloreto de sódio P.A Padrão do ácido trans,trans -mucônico P.A. 7. PROCEDIMENTO DETALHADO 7.1 Preparação da amostra: Anotar o número da O.S. do paciente em dois tubos cônicos de plástico de 15 ml; Aliquotar 2 ml de urina em um dos tubos cônicos. Ao primeiro tubo cônico, que já contém 2 ml da urina, adicionar 1 ml do tampão TRIS; Preencher as coluninhas - suporte (item 5.1) com aproximadamente 200 mg de resina Dowex. Estas coluninhas deverão ser acopladas ao segundo tubo cônico, já com a O.S. do paciente. Desta forma, as coluninhas ficarão suspensas dentro deste. Ativar a resina nas coluninhas deixando passar pela mesma 2 ml de solução de NaCl 400 g/l e em seguida, lavar esta resina, para retirar o excesso de NaCl, com 1 ml de água ultrapura. Descartar o eluído. A eluição, tanto desta etapa quanto das seguintes, pode ser acelerada levando as coluninhas acopladas aos tudos cônicos, à centrífuga (3000 rpm por 30s) ou utilizando o Manifold (aparelho adaptado para acelerar eluições à vácuo). Eluir, na coluninha com a resina já devidamente ativada: 2 ml do conteúdo do primeiro tubo (2 ml de urina e 1 ml do TRIS); 2 ml de ácido fosfórico 0,2 M. Descartar o eluído; 2 ml de tampão acetato 0,2 M ph 7,0. Descartar o eluído; 2 ml de solução aquosa de metanol 50 %. Descartar o eluído; 2 ml da solução eluente (solução aquosa 1:1 NaCl 1,5 M / metanol HPLC). Não descartar o eluído. A este eluído, adicionar 100 ul de ácido acético glacial concentrado. Se não for injetar no mesmo dia, acondicionar os extratos de 2 o C a 8 o C por até 72h.

3 3/5 Injetar 30uL no cromatógrafo se a injeção for manual. Se o HPLC tiver autosampler, aliquotar 500 ul da suspensão nas vials e colocá-las no suporte para que sejam injetadas de forma automática. OBS: As amostras chegam, na maioria das vezes, em tubos cônicos de 12 ml. Após aliquotar 2 ml da urina para a preparação dos extratos, levar o próprio tubo cônico para o setor de bioquímica afim de realizar a dosagem de creatinina urinária, que por sua vez, será utilizada para a correção dos valores do ácido em questão. 7.2 Preparação da fase móvel: Solução aquosa de acetato de sódio 5 mm: Pesar 0,68 g de acetato de sódio triidratado e dissolver em 1L de água ultrapura. Conservar a temperatura ambiente por 5 dias. Aliquotar 280 ml de metanol grau HPLC e adicionar a este 10 ml de ácido acético glacial, avolumar para 1L com solução aquosa de acetato de sódio 5 mm e conservar a temperatura ambiente por 5 dias. Filtrar em membrana para soluções aquosas de 0,2 um de porosidade e levar ao ultrassom por 15 min. Se o HPLC tiver um degaseificador à vácuo, não é necessário levar a fase móvel ao ultrassom. 7.3 Preparação dos padrões: Solução estoque do ácido trans, trans - mucônico 1,0 g/l: Pesar 0,1 g de ácido t,t - mucônico e dissolvê-lo com 20 ml metanol grau HPLC; em seguida adicionar 20 ml de acetonitrila e avolumar para 100 ml com água ultrpura. Conservar a solução de 2 o C a 8 o C por 6 meses; Solução intermediária do ácido trans, trans mucônico 100 mg/l: Aliquotar 1,0 ml da solução estoque, avolumar para 10 ml com água ultrapura e acondicioná-la de 2 o C a 8 o C por 6 meses; Solução trabalho do ácido trans, trans - mucônico 0,5; 1,0 e 2,0 mg/l: Aliquotar respectivamente 50; 100 e 200 ul da solução intermediária e transferir para um balão volumétrico de 10 ml, avolumar com água ultrapura ou urina previamente testada e acondicioná-la de 2 o C a 8 o C por 1 mês; 7.4 Preparo das soluções: Solução de ácido fosfórico 0,2 mmolar: Aliquotar 3,37 ml de ácido fosfórico concentrado e diluir em 100 ml de água UP. Avolumar para 250 ml com mesmo solvente e conservar a temperatura ambiente por 2 meses. Solução TRIS 0,5 molar: Dissolver 30,25 g do composto Tris(hidroximetil)-aminometano em 200 ml de água ultrapura, avolumar para 500 ml com mesmo solvente e conservar a temperatura ambiente por 2 meses. Solução eluente 1:1 (NaCl (aq) 1,5 molar / metanol HPLC): Pesar 13,68 g de NaCl e dissolver em água ultrapura. Em seguida, avolumar para 250 ml com mesmo solvente. Misturar a essa solução igual volume de metanol HPLC. Conservar a temperatura ambiente por 2 meses. Solução de ácido clorídrico 0,2 molar: Aliquotar 1,70 ml de HCl concentrado em balão volumétrico de 100 ml, avolumar com água ultrapura e conservar a temperatura ambiente por 2 meses. Solução NaOH 5 molar: Pesar 20 gramas de NaOH e dissolver em 50 ml de água ultrapura. Avolumar para 100 ml com mesmo solvente e conservar a temperatura ambiente por 2 meses. Solução - tampão TRIS 0,125 molar ph 10: Misturar 50 ml da solução TRIS 0,5 molar com 5 ml de HCl 0,2 molar. Ajustar o ph para 10, se necessário, com solução de NaOH 0,5 molar; em seguida, avolumar para 200 ml com água ultrapura e conservar a temperatura ambiente por 2 meses. Solução tampão acetato ph 7: Diluir 2,31 ml de ácido acético glacial e avolumar para 200 ml com água ultra-pura. Em seguida, dissolver 3,28 g de acetato de sódio anidro ou 5,44 g de acetato de sódio triidratado em água ultrapura, avolumando para 200 ml com mesmo solvente. Ambas as soluções serão 0,2 molar em íon acetato. Misturar 4,8 ml da solução do ácido acético com 45,2

4 4/5 ml da solução de acetato de sódio e ajustar o ph para 7 com solução de NaOH 5 molar, avolumar para 100 ml com água ultrapura e conservar a temperatura ambiente por 2 meses. Solução de metanol 50%: Misturar igual volume de metanol HPLC e água ultra-pura e conservar a temperatura ambiente por 2 meses. Solução de NaCl 400 g/l: Dissolver 400 g de cloreto de sódio (NaCl) em 900 ml de água ultrapura. Avolumar para 1000 ml com mesmo solvente e conservar a temperatura ambiente por 2 meses. 7.5 Condições cromatográficas: Fluxo: 1,2 ml/min; λ = 265 nm; 8. CÁLCULOS E LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS Os resultados deverão ser expressos em mg/g de creatinina urinária. Portanto, deve-se dividir o resultado do paciente, obtido do cromatógrafo (expresso em mg/l), pela sua respectiva creatinina urinária (expressa em g/l); Ex: Resultado do ácido trans, trans - mucônico no cromatógrafo = 0,40 mg/l; Resultado da creatinina urinária = 2,0 g/l; Resultado do ácido trans, trans - mucônico corrigido = 0,20 mg/g creatinina. Se durante a análise do ácido t,t-mucônico observar-se que seu nível está indetectável, deverá ser digitado o valor de 0,10 mg/l. Os valores de creatinina urinária abaixo de 0,3 g/l devem ser repetidos; caso persistam, devem ser rejeitados e solicitada nova amostra. 9. CONTROLE DE QUALIDADE No início de cada corrida analítica, deve-se passar um dos padrões usados na calibração e este deverá ter uma variação máxima de 15% para mais ou para menos. Caso isto não ocorra, uma nova calibração deverá ocorrer. Os resultados dos controles utilizados nas corridas cromatográficas ficarão registrados em arquivos eletrônicos na pasta denominada RESULTADOS 20XX (ano da análise). 10. VALOR DE REFERÊNCIA E IBMP (ÍNDICE BIOLÓGICO MÁXIMO PERMITIDO). Referência: até 0,5 mg/g creatinina; IBMP (Índice Biológico Máximo Permitido): 1,4 mg/g creatinina. 11. CONFIABILIDADE ANALÍTICA A análise do ácido trans, trans - mucônico por HPLC possui alta especificidade uma vez que, utiliza como principais parâmetros de calibração, os tempos de retenção associados a um sinal gerado num comprimento de onda, que é específico para cada analito, numa determinada condição cromatográfica. Além disso, possui alta sensibilidade, pelo recurso de diminuição da atenuação do sinal do detector e ajuste do ruído da corrida cromatográfica, o que facilita a visualização dos picos e a consequente quantificação dos analitos por eles representados. 12. INTERFERENTES O ácido trans, trans mucônico urinário é um indicador sensível, mas de especificidade média. A sua concentração é influenciada pelo hábito de fumar, quando ocorre exposição simultânea ao tolueno ou pela ingestão de ácido sórbico e seus sais presentes na alimentação. Nesta situação, sugere-se a coleta de urina muitas horas após a última refeição o que permitiria ignorar um possível efeito aditivo decorrente da ingestão do ácido sórbico. Há suspeitas que hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) também interferem nesta avaliação.

5 5/5 13. REFERÊNCIAS ANDREWS, Larry S.; SNYDER, Robert. Toxic Effects of Solvents and Vapors. In: ANDUR, Mary O. et al (org.) Casarett and Doull s Toxicology: The Basic Science of Poisons. 4. Ed. São Paulo, SP: Pergamon p BRASIL. Norma Regulamentadora. Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional. Disponível em: Acesso em 23 set HISTÓRICO DE REVISÕES Pg. NATUREZA DA ALTERAÇÃO DATA REVISÃO VERSÃO RESPONSÁVEL 4 Controle de Qualidade 25/07/ Controle de Qualidade 28/02/ Preparação da Amostra 4 3 Preparação das Soluções 4 4 Cálculo e Liberação dos Resultados 4