SENSIBILIDADE DA PCR DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA BOVINO DILUÍDO*

SENSIBILIDADE DA PCR DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA BOVINO DILUÍDO* IURY RODRIGUES DE ALMEIDA, LILIAN DE S. TEODORO, JOÃO ANTONIO X. MANSO, ALEX S. DA CRUZ, LYSA BERNARDES MINASI, CLAUDIO CARLOS DA SILVA, APARECIDO D. DA CRUZ* Resumo: A PCR consiste na imitação in vitro do processo de duplicação do DNA, cujo objetivo deste foi de definir o limite da sensibilidade da PCR de amplificar moléculas de DNA bovino diluído seriadamente. Foi extraído e diluído DNA bovino e submetido a PCR e eletroforese. A sensibilidade de amplificação em macho foi em 4x10-12 e nas fêmeas em 8x10-13. Palavras-chave: Diluição seriada. Extração. Quantificação. D e acordo com o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, o Brasil em 2013, tinha uma estimativa de 211 milhões de cabeças de gado, sendo o segundo maior rebanho do mundo, ficando atrás apenas da Índia. Manejos estressantes de bovinos tem provocado alterações no comportamento deste animais (GRANDIN, 2006). A colheita de sangue é uma prática pouco estressante, comparada a outros manejos como inseminação artificial, ultrassonografia, transferência de embriões (VOISINET, 1997) a qual pode provocar aos animais alterações no temperamento, resultando em percas produtivas (CRUZ et al., 2010). A implementação de um processo metodológico simples e com alta precisão para extração e quantificação de DNA em bovinos é importante para a otimização de programas de manejo reprodutivo (CARVALHAIS et al., 2005). Há vários protocolos para extração de DNA, sendo alguns mais complexos e outros mais simples, Fungaro (2000) afirma que para fins de amplificação não é necessário utilizar metodologias de extração de DNA muito complexas, pois essa técnica não necessita de uma grande quantidade de amostra de DNA e nem de uma alta pureza. O crescimento gradual do conhecimento da complexidade da molécula de DNA e a grande exigência de metodologias de diagnóstico cada vez mais rápidos, viáveis e específicos, conduziram ao desenvolvimento de diversas 55

técnicas de quantificação do DNA ao longo dos últimos 50 anos (MACKAY et al., 2007). Uma das formas de utilização do DNA extraído de fontes celulares é a Reação de Polimerização em Cadeia (PCR), que consiste na imitação, in vitro, do processo de duplicação do DNA (BAREA, 2004). Esta técnica foi desenvolvida por Kary Mullis nos anos 80, que a propiciou o prêmio Nobel em 1994, sendo que a criação desta trouxe enormes benefícios e desenvolvimento científico (NOVAIS, 2004). A PCR é uma técnica fundamental nos laboratórios atuais, que revolucionou a detecção de RNA e DNA. Na atualidade, uma nova técnica designada PCR em tempo real, evoluiu da PCR convencional, com o objetivo de minimizar as suas numerosas limitações (OLIVEIRA, 2010). Para a realização da técnica de PCR é necessário o DNA molde e uma mistura de reagentes, denominada de Master Mix. Esta mistura tem como componentes essenciais a enzima DNA polimerase, iniciadores da reação (primers), desoxirribonucleótidos trifosfatados (dntp s), tampão, catião bivalente Mg 2+ e catião monovalente K + (KCl) (CHEN; JANES, 2002; PELT-VERKUI et al., 2008). O sucesso da amplificação de DNA pela técnica da PCR convencional está dependente de diversos fatores (OLIVEIRA, 2010) que podem influenciar a técnica de PCR dizem respeito à pureza, à qualidade e à quantidade do DNA alvo, pureza dos nucleotídeos e a concentração da solução de Desoxirribonucleótideos trifosfatados (dntp`s), visto que concentrações desiguais de dntp`s podem provocar uma redução na fidelidade da DNA polimerase (OLIVEIRA, 2010; MIGUEL, 2007). O objetivo de estudo foi de definir o ponto máximo da sensibilidade da PCR de amplificação de DNA bovino diluído seriadamente. MATERIAL E MÉTODOS 56 Foram obtidas amostras de sangue bovino da raça Jersey, sendo uma de macho e a outra de uma fêmea. Estes animais pertenciam até o momento da coleta ao Departamento de Zootecnia da Pontifícia Universidade Católica de Goiás. A coleta de sangue total foi realizada por punção caudal contendo heparina. As amostras foram centrifugadas (1000rpm/10min), separando o plasma do componente celular. Seguindo as instruções do fabricante, o DNA total foi isolado e purificado utilizando o kit comercial Ilustra Blood GenomicPrep Mini Spin (GE Helthcare, UK). A quantificação do DNA foi realizada pelo espectrofotómetro NanoVue PlusTM (GE Helthcare, USA) conforme metodologia do fabricante. Depois de realizado a extração e quantificação das amostras de DNA, estas foram diluídas para uma concentração inicial de 40ng/µL de DNA, utilizadas como amostra mãe (AM) para amplificação por PCR. As AMs foram diluídas em uma série de quatro vezes (amostras de 1 a 4), partindo de um fator de diluição igual a 1000 e depois dois passos de diluição com um fator de 100 (amostras 5 e 6), conforme descrito por da Cruz e colaboradores (2012). Ao fim do processo de diluição seriada, obteve uma proporção de uma parte do DNA extraído para 4x10 16 partes de DNA/ água mili-q. Adicionalmente a este passo, entre as amostras 5 e 6, foram diluídas em 25, 50 e 75 µl de água. Para a realização da PCR, foram utilizados 10µL da solução de cada amostra, sendo que a quantidade total de DNA inicial no sistema de amplificação foi de 400ng de

DNA. Todo procedimento foi realizado em duplicata, assim a PCR foi preparada para um volume final de 25µL. Além dos 10µL de solução aquosa contendo DNA bovino, as condições de PCR incluíram 0,15 pmoles de cada conjunto de primers, 5µL de tampão de PCR Gold STR (Promega Corporation, USA), 1µL de cloreto de magnésio e 0,5µL de Taq DNA Polimerase (5U/µL). Como solução controle, utilizou 10µL de água mili-q e as mesmas proporções de primers, tampão, cloreto de magnésio e Taq. O protocolo de termociclagem ultizado continha um passo inicial de desnaturação a 94 C por 5min, 40 ciclos de a 94 C por 1min de desnaturação, anelamento a 58 C por 30seg e extenção a 72 C por e 72 C por 7min de extenção final. Um conjunto de primers descrito por Resende et al. (2008) foi usado para amplificação do DNA bovino, sendo que nas amostras da fêmea utilizou-se um conjunto preparado para identificar uma sequência autossômica de 280pb localizada no cromossomo 1, e nas amostras do macho além deste, usou um conjunto desenhado para detectar uma sequência de 210pb localizado no cromossomo Y. O produto da PCR foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose (1,5g/100ml de tampão 1x) em uma cuba horizontal, a 120v e 150mA por uma hora e vinte minutos. O gel foi documentado na Molecular Imager Gel Doc XR (Bio Rad). A amostra 5 (macho e fêmea) foram diluídas em três passos, com um fator de diluição de 25, 50 e 75. Realizou-se uma PCR e eletroforese com a mesma metodologia já descrita. Este passo foi necessário para a verificação do limite de detecção da PCR. RESULTADO E DISCUSSÃO Após a extração do DNA, as amostras foram quantificadas pelo espectrofotómetro NanoVue PlusTM (GE Helthcare, USA) conforme metodologia do fabricante. Os valores foram de 65 e 220 para macho e fêmea. Estas amostras foram ajustadas para uma concentração inicial de 40ng/ µl. A partir destas amostras, foram promovidas uma série de 4 diluições com fator 1000 e subsequente 2 com fator 100. A figura 1 esquematiza a metodologia de diluição seriada utilizada neste estudo, proposta por da Cruz e colaboradores (2011). Figura 1. Representação da diluição seriada utilizado no estudo. Nota: Adaptado de da Cruz, et al. A= modificação proposta pelos autores desta pesquisa. 57

Após a diluição das amostras de DNA bovinos, estas foram quantificada e a tabela 1, demonstra os valores pós quantificação do DNA bovino em diluição seriada. Tabela 1: Quantificação e diluição de DNA isolado de sangue de bovinos. Amostras Diluição DNA / água Quantidade de DNA AM XXX a (40ng DNA) 400ng 1 1x10-3 0,4 2 1x10-6 4x10-4 b 3 1x10-9 4x10-7 b Macho 4 1x10-12 4x10-9 b 5 1x10-14 4x10-12 b 5/ 25µL 1x10-14,25 1,6x10-13 b 5/ 50µL 1x10-14,50 8x10-13 b 5/ 75µL 1x10-14,75 5,3x10-14 b 6 1x10-15 4x10-14 b AM XXX a (40ng DNA) 400ng 1 1x10-3 0,4 2 1x10-6 4x10-4 b 3 1x10-9 4x10-7 b Fêmea 4 1x10-12 4x10-9 b 5 1x10-14 4x10-12 b 5/ 25µL 1x10-14,25 1,6x10-13 b 5/ 50µL 1x10-14,50 8x10-13 b 5/ 75µL 1x10-14,75 5,3x10-14 b 6 1x10-15 4x10-14 b 58 Legenda: a = Valor ajustado para 40 ng de DNA; b = Estimado Matematicamente. Nesta pesquisa a amplificação por PCR das amostras 1 a 6 em macho e fêmea comportou-se de forma semelhante ao apresentado por da Cruz e colaboradores (2011) onde os valores limites de amplificação foi de 4x10-12, amostra 5, para macho e fêmea da região autossômica e 4x10-4 (amostra 2 em macho) para a y-específica (Figura 2 A= Macho e B= Fêmea). Entretanto, a modificação sugerida pelos autores deste estudo possuía o objetivo de verificar o limite de amplificação das amostras diluídas entre as amostras 5 e 6. Não houve amplificação das amostras. O resultado da amplificação foi observado assim, foi possível inferir que a sensibilidade de amplificação da região autossômica de bovinos ocorre até a concentração de 4x10-12 de DNA por amostra, 5/ 25µL, 5/ 50µL e 5/ 75µL em Macho, entretanto para amostras de fêmeas foram observadas amplificações para as diluições 5/ 25µL e 5/ 50µL, representada na Figura 2.

Figura 2: Amplificações Nota: Amplificações das amostras em diluição seriada de sangue bovino fêmea (A) e macho (B). Em C amplificação das amostras de fêmea com fatores de diluição entre 5 a 6. Como isso foi possível estabelecer o limite de detecção para amostras de fêmea diluídas seriadamente em 8x10-13 ng de DNA a um fator de diluição de 1x10-14,50 DNA/ Água. Até a presente data, os autores deste estudo, discutem a não amplificação das amostras de macho, nas diluições de, 5/ 25µL, 5/ 50µL e 5/ 75µL devido às condições de PCR e a relação existente entre a quantidade de amplicons/ primers e o funcionamento da enzima taq DNA polimerase. Os resultados apresentados neste estudo, mostram que a amplificação acontece em concentrações de diluições diferente entre amostras de DNA bovino de macho e de fêmea, sendo estes fatores de 4x10-14 e 4x10-14,5 respectivamente. Observa-se que com pouco material genético bovino é possível realizar a PCR, que é uma metodologia simples e com precisão para obter inúmeros resultados, evitando práticas mais complexas de grande impacto ao animal. Entende-se que este estudo possa ser melhorado no quesito de encontrar um fator de diluição maior do que o apresentado, mostrando assim quão sensível é esta metodologia e descobrir o motivo das amostras do macho não apresentarem o mesmo fator de diluição da fêmea. A PCR em tempo Real é uma nova metodologia de amplificação, onde os autores deste acreditam que possa ser mais sensível que esta metodologia aqui testada, sendo uma porta aberta para estudos futuros. SENSITIVITY OF PCR DNA AMPLIFICATION BOVINE DILUTED Abstract: the PCR consists in the imitation in vitro of DNA replication process, whose objective was to define the limit of sensitivity of the PCR to amplify DNA molecules diluted serially. It was extracted and diluted bovine DNA and submitted to PCR and electrophoresis. Amplification sensitivity in male was in 4 x 10-12 and in females in 8 x 10-13. Keywords: Serial dilution, extraction and Quantification. Referencias BAREA, J. A.; PARDINI, M. I.; GUSHIKEN, T. Extração de DNA de materiais de arquivo e fontes escassas para utilização em reação de polimerização em cadeia (PCR). 59

60 Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 26, n. 4, p. 274-284, 2004. CARVALHAIS, I.; PIMENTA, J.; MARQUES, C. C. Implementação de um método simples e preciso para sexagem de embriões bovinos. Cienc. Vet., v. 3, p. 121-124, 2005. CHEN, B.Y.; JANES, H. W. PCR cloning protocols. Humana Press. Segunda Edição, p. 192-439, 2002. CRUZ, A. S. et al. Eficiência de amplificação do DNA isolado no sangue bovino. Revista Estudos, v. 37, n. 9-10, p. 713-723, 2010. CRUZ, A. S. et al. Sensibilidade da PCR na amplificação do DNA bovino em diluição seriada e mistura de amostra macho e fêmea. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v. 63, n. 4, p. 1012-1015, 2011. FUNGARO, M. H. P. PCR na micologia. Revista Biotecnologia Ciências e Desenvolvimento, ano III, n. 14, p. 12-16, 2000. GRANDIN, T. B. International Journal for the Study of Animal Problems, 2006 Disponível em: <http://www.grandin.com>. Acesso em: 10 out. 2014. MACKAY, I. M.; SLOOTS, T. P. Real-Time PCR in Microbiology, From Diagnosis to Characterization. Caister Academic PressNorfolk, UK, 2007. MIGUEL, A. Aplicação da técnica de PCR na pesquisa de bactérias patogénicas embiofilmes de condutas e reservatórios de água do sistema de distribuição da EPAL. Tese (Mestrado) - Instituto Superior Técnico de Lisboa. Lisboa, 2007. NOVAIS, C. M. PCR em tempo real. Revista Biotecnologia Ciências e Desenvolvimento. Ano VII, n. 33, 2004. OLIVEIRA, T. M. S. PCR em tempo real: Métodos e aplicações. Tese (Mestrado) - Universidade de Aveiro. Aveiro, 2010. RESENDE, M. V.; MOREIRA-FILHO, C. A.; LEAL, C. L. V. Falha na sexagem por inibição do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro com anticorpos anti H-Y. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v. 60, p. 594-599, 2008. VERKUIL, E. P. Principles and technical aspects of PCR amplification. Springer, p. 332, 2008. VOISINET, B. D. Cattle with calm temperaments have higher average daily gains the cattle with excitable temperaments. Journal of Animal Science, v. 75, p. 892-896, 1997. USDA. United State Department of Agriculture. Pesquisa Pecuária Mundial, 2013. Disponível em: <http://www.usdabrazil.org.br>. Acesso em: 10 out. 2014. * Recebido em: 15.11.2014. Aprovado em: 22.11.2014. IURY RODRIGUES DE ALMEIDA Graduado em Biologia pela Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC Goiás). Núcleo de Pesquisa REPLICON, PUC Goiás. E-mail: iury-rda@hotmail.com. LILIAN DE SOUZA TEODORO Graduado em Biologia pela PUC Goiás. Núcleo de Pesquisa Replicon, PUC Goiás. E-mail: lsteodoro@hotmail.com.

JOÃO ANTONIO XAVIER MANSO Mestrando do programa MGene e Núcleo de Pesquisa Replicon, PUC Goiás. ALEX SILVA DA CRUZ Bacharel em Zootecnia pela PUC Goiás. Mestre em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal de Goiás (UFG). Doutorando em Biologia pela UFG. LYSA BERNARDES MINASI Núcleo de Pesquisa Replicon, PUC Goiás. E-mail: minasilb@gmail.com. CLÀUDIO CARLOS DA SILVA Núcleo de Pesquisa Replicon, PUC Goiás. LaGene Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular, SES GO. E-mail: dasilva.genetica@gmail.com. APARECIDO DIVINO DA CRUZ Núcleo de Pesquisa Replicon, PUC Goiás. LaGene Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular, SES GO. E-mail: acruz@pucgoias.edu.br. 61