ESTUDOS DOS GRUPOS MICROBIANOS NO SISTEMA DE MANEJO AGRÍCOLA EM TERRAS ALTAS PELA TÉCNICA DE ELECTROFORESE EM GEL DE GRADIENTE DESNATURANTE

Transcrição

1 ESTUDOS DOS GRUPOS MICROBIANOS NO SISTEMA DE MANEJO AGRÍCOLA EM TERRAS ALTAS PELA TÉCNICA DE ELECTROFORESE EM GEL DE GRADIENTE DESNATURANTE Alana de Almeida Valadares 1 ; Waldesse Piragé de Oliveira Júnior 2 1 Aluna do Curso de Engenharia Ambiental; Campus de Palmas; alanavaladares@hotmail.com - PIBIC/CNPq 2 Orientador do Curso de Engenharia Ambiental; Campus de Palmas; waldessejunior@uft.edu.br RESUMO Grande parte dos processos que ocorrem no solo são reações mediadas por microrganismos presentes nele. A biomassa microbiana do solo é um componente crítico de todos os ecossistemas naturais ou manipulados pelo homem. Muitos são os benefícios científicos esperados de um maior conhecimento sobre a diversidade microbiana dos solos. Porém ainda são poucas as informações detalhadas sobre o efeito de manejos de solos de Cerrado que caracterizem a função específica da biota no desenvolvimento de sua fertilidade sustentável. Neste trabalho objetivou-se traçar o perfil da comunidade fúngica do solo com agricultura tecnificada e de cerrado nativo. As análises moleculares foram feitas através técnica de PCR-ARISA com os primers 3126Tr e 2234Cf-FAM, onde foi utilizado o DNA total extraído do solo. Com base na análise dos dados obtidos foi constatado houve diferenciação na estrutura da comunidade de microfungo do solo submetido a cultura de soja e do solo de cerrado nativo. Palavras-chave: Comunidade fúngica; Cerrado; Agricultura; ARISA INTRODUÇÃO Considerando que 80-90% dos processos que ocorrem no solo são reações mediadas por microrganismos (NANNIPIERI et al., 2003), a biomassa microbiana do solo torna-se um componente crítico de todos os ecossistemas naturais ou manipulados pelo homem. Os benefícios científicos esperados de um maior conhecimento sobre a diversidade microbiana são extensos (COLWELL, 1997; HUNTER, 1998), como a melhor compreensão das funções exercidas pelas comunidades microbianas nos ambientes e o conhecimento das suas interações com outros componentes da biodiversidade. Os benefícios econômicos e estratégicos estão relacionados com a descoberta de microrganismos potencialmente exploráveis nos processos biotecnológicos.

2 A partir de um manejo deficiente do solo, a erosão pode ser alta: em plantios convencionais de soja, a perda da camada superficial do solo é, em média, de 25 ton/ha-¹/ano, embora práticas de conservação, como o plantio direto, possam reduzir a erosão a 3 ton/ha-¹/ano (RODRIGUES, 2002). São poucas as informações detalhadas sobre o efeito de manejos de solos e ecossistemas aquáticos vizinhos de Cerrado que caracterizem a função específica da biota destes solos no desenvolvimento de sua fertilidade sustentável. Acredita-se que a diversidade de organismos em um ecossistema seja responsável por sua estabilidade e resiliência. Os microrganismos do solo assumem papel importante para essa sustentabilidade, visto que são responsáveis por atividades essenciais para o bom funcionamento dos ecossistemas. Dessa forma, avaliar o impacto de mudanças no ambiente do solo sobre populações e comunidades de microrganismos torna-se importante não só para o seu manejo, mas também para o delineamento de práticas que favoreçam a funcionalidade dos agroecossistemas e a produtividade agrícola sustentável (NAVARRETE, 2009). A Análise Automatizada do Espaço Intergênico Ribossomal ARISA (do inglês, Automated Ribossobal Intergenic Spacer Analysis) é um método independente de cultivo que foi desenvolvido por Fisher e Tripplet (1999), que afirmam que esta é uma técnica rápida e efetiva para analisar comunidades. Esta técnica distingue as populações microbianas com base na heterogeneidade do comprimento do espaço intergênico ribossomal, permitindo assim a análise sensível das comunidades com um nível de relatividade elevado da resolução taxonômica e reprodutibilidade (FISHER E TRIPPLET, 1999). MATERIAL E MÉTODOS As amostras de solo foram coletadas na Fazenda Barreiro Branco, município de Paraíso do Tocantins/TO, onde acontece cultivo de soja. As coletas das amostras foram realizadas na área de agricultura e no cerrado nativo, levando-se em consideração os pontos cardeais norte, sul, leste, oeste e ponto central, distantes 100 metros um do outro. A coleta foi feita a 10 cm de profundidade, utilizando-se tubos de PVC de 15 cm de comprimento e 5 cm de diâmetro esterilizados. As amostras foram armazenados em ultra-freezer a -80 C. Para extração do DNA total do solo utilizou-se o Kit Power Soil DNA Extraction TM (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) seguindo as orientações do fabricante. Com o DNA extraído realizou-se a eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) corada com brometo de etídeo em tampão TBE e em seguida o DNA foi quantificado em espectrofotômetro tipo Nanodrop.

3 As reações de PCR ARISA foram preparadas para o volume final de 25 µl, utilizando 2,5 µl de Tampão para PCR 10X, 1,5 µl de MgCl 2 50 mm, 0,5 µl dntp s 10 mm, 1,0 µl de primer 2234Cf-FAM (5 -GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3 ) 5 pmoles/µl, 1,0 µl de primer 3126Tr (5 - ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3 ) 5 pmoles/µl (Sequerra at al., 1997), 1,0 µl de DNA 10 ng, 0,2 µl de Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen) 5 U/µL e 17,3 µl de água estéril. As reações foram realizadas em termociclador (modelo GeneAmp System 9700, Applied Biosystems), sendo 1 ciclo de 94 C por 3 minutos (pré-desnaturação), 35 ciclos de 94 C por 30 segundos (desnaturação), 59 C por 45 segundos (anelamento), 72 C por 1 minuto (extensão) e 1 ciclo de 72 C por 15 minutos (extensão final). Corrida eletroforética em gel de agarose 1% a 90 V por 1 hora, com tampão TSB. Os produtos da PCR-ARISA foram purificados utilizando o kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare), seguindo as instruções do fabricante. A ARISA foi feita em um sequenciador ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Para seu carregamento foi utilizado 1 µl do produto de PCR purificado, 8,8 µl de formamida HiDi e 0,2 µl de um padrão de comprimento GeneScan TM 500 ROX (Applied Biosystems). As amostras foram desnaturadas a 94 C por 5 minutos, resfriadas a 0 C por 3 minutos, e carregadas no sequenciador. Para a verificação do comprimento dos fragmentos entre a região 18S e 28S, utilizou-se o programa PeakScanner versão 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram consideradas nas análises estatísticas subsequentes apenas os tamanhos do espaço intergênico de 50 a 800 pb. O tamanho de cada pico foi apresentado por um percentual de unidade de florescência relativo a cada amostra. As análises de similaridade ANOSIM foram feitas com o programa Primer 5 (Plymouth Marine Laboratory, Primer-E, Reino Unido). RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram feitas duas coletas, uma em dezembro de 2012, no período pós-plantio da cultura e a outra em fevereiro de 2013, que corresponde ao meio do cultivo da soja. A Tabela abaixo representa as datas e quantidade de amostras. Tabela 1 - Local, período e número de amostras. Local Data Número de Amostras Área Controle Dezembro Fevereiro Área de Soja Dezembro Fevereiro

4 O perfil eletroforético (Figura 1) representa os DNAs extraídos, indicando que a extração foi bem sucedida e que os mesmos estão de boa qualidade. na Tabela 2. Figura 1 - Perfil eletroforético do DNA total extraído do solo. Os valores obtidos a partir quantificação das amostras de DNA extraídos do solo foram listados Tabela 2 - Quantificação das amostras de DNA Amostra Concentração Relação Concentração Relação Amostra ƞg/µl 260/280 ƞg/µl 260/ ,3 1, ,3 1,8 2 14,1 1, ,9 1, ,8 1, ,3 1, ,6 1, ,9 1, ,7 1, ,5 1,81 6 6,2 1, ,0 1, ,1 1, ,0 1, ,4 1, ,4 1, ,9 1, ,8 1, ,8 1, ,2 1,52 Comparando a foto do gel da eletroforese com a quantificação, observa-se coerência entre os resultados. Tal fato pode ser percebido claramente nas amostras 12 e 19, que se apresentam como as bandas mais fortes na foto e suas concentrações são 28,9 e 18,8, respectivamente, os maiores valores concentração obtidos. Os produtos da PCR ARISA foram analisados, quanto a sua qualidade, em eletroforese em gel de agarose, apresentando-se de boa qualidade (Figura 2). Figura 2 - Produtos da ARISA.

5 Utilizando o programa PeakScanner versão 1.0 (Applied Biosystems) obteve-se eletroferogramas (Figura 3), que apresentam a quantidade de picos presentes nas amostras. Figura 3 - Eletroferogramas. Com base na Análise de Similaridade (ANOSIM) foi constatado que as estruturas das comunidades de microfungos do solo diferiram entre as áreas de agricultura e de cerrado nativo. LITERATURA CITADA COLWELL, R. Microbial diversity: the importance of exploration and conservation. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 18:5, FISHER, M.M; TRIPLETT, E.W.; Automated approach for ribosomal intergenic spacer analysis of microbial diversity and its application to freshwater bacterial communities. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 65, p , HUNTER, C. The value of microbial diversity. Current Opinion in Microbiology, 1: NANNIPIERI, P.; ASCHER, J.; CECCHERINI, M.T.; LANDI, L.; PIETRAMELLARA, G. E RENELLA,G. Microbial Diversity and Soil Functions. European Journal of Soil Science. 54: , NAVARRETI, A.P. Estrutura e diversidade da comunidade microbiana em solos sob diferentes sistemas de uso da terra na Amazônia Ocidental. Dissertação (Mestrado). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Centro de Energia Nuclear na Agricultura. 119p, RODRIGUES, M.T. Vertebrate fauna of estação ecológica serra geral do Tocantins: biodiversity and conservation in the Brazilian Cerrado hotspot. Biota Neotrop. 11(1): SEQUERRA, J.; MARMEISSE, R.; VALLA, G.; NORMAND, P.; CAPELLANO, A.; MOIROUD, A. Toxonomic position and intraspecific variability of the nodule forming Penicillium nodositatum inferred from RFLP analysis of the ribosomal intergenic spacer and random amplified polymorphic DNA. Mycologinal Resarch, New York, v. 101, p , AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil"