Universidade Estadual de Londrina Departamento de Biologia Geral Laboratório de Citogenética Animal - LACA Hibridação in situ por fluorescência FISH O protocolo descrito a seguir foi baseado nos procedimentos adotados por Pinkel et al. 1986, com modificações. 1) Preparações de lâminas Desidratar em série de etanol 70% e 100%, 5 minutos cada e logo após secar ao ar. 2) Tratamento com RNAse 1. Colocar 90 µl de RNAse uso (O,4% RNAse/2xSSC) em cada lâmina, cobrir com uma lamínula plástica e incubar a 37 C por uma hora em câmara úmida. (*Já colocar a formamida 70% para aquecer a 70 C). RNAse uso: 0,4 µl de RNAse estoque (10mg/mL) x nº de lâminas = - 100 µl de 2xSSC x nº de lâminas = 2. Lavar as lâminas em 2xSSC por 10 minutos a temperatura ambiente no agitador (depois de 1-2 minutos retirar as lamínulas que estarão boiando) 3. Lavar as lâminas em paraformaldeído 4% a temperatura ambiente, por 10 minutos no agitador. Paraformaldeído 4% - NA CAPELA: 4g de paraformaldeído despolimerizado em 98 ml de água destilada a 60 C no agitador. Acrescentar 2mL de NaOH 1 M 4. Descartar o paraformaldeído no vidro de descarte apropriado e colocar novamente 2xSSC, por 10 minutos, no agitador. 5. Descartar o 2xSSC e colocar 1xPBS, por 5 minutos, no agitador. 6. Descartar o 1xPBS e colocar álcool etílico 70% por 5 minutos, no agitador. 7. Descartar o álcool 70% e colocar o álcool 100% por 5 minutos, não precisa agitar. 8. Descartar o álcool 100% e deixar as lâminas secando a temperatura ambiente por no mínimo 30 min ou no máximo 3 horas ( Enquanto isso, preparar o mix de hibridação e deixá-lo a temperatura ambiente ou 37 C para dissolver o DNA marcado no mix e vortexar bastante).
Mix de Hibridação: (quantidade suficiente para uma lâmina) Em um tubo Eppendorf 0,6 ml adicionar: -7,5 µl da sonda marcada, -30 µl de formamida (concentração final 50%), -12 µl de sulfato de dextrano 50% (concentração final 10%) -10,5 µl de 20xSSC (*Misturar bastante o mix de hibridação depois de pronto e deixá-la a temperatura ambiente até o uso) (Obs: No caso de Double FISH adicionar 7,5 µl da sonda 18S e 7,5 µl da sonda 5S). 9. Desnaturar as lâminas em formamida 70%*** a 70º C por 4 minutos ( Tomar cuidado para não ultrapassar esse tempo e fazer no máximo duas lâminas por vez). ***Formamida 70%: - 24,5 ml Formamida - 10,5 ml 2xSSC 10. Imediatamente desidratar as lâminas em série de etanol 50% e 100% por 5 minutos cada, ambas no gelo. Deixar secar ao ar. 11. Colocar o mix de hibridação no banho-maria previamente aquecido a 80 C, por 10 minutos. 12. Retirar e colocar imediatamente no gelo até o uso (no mínimo 10 minutos). (* Ressuspender o mix de hibridação antes de colocar na lâmina, pois o sulfato de dextrano fica no fundo) 3) Hibridação: 13. Colocar 50 µl do mix de hibridação sob lamínula de vidro, colocando em seguida o lado da lâmina com o material em contato com a lamínula. Incubar as lâminas de maneira invertida (lamínula para baixo) em câmara úmida a 37 C, overnight. (A câmara úmida deve ser preparada com toalhas de papel molhadas com água destilada e 2xSSC). 4) Lavagens Pós-hibridação: 1. Colocar as soluções de 2xSSC e 1xPBS no banho-maria para aquecer a 45 C. Enquanto isso, preparar a solução de 1xPBD.
1xPBD (para 1000 ml). Quantidade calculada para lavagem de 4 lâminas 200 ml 20xSSC; 6 ml Triton 100; 10 g de leite em pó desnatado; 800 ml água destilada qsp. 100; ph 7,0 2. Lavar as lâminas em 2xSSC aquecido a 45 C por 5 minutos com agitação, repetir mais uma vez essa lavagem. 3. Lavar as lâminas em 1x PBS aquecido a 45 C por 10 minutos com agitação. 5) Detecção e amplificação do Sinal 1. Incubar as lâminas em 1xPBD (* Até a avidina-fitc estiver pronta). 2. Colocar 50 µl da solução de detecção sobre uma lamínula de plástico. Solução de detecção avidina-fitc (quantidade por lâmina): 5 µl de FITC (1:100) + 45µL de BSA 5% x nº lâminas = para Double FISH 0,25 µl de anti-digoxigenina + 5 µl de FITC (1:100) + 44,75 µl de BSA 5% x nº lâminas = 3. Inverter a lâmina sobre esta lamínula e deixar por 1 hora em câmara úmida a 37 C; 4. Remover a lamínula e lavar 3 vezes em 1xPBD a 45 C, por 5 minutos, NO 6) Caso deseje Amplificar o sinal: 5. Incubar com 40 µl de anti-avidina-biotina conjugada (1,0 µl anti-avidina + 39 µl 1x PBD) por lâmina durante 20 minutos em câmara úmida e escura, a 37 C 6. Remover a lamínula e lavar 3 vezes em 1xPBD a 45 C, por 5 minutos, NO 7. Sobre uma lamínula colocar 3,5 µl de FITC (1:100) + 46,5 µl de BSA 5%. 8. Inverter a lâmina sobre esta lamínula e deixar por 20 minutos em câmara úmida a 37 C; 9. Remover a lamínula e lavar 3 vezes em 1xPBD a 45 C, por 5 minutos, NO 7) Montagem das lâminas Incubar a lâmina em 1xPBD até a montagem. Na proporção de 25µL de meio de montagem DABCO + 1µL de MgCl 2 50mM + 1µL de solução de Iodeto de Propídio (50µg/mL); ou 1 µl DAPI (2µg/mL) por lâmina. Guardar no escuro a 4 C.
SOLUÇÕES Paraformaldeído 4%: 4 g de paraformaldeído 98 ml de água destilada a 60ºC 2mL de NaOH 1 M 1M = peso molecular em 1000 ml 40g - 1000 ml ou 4 g - 100mL NaOH - 1M 20xSSC - ph 7,0 Cloreto de Sódio - 175,6 g Citrato de Sódio 2 H 2 O - 88,2 g Dissolver em 500 ml de água no agitador e depois completar para 1 litro. *** Para a mistura de hibridação preparar separadamente com água milli-q, sendo o volume de 10 ml, filtrar, alicotar e congelar. Cloreto de Sódio 1,756 g Citrato de Sódio 2 H 2 O 0,882 g em 10 ml de água milli-q. 2xSSC 20xSSC --------------1000mL 2xSSC---------------- x x= 100mL de 20xSSC + 900 ml de H 2 O 450mL de formamida Formamida Deionizada 2 colheres de chá de resina Resina AG 501/X8 da BIO-RAD (não deixar na luz) ***10 ml de formamida (para a mescla) ***1 colher de pesagem de resina Colocar no erlemeyer coberto com papel alumínio e colocar no agitador overnight ou até ficar com uma cor dourada (2 a 3 horas). ***Para filtrar a formamida usar um papel filtro novo e limpo (não usar o milipore). Colocar 3 folhas de papel filtro na seringa.
Dextran sulfato 50% 5g de dextran 10 ml de água milli-q Alicotar em eppendorf e congelar 0,01 g (10 mg) de RNAse 1 ml de água milli-q RNAse (10mg/mL) - solução de estoque Avidina-FITC 500 µg/ml (solução estoque) 5 mg (0,005 g) 10 ml de BSA 5% em 4xSSC/Tween 20 [ ] = 0,005 = 5000 µg/10 ml ou 500 µg/ml 10 µl FITC solução estoque 990 µl de BSA 5% Avidina-FITC 5 µg/ml (solução uso) BSA 5% (Bovine Sorum albumine) Lavar muito bem o frasco com água milli-q Solução A: 2mL de 20xSSC + 8mL de H 2 O milli-q + 200 µl de Tween da Gibco = 10 ml 0,5 g de BSA 10 ml da solução A Dissolver bem em banho-maria a 60ºC, filtrar e alicotar em eppendorf e congelar. 10x PBS (solução estoque) 75,8 g de NaCl (1,36M) 4,14 g de NaH 2 PO 4 (30mM) Dissolver em 800 ml de água destilada. Completar para 1 L. Autoclavar 50 ml de 10x PBS 450 ml de água destilada 1xPBS