PROTOCOLO LAB No REV 00 Análises de Nutriente Inorgânicos Dissolvidos do WH

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1 PROTOCOLO LAB No REV 00 Análises de Nutriente Inorgânicos Dissolvidos do WH Objetivo O objetivo deste protocolo é descrever a método adotado para análises distintas de nutrientes inorgânicos dissolvidos do Water Hunters. Materiais e Equipamentos necessários Materiais Equipamentos Água ultra-pura (Tipo I, Milli-Q) Pissete com água ultra-pura Provetas volumétricas Balões volumétricos Pipetas volumétricas Béchers Espátulas de inox Coluna de Nitrato N - NH 4 + : - Solução tampão de Citrato - Fenol - Solução DTT (Cloro) Hipoclorito - Solução estoque padrão Bomba peristáltica Espectrofotômetro Balança analítica de precião Reagentes e Soluções P-PO 4 3- : - Ácido Sulfúrico 4,5M (H 2 SO 4 ) - Ácido Ascórbico acidificado - Reagente Mistura para Fosfato - Solução estoque M N-NO 2 - : - Sulfanilamida - NED - Solução estoque µm Si (OH) 4 - H 2 SO 4 4,5M - Ácido Oxálico - Ácido Ascórbico - Solução estoque 5000 µm N-NO 3 - : - Tampão de Cloreto de Amônio - Coluna redutora (cádmio cuperizado) - Sulfanilamida - NED - Sulfato de Cobre - Solução estoque de NO 3 - Página 1 de 8

2 Procedimento I. Análise do Amônio (N - NH 4 + ) 1. Preparo das Soluções a) Solução tampão de Citrato: 48g citrato tri-sódico dihidratado (C 6 H 5 Na 3 O 7.2H 2 O) + 0,08g hidróxido de sódio (NaOH). Dissolver aquecendo em 120ml de água destilada; deixar ferver até chegar ao volume de 100ml. b) Fenol: 3,8g fenol (C 6 H 5 OH) e 0,04g de Sódio Nitroprusiato dissódico dihidratado (conservar em geladeira). Dissolver em 60ml, completar até 100ml. c) Solução DTT (Cloro) Hipoclorito: 0,2g ác.diclorocianurico DTT (C3Cl2Na3NaO3.2H2O) (geladeira) e 1,6g de hidróxido de sódio (NaOH). Dissolver em 60ml de água destilada fervida e completar para 100ml. d) Solução estoque padrão (NH4): Secar cloreto de amônio (NH4Cl) a 100oC. Esfriar em dessecador. Dissolver 535 mg em 1000 ml de água fervida, esta solução contém µm. 2. Metodologia e) Enxaguar os frascos várias vezes com água recém-purificada e depois com amostra. f) Retirar alíquotas de 25 ml de amostra; g) Adicionar: 1 ml de fenol (conservado em geladeira ) (eppendorf nº 4) agitar 0,5 ml de citrato para NH 4 (eppendorf nº 5) agitar 1 ml de DTT (eppendorf nº 4) h) Agitar Página 2 de 8

3 i) Deixar as amostras no escuro por no mínimo 6 horas (no máximo 30 horas); j) Fazer a leitura espectrofotômetro no comprimento de onda de 630 m. k) Brancos: 25 ml de água recém destilada. l) Padrões: A partir de uma solução estoque de µm são preparados dois padrões de 1 µm mediante duas diluições de 1/100 ml. Ou fazer curva padrão com diferentes diluições. II. Análise Fosfato (P-PO 4 3- ) 1. Preparo de Soluções: m) Ácido Sulfúrico 4,5M (H2SO4): Adicionar 250 ml de H 2 SO 4 concentrado à 750 ml de água destilada. Ajustar o volume para 1 litro, depois de resfriado. Estocar em frascos de polietileno. n) Ácido Ascórbico acidificado: Dissolver 5 g de ácido ascórbico (C 6 H 8 O 6 ) em 25 ml de água destilada. Adicionar esta solução à 25 ml de H 2 SO 4 4.5M. Estocar em vidro âmbar na geladeira. A solução é estável por pelo menos uma semana e pode ser usada enquanto permanecer sem cor. o) Reagente Mistura para Fosfato: Dissolver 12,5g de heptamolibidato de amônio tetrahidratado [(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24.4H 2 O ] em 125 ml de água destilada. Dissolver 0,5g de tartarato de antimônio potássio em 20 ml de H 2 O. Adicionar a solução de Molibidato à 350ml da solução de H 2 SO 4 4.5M, mexendo constantemente. Adicionar então, o tartarato e misturar bem. A solução é estável por muitos meses. Estocar em frasco de vidro. p) Solução estoque M: KH 2 PO 4 é seco em estufa a 110 o C por duas horas, resfriar em dessecador. Pesar exatos 136,1 mg e dissolver em água destilada, previamente acidificada com 0,2 ml da solução H 2 SO 4 4.5M. Elevar o volume a 100 Página 3 de 8

4 ml. Estocar a solução em frasco de vidro (âmbar) na geladeira. A solução é estável por meses. 2. Metodologia: q) O fosfato inorgânico reage com molibdato acidificado, produzindo um complexo de fosfomolibdato, posteriormente reduzido, por ácido ascórbico, a um composto azul. Retirar alíquotas de 10 ml da amostra. Adicionar 0,2 ml de ácido ascórbico para PO 4 (eppendorf nº 2) Agitar Adicionar 0,2 ml de reagente mistura para PO 4 (eppendorf nº 2) Agitar A leitura deve ser feita no intervalo de 10 à 20 minutos, devido à possibilidade de interferência pelo silicato. A absorbância deve ser lida no comprimento de onda de 880 m. r) Brancos: 10 ml de água destilada. s) Padrões: À partir de uma solução estoque de µm são preparados dois padrões de 1 µm mediante duas diluições de 1/100 ml. Ou fazer curva padrão com diferentes diluições. III. Análise Nitrito (N-NO 2 - ) 1. Preparo de Soluções: t) Sulfanilamida: Dissolver 2,5 g de sulfanilamida cristalina em uma solução de 25 ml de HCl concentrado ml de água destilada. Após resfriada, aferir o volume para 250 ml. u) NED: Dissolver 0,25g de dihidrocloreto de N (1-naftil)-etilenodiamina (NED) em 250 ml de água destilada. Estocar em geladeira em vidro âmbar. Precisa ser renovada se a cor for alterada de maneira característica. v) Solução Estoque µm: Secar NaNO 2 a 100º C por 1 hora. Resfriar em dessecador. Pesar 0,690 g e dissolver em 1000 ml de água destilada. Guardar a solução em vidro âmbar, na geladeira, preservada com 1 gota de clorofórmio. Página 4 de 8

5 2. Metodologia: w) Todos os métodos para detecção de nitrito baseiam-se na reação deste com amina aromática, formando um composto que reage com uma amina aromática secundária produzindo uma coloração rosada. Retirar alíquotas de 10 ml da amostra. Adicionar 0,2 ml de sulfanilamida (eppendorf nº 2) Agitar Adicionar 0,2 ml de NED (eppendorf nº 2) Agitar Um período mínimo de 15 minutos é necessário para o desenvolvimento da reação. O tempo máximo para a leitura é de 1 hora após a adição dos reagentes. A absorbância deve ser lida no comprimento de onda de 540 m. x) Brancos: 10 ml de água destilada. y) Padrões: À partir de uma solução estoque de µm são preparados dois padrões de 1 µm mediante duas diluições de 1/100 ml. Ou fazer curva padrão com diferentes diluições. IV. Análise Nitrato (N-NO 3 - ) 1. Preparo de Soluções: z) Tampão de Cloreto de Amônio: Dissolver 10 g de cloreto de amônio em 1 litro de água destilada. Adicionar 1,5 ml de hidróxido de amônio concentrado para que o ph seja ajustado para aproximadamente 8,5. aa) Sulfanilamida e NED: Ver reagentes do Nitrito. bb) Coluna redutora (cádmio cuperizado): Cádmio granulado comercial peneirado na fração de de malha. O cádmio é lavado com uma solução de HCl 2 M, com o intuito de eliminar os óxidos. Então, ele é vagarosamente agitado num becker contendo aproximadamente 10 ml de sulfato de cobre, durante mais ou menos 3 minutos. Os grânulos de cádmio cuperizados são então lavados com água, com agitação suave. A lavagem continua até ser elimi- Página 5 de 8

6 nado todo o cobre coloidal ou finamente disperso. Os grânulos ficam em água até a sua utilização. A coluna é montada enchendo-a primeiramente com água e colocandose o cádmio para dentro. Não empacotar demais. Tampar as extremidades com lã de vidro. Ativar o redutor passando 100 ml de uma solução de cloreto de amônio contendo 100 µm de NO 3 - (solução padrão). Logo após, lavar a coluna com somente cloreto de amônio (aproximadamente 400 ml). Usar a coluna até diminuir a eficiência, o que ocorre após vários meses. cc) Sulfato de Cobre: 10g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO 4.5H 2 O) em 1 litro de água destilada. dd) Solução estoque de NO3-: Dissolver g de nitrato de potássio (KNO 3 ) previamente secos (1 hora a 100 o C), em 1 litro de água destilada. A solução contém uma concentração de µm. Estocar em geladeira, em vidro âmbar. 2. Metodologia: ee) Várias metodologias fracassaram em tentar analisar diretamente o nitrato na água do mar. O melhor e mais aplicado consiste na redução no nitrato a nitrito e posterior determinação deste último. A redução do nitrato pode se dar num meio homogênio ou heterogênio, sendo este último o mais usado. O redutor em questão é uma coluna de grânulos de cádmio envoltos num manto de íons de cobre (cádmio cuperizado). Os principais problemas estão relacionados com as condições de redução. Um baixo ph ou superfícies muito ativas reduzem o nitrato à formas mais reduzidas que nitrito. Alto ph ou superfícies pouco ativas resultam em baixa redução. ff) Em ambos os casos, o resultado é abaixo do esperado. Vários problemas ocorrem devido à mudanças de ph no curso da passagem do nitrato na coluna, alterações que são inevitáveis no processo. Para evitar tais problemas a água do mar precisa ser tratada com um tampão, usando neste caso, o cloreto de amônio (NH4Cl). De qualquer maneira, o tempo durante o qual a amostra fica em contato com a coluna precisa ser controlado. O nitrito inicial, presente na amostra, precisa ser obviamente descontado. Página 6 de 8

7 gg) É importante observar que o fluxo no redutor deve ser de 5 ml a cada Seg. Retirar alíquotas de 20 ml da amostra em uma proveta. Adicionar 20 ml da solução tampão de cloreto de amônio. Passar esta mistura pela coluna redutora. Os primeiros 10 ml são desprezados. Os próximos 10 ml são recolhidos no tubo coletor para lavagem deste, sendo também desprezados. Os últimos 10 ml são recolhidos no tudo graduado coletor e passados para um tubo de ensaio comum para serem analisados. Tratar as amostras reduzidas como nitrito, adicionando 0,2 ml de sulfanilamida, agitar e aguardar 1 minuto, e após, adicionar 0,2 ml de NED. Após 15 minutos de reação, fazer a leitura em 540 m. hh) Checagem da eficiência da coluna: Checar periodicamente, verificando os fatores de calibração para nitrito e nitrato e sua relação. A eficiência deve estar entre %. Caso esteja baixa, repetir ativação. Se não funcionar, montar novamente a coluna. V. Análise Silicato (Si (OH) 4 ) 1. Preparo de Soluções: ii) H2SO4 4,5M: Adicionar 250 ml de H 2 SO 4 concentrado à 750 ml de água destilada. A- justar o volume para 1 litro, depois de frio. Estocar em frascos de polietileno. jj) Mistura: Dissolver 38g de heptamolibdato de amônio tetrahidratado [(NH 4 ) 6 M0 7 O 24.4H 2 O] em 300 ml de água destilada, depois adicionar esta solução em 300 ml de solução de H 2 SO 4 4,5M. (Nunca adicionar ácido diretamente no molibdato). Estocar em recipiente de polietileno, abrigado da luz. Estável por meses. kk) Ácido Oxálico: Dissolver 10g de ácido oxálico (C 2 H 2 O 4-2H 2 O) em 100ml de água destilada. Guardar em frasco plástico. ll) Ácido Ascórbico: Página 7 de 8

8 Dissolver 2,8g de ácido ascórbico (C 6 H 8 O 6 ) em 100ml de água dest. Guardar em frascos na geladeira. Estável até permanecer sem cor. mm) Solução Estoque Si (5000 µm): Secar aproximadamente 2 g de Hexaflúor silicato de sódio (Na2SiF6) em estufa por 1 hora à 105ºC. Esfriar em dessecador e pesar exatamente 0,96 g. Dissolver em água destilada (aproximadamente 50 ml), usando um becker de polietileno e um agitador magnético (é de difícil dissolução). Aferir para 1000 ml. Conservar em frasco plástico, ao abrigo da luz. Esta solução é estável por vários meses 2. Metodologia: nn) Os compostos de sílica dissolvida reagem com uma solução de molibdato, quando a amostra é acidificada. Algumas reações paralelas são necessárias para a manutenção da estabilidade do composto formado, cuja coloração é azul. Alíquotas de 10 ml de amostra são colocadas em frascos plásticos; Adicionar 0,4 ml do reagente mistura para silicato; Agitar e aguardar de minutos; Adicionar 0,4ml de ácido oxálico para silicato; Agitar; Imediatamente após, adicionar 0,2 ml de ácido ascórbico para silicato, agitando em seguida. A reação atinge um máximo após 20 minutos e é estável por horas. Ler a absorbância em comprimento de onda de 810 m. oo) Brancos e Padrões: Brancos são obtidos com 10ml de água destilada mais os reagentes. Padrões são obtidos de solução estoque de µm de Si (SiO 2 ou Na 2 SiF 2 ), em uma diluição de 2/250 ml. Ficando assim, com uma concentração final de 40 µm. Ou fazer curva padrão com diferentes diluições. Troubleshooting Inderteminado. Referências Adaptado de Grashoff, K.; Kremling, K.; Ehrhardt, M. Methods of seawater analysis. 3ª ed. Weinheim: Wiley-VCH Página 8 de 8