Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas Curso de Ciências Biológicas Métodos de Purificação de Proteínas Nativas Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas Curso de Ciências Biológicas Agradecimentos ao Prof. João Pizauro (Depto. Tecnologia) pelos slides Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
Introdução As células são constituídas de proteínas codificadas por diferentes gene. Executam uma função específica Para caracterizar bioquimicamente uma proteína, o ideal é extrair e purificá-la mantendo sua estrutura e função originais A purificação permite a caracterização estrutural e funcional da proteína, já que encontram-se livres de contaminantes
Rompimento das células obtenção do extrato proteico bruto
SEMPRE, SEMPRE e SEMPRE trabalhar com proteínas em baixa temperaturas (0 a 4ºC)!!! Usar tampão correto (ph, cofatores, estabilizadores, etc.)
Bactérias: Bactérias normais são rompidas ou choque osmótico, já as com parede celular espessa necessitam de outros tratamentos Animal: Tecidos de animais como eritrócitos, fígado e cérebro são fáceis de serem rompidos; já tecidos ricos em colágeno como vasos sanguíneos e músculo liso são mais difíceis Vegetal: Células são mais difíceis de serem rompidas porque contém celulose e fenóis
Almofariz (cadinho) Material Duro Método mecânico mais simples e mais barato para se obter extrato de tecido ou célula Esse método é utilizado na homogeneização de células bacterianas e vegetais em pequenas quantidades
Material Duro Agitação com pequenas partículas (beads) Utiliza-se agitador para proporcionar agitação violenta de uma suspensão de células com partículas de material resistente capaz de se desintegrar pelo choque Usado para obtenção de extratos livres de células de levedura Resfriamento prévio do material e imediatamente após ruptura são fundamentais nesse processo!
French Press Rompe células microbianas forçando a passagem das mesmas por um orifício muito pequeno a uma alta pressão A diferença de pressão em ambos lados do orifício e o atrito fazem as células romperem Aplicada em várias preparações Material Duro
Material Duro Ultrassom São empregados no rompimento de parede celular. As vibrações sônicas e ultra-sônicas quebram as células por cavitação. É produzida pela alternância de ondas de baixa pressão em que as bolhas crescem até atingirem alta pressão na qual são comprimidas e implodem.
Material Duro Lisozima A parede celular das bactérias consiste de uma estrutura em rede que envolve completamente a célula. Heteropolissacarideo constituído por dois tipos de monossacarídeos : N-Acetil- ß-Dglucosamina e ácido N- acetilmurâmico
Material Mole
Material Mole Choque osmótico Transferência rápida de uma solução isotônica para uma solução hipotônica. Devido a osmose as células ficam túrgidas provocando a lise da membrana. Ruptura por tratamento químico Usa-se solvente orgânico ou detergente para romper diferentes tipos de tecidos, células e organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes e ácidos.
Material Mole
Etapas de separação Centrifugação diferencial Centrifugação diferencial é usada para separar organelas, pedaços de membranas e citosol (fração solúvel do citoplasma) do extrato celular.
Etapas de separação
Matriz óssea Placa óssea Centrifugação diferencial NH 2 + Enzimas associadas à membrana Fração solúvel
Matriz óssea Placa óssea Centrifugação diferencial NH 2 + Enzimas associadas à membrana Fração solúvel
NH 2 Enzimas associadas à membrana Detergente
NH 2 Enzimas associadas à membrana PIPLC NH 2 Pirofosfatase e ATPase Fosfatase alcalina
Extração de proteínas de membranas
Estratégia Geral para Obtenção da Proteína Purificada Extração Isolamento 1. Material de Partida ------ Extrato Bruto 2. Desintegração celular Separação Fracionamento Solubilidade Tamanho Carga Afinidade Ligação Diálise Ultra filtração Coluna Cromatografica
Precipitação de proteínas Utilização de diferenças nas solubilidades das proteínas Concentração salina A adição de um sal na quantidade correta pode precipitar algumas proteínas e manter outras em solução (NH 4 ) 2 SO 4 O sal tem muita solubilidade e estabiliza a estrutura nativa das proteínas
Salting in Muitas proteínas tornam-se mais solúveis com aumento da concentração de sal Salting out Quando as concentrações de sal atingem valores muito elevados, a solubilidade diminui
Ultra Filtração Princípio: Uma membrana semipermeável permite a separação das moléculas menores (solventes, íons, etc) das moléculas grandes ( peptídeos, protéicas), pois apenas as moléculas pequenas podem penetrar na membrana quando a pressão osmótica é excedida O processo de ultra filtração é empregado para concentração, dessalinização e fracionamento
Diálise Procedimento que separa as proteínas dos solventes beneficiando-se do tamanho maior das proteínas
Cromatografia em coluna
Gel-Filtração A separação é feita de acordo com o tamanho molecular
Cromatografia de troca iônica
Cromatografia de Afinidade Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada Proteínas ligadas podem ser eluídas com moléculas pequenas ou reagentes
Exemplos de Colunas Cromatográficas DNA-celulose Heparina Fosfocelulose Blue-sepharose
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Pressão
Como analisar o resultado da purificação? (como visualizar proteínas e determinar a pureza da amostra? Absorbância 280nm SDS-PAGE
A280
A280
SDS-PAGE (Eletroforese em Gel de Poliacrilamida- SDS)
SDS-PAGE Ação do SDS
SDS-PAGE Ação do -mercaptoetanol -S-S- SH S S -S-S- S S + SDS + 2-mercaptoetanol 4 SH
1 2 3 Amostra Amostra Amostra Adição de SDS β - Mercaptoetanol Fervura
SDS-PAGE o Eletroforese: Separação e visualização das proteínas no Gel Azul de Comassie Prata
SDS-PAGE
0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN C+ Ind S FT W1 Blue-Sepharose S FT W1 W2 Gradient 60-100 mm KPO 4 150 mm KPO 4 1 2 3 4 Fosfocelulose
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