log PM 9//202 Ex 7. Purificação de uma celulase por cromatografia de troca iônica e filtração em gel sendo dados a quantidade de material aplicado e a correspondente atividade enzimática a) Recuperação? b) Atividade específica (500 U/ mg) (00 U/0.02 mg) (00 U/0.05mg) (80 U/0.02mg) c) Qual seria melhor? Filtração em gel que levou a uma celulase de maior atividade específica com boa recuperação. Ex 7. continuação- Calcule a massa molecular por SDS-PAGE (,4 cm) Migração relativa = migração individual) = migração total (bromofenol (4,3 cm) 4,7 B y=-,089x + 4,98 DataB PM (kda) (log) Migração relativa 4,6 4,5 4,4 4,3 4,2 PM= 30200 45 (4,65) 0,32 3 (4,49) 0,47 23 (4,36) 0,65 4 (4,5) 0,79 Celulase (4,48) 0,49 4, 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 migração relativa 2
log PM 9//202 Ex 7. continuação- Calcule a massa molecular por filtração em gel 7,53 PM 66.000? 2.000 K av = (V eluição - V 0 ) (exclusão) (V t -V 0 ) 25 PM (kda) ( log) v.eluição(ml) Kav 66 (4,855) 9,38 0,06 45 (4,6532) 0,46 0,68 2,4 (4,0934) 3,70 0,353 6,5 (3,829) 6,22 0,497 Celulase (4,7737) 9,58 0,73 4,8 4,6 B y=-2,6274x+ 5,0820 Linear Fit of DATA_B PM 59380 4,4 4,2 4,0 3,8 0, 0,2 0,3 0,4 0,5 Kav 3 Ex 7. continuação- d) A massa molecular determinada por flitração em gel (~60.000. Da) foi 2X a massa determinada por SDS-PAGE (~30.000). Isso indica que a enzima nativa é um dímero de 2 subunidades de ~30.000 Da. De fato, na filtração em gel a proteína está no estado nativo, enquanto que em SDS- PAGE a proteina é desnaturada em presença de SDS que rompe ligações hidrofóbicas, e no caso de gel redutor, tb as ligações dissulfeto. SDS-PAGE ~30 ~30 Filtração em gel Tampão de amostra ~30 ~30 4 2
Abs 420nm 9//202 Ex 8. Dado o perfil de eluição da alfa-glicosidase (pi= 7,0) em DEAE (+) a ph= 8,0, esboçar os perfis de eluição a ph= 4,0 e 9,0). ph= 4,0 ph= 9,0 3 unidades de ph abaixo pi (E+++ ) 2 unidades de ph acima pi (E- -) [NaCl] tubos 5 Ex 9. A proteína que é eluída após a adição de sal é a proteína A. Pode-se concluir isso analisando o perfil da solubilidade das proteínas função do ph. A proteína A e proteína B tem solubilidade mínima em ph 3,0 e 6,0, respectivamente. Como, no geral, a solubilidade é mínima perto do pi (carga líquida= zero e portanto menor repulsão entre as moléculas) podemos concluir que as proteínas A e B tem pi de 3,0 e 6,0, respectivamente. Assim, numa mistura dessas proteínas a ph = 6,0, a proteína A terá carga de ~-3 e a B terá carga ~0. Assim numa coluna de troca aniônica (trocadora de ânions; carga +) a proteína B não interage com a coluna enquanto que a proteína A interage e só eluirá com a adição de tampão contendo NaCl. 6 3
log PM log PM 9//202 Ex. 0 -Coluna de exclusão molecular kda Ve Kav log PM 2.000 7,53 250 9,38 0,06 2,400 70 0,46 0,68 2,230 65 3,7 0,353,83 24 6,22 0,497,380 V e -V Kav= 0 V t - V 0 2.4 2.2 2.0.8.6 y=-2,558x+ 2,673 R 2 = 0.998 tubos Ve Kav log PM PM 0 0,4 2,32 205.20 2 0,99 2,64 45.880 3 3 0,33,872 74.470 4 4,5 0,399,652 44.874 4b 5 0,428,578 37.844 -SDS-PAGE total=4.05 kda migration Rf log PM 250 0,2 0,052 2,400 48 0,90 0,222 2,70 98,44 0,356,99 60 2,05 0,506,778 50 2,32 0,573,699 22 3,04 0,75,342 6 3,82 0,943,204.4.2 2.4 2.2 2.0.8.6.4.2 0. 0.2 0.3 0.4 0.5 Kav y=-,402x+ 2,479 R 2 = 0.995 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8.0 Rf 7 -SDS-PAGE- Condições redutoras Tubo migração Rf Log PM PM banda 0,40 0.099 2,340 28.776 banda 2 0,50 0.24 2,305 20.837 Tubo 2 banda 0,950 0,235 2,50 4.254 banda 2 2,27 0,560,694 49.43 banda 3 3,22 0,795,364 23.2 Tubo3 banda,65 0,407,908 80.90 Tubo 4 banda 2,44 0,602,635 43,52 banda 2 2,94 0,726,46 28.907 banda 3 3, 0,765,406 25.468 -SDS-PAGE- Condições não redutoras Tubo 2 migração Rf Log PM PM banda 0,850,287 2,50 4.254 banda 2,00 0,250 2,28 34.280 O resultado da cromatografia de exclusão em gel preve um PM maior e portanto deve ser um dímero. Porisso foi realizada a cromatografia de troca iônica que confirma que temos proteína com 2 subunidades ligadas por interações hidrofóbicas no tubo 4A ( PM> 22kDa e PM<22kDa) e uma proteína no 4B (~ 43 kda) A) 7 proteínas B) 29, 20, 4, 34, 80,9, 54,4 e 43.2, kda A proteína de 34 kda apresentava 4 subunidades: 2 de ~ 49.4 e 2 de ~ 23. kda ligadas por pontes dissulfeto e a de 54,4 kda deve ser constituída de duas subunidades ligadas por interações hidrofóbicas C) Proteína do tubo 4A (provavelmente 2 subunidades) tem pi 7 e a proteína do tubo 4B tem pi <7, mas próximo de 7, porque eluiu com baixa concentração de sal 8 4
9//202 Ex.. Nonapeptídeo submetido a vários experimentos para determinar sua estrutura primária. A. Peptídeo + tratamento com DNFB + hidrólise c/hcl conc. + cromatografia indica Ala como aminoácido N-terminal. quimiotripsina B. Peptídeo P P2 P3 Seq/ Ala Arg Pro Glu Ala Gly Phe Ala Phe C. Peptídeo tripsina P P2 Seq/ Ala Phe Ala Gly Phe Ala Arg Pro Glu Comparando os peptídeos obtidos em B e C, chegamos a: Ala Phe Ala Gly Phe Ala Arg-Pro-Glu 9 Ex. 2. Comparar a migração em cromatografia de papel dos peptídeos Lys-Lys com Leu-Leu-Leu sabendo que o solvente (fase móvel) é butanol: ácido acético:água na proporção de 4::. A relativamente alta proporção de butanol na fase móvel a torna razoavelmente hidrofóbica e portanto deve migrar mais (>Rf) o peptídeo mais hidrofóbico. O +H 3 N CH C H N O CH C O- +NH 3 O CH C H N O CH C H N O CH C O- CH CH 3 CH CH 3 CH CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 NH 3 + Lys-Lys NH 3 + Leu-Leu-Leu Compare as estruturas dos peptídeos acima e a resposta fica clara. 0 5
9//202 Ex. 3. 2 3 4 A. O protocolo foi realizado para obter informação sobre o aminoácido N-terminal à medida que o peptídeo e os amino ácidos padrões foram derivatizados com dinitrofluorbenzeno, hidrolisados em meio ácido e submetidos à cromatografia. B. Pela polaridade dos resíduos podemos inferir que o derivado mais apolar, a Phe (4), vai migrar mais na fase móvel (solvente apolar), em seguida migraria a Gly (3) e o Asp migraria menos (2). 3 C. A mancha inferior corresponde ao Asp-DNF que é o aminoácido N- terminal do dipeptídeo. A mancha superior só pode ser DNF em excesso porque aparece em todas as amostras e é apolar (migra bastante). D. Se omitíssemos esses passos, o dipeptídeo derivatizado não seria hidrolisado e portanto, a mancha inferior migraria diferentemente (não existiria na mistura o Asp-DNF). E. Como os aminoácidos são mais polares que seus derivados DNF, deveríamos utilizar uma fase móvel mais polar e portanto clorofórmio/metanol/ácido ácético 60/30/0 v/v/v, seria a mais adequada. 2 6
9//202 Ex. 4. Para calcular Km, ax - Calcular os valores de /v e /[S] em ausência de inibidor e plotar /v x /[S] y = a x + b y= 0,x + 0, R 2 = ax Slope=K M ax ax= 0 nmol/min K m = mm - K M Para calcular Ki ) Calcular os valores de /v e /[S] em presença das diferentes [I] e 2) plotar /v x/[s]. 3 Ex. 4. continuação Gráficos de duplos recíprocos em presença do inibidor -Pelos gráficos se conclui que se trata de inibição competitivanão altera ax mas altera K m /ax (inclinação) e, portanto, altera K m. inclinação ax Para calcular Pode ser calculado de duas formas: -Sem Inibidor a inclinação da reta /v o X /[S] é K M /V max -Com inibidor a inclinação da reta /v o X /[S] é (K M /V max ) para cada [I], sendo = + [I]/ Portanto Inclinação= Km = Km x + [I] ax ax Para [I]= 2 mm a inclinação é: 0,2 = x + 2 0 e = 2mM 4 7
9//202 Ex. 4. continuação -Alternativamente, pode-se plotar a inclinação do gráfico /v x /[S] para cada concentração do inibidor em função da [I] porque essa inclinação é: Inclinação= Km [I] + Km ax Ki ax y = a x + b -Ki 0,05= Km ax = 2 mm 5 Ex. 5. Fornecidos os dados cinéticos obtidos com extratos de fígado adulto (E) e fígado embrionário (E2) dizer se os extratos contém a mesma enzima. v o [S] M x0-4 µmol x mg - x min - E E2 v o K M = 3.x0-4 M E K M = 0,5 x 0-4 M E2 S E e E2 são enzimas distintas pois apresentam afinidades (K M ) diferentes pelo mesmo substrato 6 8
9//202 Ex. 6. Fornecidos os dados cinéticos obtidos com uma amostra de sangue de um paciente inconsciente avaliar se o paciente se exercitou ou sofre de dano hepático. Outra informação fornecida foi a de que as enzimas que catalisam a reação no fígado e músculo são isoenzimas (Km da Emúsculo= 0.2 x0-4 M; Km da Efígado (E)= 3 x0-4 M). [S] v o M x0-4 mol x ml de soro - x min - v o K M = 3.x0-4 M Paciente tem problemas no fígado porque a amostra do seu sangue forneceu um K m igual ao da enzima hepática. 7 S Ex. 7. Determinar o tipo de inibição por diferentes inibidores a partir de dados cinéticos. v o (nmoles/min) Para determinar o tipo de inibição será necessário fazer o gráfico de /v x /[S] para cada inibidor e analisá-lo. 8 9
9//202 -Inibidor I=competitivo inclinação: intercepto: (Km/) (/) V m K m nmoles/min mm µm Km (Substrato)= mm - I + I Km = x = + [I] Ki 0,03= + 6.0-6 00 = 3 x0-6 M -Existe semelhança estrutural entre S e I. -Inibidor aparentemente diminiu a afinidade da E pelo S (aumenta Km aparente) e não altera (altas [S] "vencem" a competição). 9 X= Não competitivo = 3 x0-6 M inclinação: intercepto: (Km/) (/) nmoles/min V m K m mm µm - I + I = 5 x0-6 M Km + [I] + [I] 0,03= + 30.0-6 00 9 Não existe semelhança estrutural entre S e I. Inibidor não altera K M mas diminui aparente (aparentemente diminui [Et]). = 20 0
9//202 Y= Acompetitivo - I + I inclinação: intercepto: + [I] = x0-3 M 0,05= + 4.0-3 00 Não há semelhança estrutural entre S e I. Inibidor diminui aparente (aparentemente diminui a [Et]), diminui Km aparente (aparentemente aumenta afinidade E e S) mas não altera a relação Km/ (inclinação) 2 Z= Misto inclinação: intercepto: - I + I Km + [I] mm 0,20 mm 0,80 4,00 + [I] 0,02= + 0,2.0-3 00 = 0,2 x0-3 M Não há semelhança estrutural entre S e I. 0,025= + 0,2.0-3 00 K I K I = 0,8 x0-3 M Inibidor diminui e pode aumentar ou diminuir K M 22