Universidade Federal Rural de Pernambuco Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo Disciplina: Seminário II Professor: Mario de Andrade Lira Junior Indicadores microbiológicos para qualidade do solo Mestranda: Rayssa Pereira Vicentin Orientador: Mario de Andrade Lira Junior Co-orientador: José Carlos Batista Dubeux Junior Co-orientador: Márcia do Vale Barreto Figueiredo Recife, 04 de dezembro de 2009.
Introdução Qualidade do solo é a capacidade do solo funcionar nos limites do ecossistema, sustentando a produtividade biológica, mantendo a qualidade ambiental e promovendo a saúde vegetal e animal.
Parâmetros da Qualidade do Solo Biológicas Composição vegetal. Fauna: Macro. Meso. Micro. Microbiota. Químicas Físicas Teores totais do elementos. Conteúdo e composição da Matéria Orgânica. Xenobióticos. Condutividade Hidráulica. Resistência a Penetração. Agregação.
Desenvolvimento Quando têm sido utilizados os indicadores microbiológicos? Parâmetro sensível. Quando a microbiologia é foco do trabalho. No estudo do Fluxo e Ciclagem dos Elementos.
Indicadores Microbiológicos Densidade. Diversidade. Atividade.
Densidade Métodos: Contagem de nódulos. http://www.cnpab.embrapa.br/images/fbnl.jpg
Densidade - Métodos Infecção micorrízica. Clareamento com KOH e H 2 O 2. Coloração com azul de tripano. Observação com microscópio estereoscópico.
Densidade - Métodos Número de esporos de fungos. Amostras tratadas com corantes. Observação em microscópios
Densidade - Métodos NMP (Número mais Provável. Diluições seriadas de amostras Inoculação em meio líquido ou semisólido. Tabela estatística NMP http://bervieira.sites.uol.com.br/dilui.htm
NMP (Número mais Provável. Tabela Estatística de Cochran P1 > P2 > P3 Moreira & Siqueira, 2006.
Densidade - Métodos Carbono da biomassa microbiana. Amostras frescas Fumigada. Não-Fumigada. Extração com K 2 SO 4, seguida de filtragem. Digestão com Dicromato, ácido sulfúrico e ácido ortofosfórico. Titulação com sulfato ferroso amoniacal, utilizando fenolftaleína como indicador. Carbono total Carbono solo = Carbono da biomassa. KC Silva et al., 2007.
Diversidade Variedade de indivíduos. Bactérias: Apenas 1% é passível de cultivo. Métodos Moleculares Moreira & Siqueira, 2006.
Diversidade Métodos: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição. Proximidade genética de isolados. Extração de DNA do isolado. Digestão com enzima de restrição. Separação de fragmentos em eletroforese horizontal. http://static.hsw.com.br/gif/how-to-prepare-soil-for-planting-4.jpg http://www.mundovestibular.com.br/articles/219/1/o-dna/paacutegina1.html http://1.bp.blogspot.com/_ynavc3ebabu/ssn1ob2gubi/aaaaaaaaanw/w9y2bjsiox A/s320/replicação+semiconservativa.JPG
RFLP http://www.scielo.cl/fbpe/img/amv/v40n2/art11-figura01.jpg
Diversidade Métodos AFLP (Amplified fragment length polymorphism) polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados. Extração do DNA genômico do isolado. Digestão com enzimas de restrição com corte adesivo. Amplificação. Dendrograma de similaridade. Eletroforese em gel de agarose.
PCR Reagentes: Tampão. dntp. Primer Amostra de DNA. Taq Polimerase. MgCl. 94 C 50-60 C 72 C http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/taq.htm
Diversidade Métodos ARDRA. Extração do DNA genômico do isolado. Amplificação de genes universais. Digestão com enzimas de restrição. Dendrograma de similaridade. Eletroforese em gel de agarose. http://pgrc3.agr.gc.ca/facilities-installations_e.html
Diversidade Métodos DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação. Extração do DNA Total de Microrganismos do Solo. Amplificação (genes universais ou de grupos). Eletrofores e em gel de agarose. Sequênciamento. Dendrograma Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação
Diversidade Métodos DGGE Menos [ ] Desnaturante Formamida. A=T C=G http://www.eeescience.utoledo.edu/faculty/sigler/research/pr otocols/dgge/dgge.pdf Mais [ ] http://biomicrolab.web.ua.pt/images /DGGEgela.jpg
Diversidade Métodos Biblioteca Metagenômica/Sequenciamento. DNA de amostra ambiental Amplificação Sequenciamento http://www.libertaria.pro.br/d_ressurgentes_arquivo/cadeia.jpg
Sequenciamento Desnaturação do DNA Anelamento de 1 primer Polimerização com nucletídeos marcados.
Diversidade Métodos Microarranjos. Poços com DNA fita simples. Hibridização com DNA da amostra. Identificação através da fluorescência. http://www.fiocruz.br/ccs/media/grafico_microarranjo.jpg
Diversidade Box-PCR. Os Primers utilizados são sequências grandes de nucleotídeos que se repetem no DNA. Gerando uma variedade diferente tamanho de fragmento. http://www.bspp.org.uk/publications/new-disease-reports/012/2005-84-1.gif
Atividade microbiana Respiração Basal Amostras Frescas Incubar amostra + frascos contendo NaOH em ambiente hermético. Frascos NaOH são acrescidos BaCl 2 para precipitar o CO 2. Titulação com ácido clorídrico na presença de fenolftaleína. RBS (mg de C-CO 2 kg -1 solo hora- 1 ) Coeficiente Metabólico qco (mgc-co 2.g -1 BMS C.h -1 ) Silva et al., 2007.
Atividade microbiana Atividade Enzimática Princípio: Incubação com substrato, por determinado tempo e temperatura, e leitura do produto da reação. Enzimas: Arilsulfatase (mineralização de Enxofre). Fosfatase (mineralização do Fóforo). Celulase (degradação da Celulase). Celulose Celobiose β-glucosidase (degradação da Celobiose). Celobiose Glicose
Atividade microbiana Determinação de ATP Extração: Ácido Tricloroacético. Solução de Fosfato. Ácido Sulfúrico. Ácido Fosfórico. Leitura: HPLC (High performance liquid chromatography) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Considerações finais É de suma importância a determinação de mais de um parâmetro de qualidade do solo. Os Indicadores Microbiológicos são parâmetros sensíveis pra determinar as alterações da qualidade do solo. Devido a dificuldade de cultivar as bactérias, métodos moleculares viabilizam o estudo da sua diversidade.
Obrigada! rayssapv@yahoo.com.br