MICROBIOLOGIA BÁSICA ENZIMAS, DESIDROGENASE, CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA, ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA E QUOCIENTE METABÓLICO

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1 MICROBIOLOGIA BÁSICA ENZIMAS, DESIDROGENASE, CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA, ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA E QUOCIENTE METABÓLICO MARCELO DE ANDRADE BARBOSA Doutorando em Agronomia (Ciência do Solo) - UNESP Jaboticabal SP 2016

2 COMPOSIÇÃO DAS PLANTAS 70 a 90% = H 2 O 10 a 30% = Matéria Seca +/- 96% = C, O e H +/- 45% = C Taiz e Zeiger (2012). +/- 45%= O +/- 6%= H +/- 4% Minerais (Fertilizantes, Ciclagem, Fixação biológica...) +/- 3,5% = N, P, K, Ca, Mg e S +/- 0,5% = Zn, B, Mn, Fe, Si e Cu

3 Mineralização do nitrogênio Aminização N org. R-NH 2 + CO 2 + outros produtos + E Amonificação R-NH 2 + H 2 O NH 3 + R-OH + E NH 3 + H 2 O NH 4+ + OH - Nitrificação 2NH O 2 2NO 2- + O 2 Nitrosomonas Nitrobacter 2NO H 2 O + 4H + + E 2NO 3- + E

4 Por que os microrganismos atuam nos processos de ciclagem de nutrientes?

5 ESTRUTURAS DE ARMAZENAMENTO DE NUTRIENTES Polihidroxibutirato (PHB) Glicogénio Vacúolo Nitrato Protozoários

6 ESTRUTURAS DE ARMAZENAMENTO DE NUTRIENTES Sulfeto de hidrogênio Intra e extra-celular

7 ENZIMAS Definição: As enzimas são proteínas especializadas em catalisar reações biológicas (LEHNINGER et al., 1995).

8 ORIGEM DAS ENZIMAS NO AMBIENTE 346 isolados Mata atlântica P. Solo P. Planta Figura 1. Percentual de isolados microbianos a partir do solo, planta, e amostras de água com a atividade de cada um dos cinco enzimas investigadas. Fonte: Alves et al., (2014).

9 ORIGEM E OCORRÊNCIA DAS ENZIMAS NO SOLO Biônticas ou endoenzimas? Abiônticas ou exoenzimas? e Melo (1988).

10 ESTUDOS ENZIMÁTICOS EM AMOSTRAS DE SOLO Amostragem de solo

11 ESTUDOS ENZIMÁTICOS EM AMOSTRAS DE SOLO Temperatura Armazenamento Umidade Fonte: Longo e Melo (2005)

12 DESIDROGENASE Importante na oxidação da matéria orgânica Enzima da membrana envolvida no processo de transporte de elétrons, que é acoplado a síntese ATP. Ocorre apenas em células intactas (vivas) Correlação + com o consumo de O 2 Não acumula extracelularmente Moreira e Siqueira (2006)

13 MÉTODO DE DETERMINAÇÃO Taxa de redução do TTC (trifeniltetrazolium chloride) (Aceptor artificial de elétrons) Para TPF (trifenil formazan)

14 PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 1- Pesar 3 g de solo seco (< 2 mm) em tubo de ensaio 18 x 180.

15 PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 2- Adicionar 0,03 g de carbonato de cálcio em cada tubo, agitar em agitador de tubos.

16 PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 3- Pipetar 0,5 ml de cloreto de 2,3,5 tripheniltetrazolio (TTC). 4- Pipetar 1,3 ml de água destilada em cada tubo.

17 PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 5- Vedar os tubos com filme plástico (PVC), e agitar vagarosamente entre as mãos. 6- Encubar em banho maria a 37 C por 24 horas.

18 PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 7- Inserir 10 ml de metanol e agitar.

19 PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 8- Filtrar em papel filtro Whatman 42, transferindo para erlenmeyers de 125 ml.

20 PROCEDIMENTO DE LABORATÓRIO Casida et al. (1964) 9- Fazer leitura em especfotômetro com absorbância de 485 nm. 10- Fazer cálculo, com auxílio de curva padrão.

21 Influência do manejo e da adubação na atividade enzimática da desidrogenase a longo prazo Eficiência da taxa oxidativa Figura 2. Atividade enzimática da desidrogenase em solo de área de plantio de milho cultivado em sistema convencional, com adubação com ureia (PC M) e com esterco bovino (PC E), plantio direto com adubação com ureia em sucessão milho/milho (PD M/M) e leguminosa/milho (PD L/M). Fonte: Barbosa (2015).

22 Influência do manejo e da adubação na atividade enzimática da desidrogenase a longo prazo Figura 3. Atividade da desidrogenase sob a aplicação a longo prazo de adubo orgânico e mineral, em rotação trigo e milho. Fonte: Chu et al. (2007).

23 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA Parte viva da MOS, representando de 2 a 5% desta fração no solo (JENKINSON; LADD, 1981). Composto por diversas espécies de microrganismos (HUNGRIA et al., 2009).

24 COMO ANALISAR? Os métodos mais freqüentemente utilizados para determinação da biomassa microbiana são fumigação-incubação (JENKINSON e POWLSON, 1976), fumigação-extração (VANCE et al., 1987) e irradiação com microondas (ISLAM e WEIL, 1998).

25 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 1- Pesar 10 g de solo em Erlenmeyer de 250 ml.

26 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 2- Capacidade de Campo a 70 ou 100%?

27 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 3- Irradiados e não irradiados

28 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 4- Solução de Sulfato de Potássio

29 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 5- Agitador Horizontal, 30 minutos.

30 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 6- Filtrar

31 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 7- Pipetar 10 ml do extrato para Erlenmeyer de 125 ml.

32 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 8- Pipetar 2 ml de dicromato de potássio para os Erlenmeyers de 125 ml.

33 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 9- Pipetar 10 ml de ácido sulfúrico, aguardar esfriar e, em seguida acrescentar 50 ml de água deionizada.

34 CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 10- Inserir quatro gotas de phenanthroline (ferroin) e títular com sulfato ferroso amoniacal.

35 Permite: ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA Avaliar a atividade biológica do solo, sendo definida como a produção de CO 2. Quociente Metabólico Corresponde à razão entre o carbono da biomassa microbiana (CBM) e atividade respiratória microbiana (ARM). Reflete processos importantes relacionados às adições e transformações da matéria orgânica. Em situação em que a biomassa experimenta algum fator de estresse (deficiência de nutrientes, acidez, déficit hídrico...).

36 ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 1- Pesar 100 g de solo em vidro.

37 ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 2- Colocar o solo em 100% da capacidade de campo.

38 ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 3- Inserir dois beckers no interior do vidro (1 contendo 20 ml de NaOH e outro com 20 ml de água destilada, vedar a boca do vidro com filme plástico).

39 ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 4- Incubar por, quatro, sete ou dez dias?

40 ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MICROBIANA 5- Adicionar aos Beckers 2 ml de solução de cloreto de bário a 30% e 3 gotas de fenolftaleína a 1%.

41 APLICAÇÕES Figura 4. ARM e CBM em solo sob plantio de milho em manejo convencional, adubado com esterco bovino.

42 APLICAÇÕES Figura 5. qco 2 em solo sob plantio de milho em manejo convencional, adubado com esterco bovino.

43 APLICAÇÕES Figura 6. CBM sob a aplicação a longo prazo de adubo orgânico e mineral, em rotação trigo e milho. Fonte: Chu et al. (2007).

44 CONSIDERAÇÕES FINAIS Obrigado pela atenção!