UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO AF 073- Biotecnologia Vegetal Técnicas Moleculares: PCR, Sequenciamento e Southern Blot Técnicas Sorológicas Prof a. Renata Faier Calegario
ANÁLISE DA PCR Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco 1200pb Rep CP Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A, compreendendo as extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007
PCR Vantagens: - Sensível (fentograma: 10-18 ) - Rápido - Grande n amostras Desvantagens: - Apresenta alguns falsos positivos - Importante controles +/- Branco = sem DNA Controle negativo = planta sadia Controle positivo = amostra conhecidamente positiva
PCR APLICAÇÕES - Detecção de genes em DNA genômico - Clonagem de DNA - Sequenciamento - Evolução molecular - Análise de estrutura genômica - Identificação de mutações - Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas - Análise de plantas transgênicas...
VIDEO SEQUENCIAMENTO
HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex Teste de complementaridade DNA RNA Southern Blot Northern Blot
SOUTHERN BLOT Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico COMO? Sonda: sequência complementar ao DNA alvo Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA Sondas Radioativas = nt 32 P Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica ou quimioluminescente)
SOUTHERN BLOT SONDA: sequência complemetar ao DNA Sequência de interesse DNA genômico Sequência de complementar ao DNA genômico ******** TTCCAGAA Sonda com nucleotídeos marcados
SOUTHERN BLOT 1 Passo: Digerir DNA genômico DNA genômico cortado DNA genômico
SOUTHERN BLOT 2 Passo: Gel Agarose do DNA genômico cortado
SOUTHERN BLOT 3 Passo: Transferência do DNA do gel para membrana de nitrocelulose Gel Agarose com DNA genômico Membrana Nitrocelulose
SOUTHERN BLOT 3 Passo: Transferência do DNA do gel para membrana de nitrocelulose
SOUTHERN BLOT Gel Agarose com DNA genômico TRANSFERÊNCIA
SOUTHERN BLOT 4 Passo: Hibridização da Sonda Sonda
O QUE ACONTECE NA MEMBRANA DNA (-) imobilizado Nucleotídeos marcados P32 Sonda Membrana (+) Revelação Raio X
SOUTHERN BLOT 5 Passo: Revelação
SOUTERN BLOT Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos PCR Cópias do transgene DNA total Hind III Separou o gene Gel - 3hs α 32 P: d-ctp 1 3 3 4 4 4 4 6 6 1 1 6 6 Souther Blot Hibridização 18hs VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja
SOUTERN BLOT Plantas Transgênicas de Batata 1 e 5: Marcador Peso Molecular 2 e 4: DNA total batata transgênica digerido co Eco RI 3: DNA total batata Não-transgênica digerido co Eco RI DNA total digerido Eco RI Southern Blot do gel
SOUTERN BLOT Poucas cópias: Importante para a expressão estável Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação da real interação entre as moléculas Alto número de inserções do transgene: Possibilita rearranjos das inserções que podem levar a perda das mesmas ou ao silenciamento Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo da planta, pelo efeito posicional das inserções
SOUTHERN BLOT Vantagens: Sensibilidade (fentograma) Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma Envio de membranas para outro laboratório Desvantagens: Demorado Caro Perigoso (sondas radioativas)
SOUTHERN BLOT APLICAÇÕES - Importante experimentos de Transformação => Prova molecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal - Bandas com PM diferente do controle + => indicativo de alterações no material genético - Detecta fragmento específico em meio a milhões de fragmentos - Usado para distinguir estirpes de um organismo
4. MÉTODOS SOROLÓGICOS Propriedade proteica Baseado na reação antígeno anticorpo de animais de sangue quente Antígeno: substâncias estranhas ao organismo Anticorpos: são proteínas produzidas pelos glóbulos brancos (linfócitos B) Vírus: atua como antígeno quando inoculado num animal Substância formada em reação ao vírus: anticorpo
4. MÉTODOS SOROLÓGICOS Portanto: O antígeno é a proteína viral = Capa Proteica Anticorpo reconhece a CP Separação dos glóbulos vermelhos Glóbulos Brancos - soro
Anticorpo - IgG Epitopo Sítio de reconhecimento da proteína viral Sítio de reconhecimento da proteína viral Epitopo Região variável Região Invariável
4. MÉTODOS SOROLÓGICOS Detecta Proteína Antissoro ELISA Western Blot Tissue Blot
4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay Extrato Vegetal infectado Indireto Adaptado de Zerbini, 2002 Vírus adsorvido Y Anticorpo 1 imobilizado pelo vírus Y Y-E O anticorpo 2 ligado a enzima reconhece Ac 1 Y Y-E O substrato é adicionado Reação Colorimétrica
4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay Resultado Leitor de Elisa: Mede absorbância (405nm) Absorbância Concentração viral Cor Amarela + -
ELISA: CiLV-C / AS = CP
4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay Vantagens Sensível (1 ng/ml) Rápido Baixo custo Seguro Várias amostras Quantitativo Útil para testes de rotina Desvantagens Não mede infectividade e reação inespecífica
4.2 WESTERN BLOT Extrato vegetal infectado Eletrophoretic protein separation
4.2 WESTERN BLOT Vírus - Enzima: fosfatase alcalina - Quimioluminescente: CSPD ou CDP-star - Colorimétrico: NBT/BCIP
4.2 WESTERN BLOT Western Blot: antissoro contra a CP do CLV-C (1:1000) 1- Proteína Pura 2- Lesões novas 3 e 4 - Lesões mais velhas 5 - Planta Sadia Calegario et al., 2013
WESTERN BLOT Vantagens Membranas podem ser transportadas Pode ser iniciada em campo pelo agricultor Custo moderado Várias amostras analisadas concomitantemente Desvantagens Não mede a infectividade do vírus Apresenta alguns falsos positivos