Variabilidade e tolerância ao cobre em Xanthomonas campestris pv. viticola, agente causal do cancro bacteriano da videira (Vitis spp.

Transcrição

1 Universidade de Brasília Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Fitopatologia Variabilidade e tolerância ao cobre em Xanthomonas campestris pv. viticola, agente causal do cancro bacteriano da videira (Vitis spp.) Eder Marques Dissertação apresentada ao Departamento de Fitopatologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Fitopatologia. Brasília DF 2007

2 Trabalho realizado junto ao Departamento de Fitopatologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília, sob orientação da Professora Dra. Marisa Álvares da Silva Velloso Ferreira, com apoio institucional e bolsa do CNPq. Aprovado por: Profa. Dra. Marisa A.S.V. Ferreira Orientadora Dra. Abi Soares dos Anjos Marques Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Prof. Dr. Carlos Hidemi Uesugi Universidade de Brasília

3 A meu pai Antônio Marques (in memorian), por nossa profissão, pelos exemplos de honestidade e honra Dedico.

4 AGRADECIMENTOS... Inicialmente a Deus pela vida maravilhosa que tenho, pelas vitórias e pela dádiva de estar vivo e poder continuar a sonhar. A profa. Marisa pela oportunidade de trabalho e orientação. A possibilidade de poder ter me aberto ao Amor e vivenciar tudo o que pôde me oferecer. Às mulheres da minha vida: Minha mãe Jacira pelos exemplos de sabedoria, honestidade, dignidade, honra e amor. E minhas irmãs Andréa & Terla, pela simples graça de serem minhas irmãs e por todas as conseqüências desse privilégio. A minhas amigas Iara & Sheila, pelo apoio e amizade sincera. A todos os professores do Departamento de Fitopatologia pelos ensinamentos, em particular ao Prof. Carlos Uesugi pelas dicas e esclarecimentos. Aos colegas de Pós-graduação, especialmente Sarah, Ana Angélica e Caroline pelos bilhetes, risos, furos, mancadas e tantos outros momentos inesquecíveis que passamos juntos nessa fase de nossas vidas. A Loiselene, inicialmente pela amizade, paciência, incentivo, apoio e tantas dicas e ensinamentos que com certeza perdurarão. Aos funcionários do Departamento de Fitopatologia. Em especial a Kamila a quem tenho imensa gratidão pela disposição, amizade e ajuda em numerosos momentos. Aos meus amigos de graduação que persistem em continuar em minha vida, apesar de meu distanciamento. Aos familiares...

5 SUMÁRIO ÍNDICE DE TABELAS i INDICE DE FIGURAS iii RESUMO v ABSTRACT vii CAPÍTULO 1- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA E OBJETIVOS Videira importância Doenças da videira no Brasil Cancro bacteriano da videira Histórico e distribuição geográfica Sintomatologia Etiologia Diagnose Epidemiologia e controle Epidemiologia Medidas de controle Controle cultural Controle químico Controle genético OBJETIVOS CAPÍTULO 2- VARIABILIDADE MOLECULAR EM XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. VITICOLA INTRODUÇÃO OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS Local e período de realização dos trabalhos Isolados bacterianos

6 2.3- Cultivo e preservação dos isolados Caracterização bioquímica de Xanthomonas campestris pv. viticola Reação de hipersensibilidade em plantas de tomate (Lycopersicon esculentum cv. Santa Cruz) Caracterização molecular de Xanthomonas campestris pv. viticola Extração de DNA genômico Quantificação do DNA genômico Identificação com iniciadores ( primers ) específicos rep-pcr ITS-RFLP Amplificação da região ITS Digestão dos produtos de PCR RESULTADOS Caracterização bioquímica Caracterização molecular Identificação com iniciadores ( primers ) específicos rep-pcr ITS-RFLP Amplificação da região ITS Digestão dos produtos de PCR (ITS-RFLP) DISCUSSÃO CAPÍTULO 3- TOLERÂNCIA AO COBRE EM XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. VITICOLA INTRODUÇÃO OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS Isolados bacterianos Metodologia Meio de cultura e produtos utilizados Preparo das suspensões Inoculação e avaliação

7 2.3- Metodologia Meio de cultura e produto utilizado Preparo das suspensões Inoculação e avaliação Detecção e caracterização de seqüências do gene copa em Xanthomonas campestris pv. viticola Amplificação do gene copa Sequenciamento dos produtos de PCR amplificados com os primers copal e copar Análise das seqüências RESULTADOS Metodologia Metodologia Detecção e caracterização de seqüências do gene copa em Xanthomonas campestris pv. viticola Análise com os primers copa Análise das seqüências DISCUSSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS

8 i LISTA DE QUADROS E TABELAS Página Quadro 1: Principais variedades de uvas para porta-enxertos, com sementes e sem sementes utilizadas no Vale do São Francisco. 2 Quadro 2: Produtos químicos mais utilizados em videira no Vale do São Francisco. 16 Quadro 3: Graus de suscetibilidade de variedades e cultivares de videira a Xanthomonas campestris pv. viticola 17 Tabela 1: Designação, origem e ano de coleta dos isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola utilizados neste estudo. 26 Tabela 2: Seqüências dos primers desenhados para a região correspondente ao gene hrpb de Xanthomonas campestris pv. viticola. 29 Tabela 3: Descrição dos primers utilizados para rep-pcr. 31 Tabela 4: Descrição dos primers utilizados na amplificação da região intergênica (16S 23S) do DNA ribossomal. 32 Tabela 5: Caracterização bioquímica e reação de hipersensibilidade em folha de tomate dos isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola procedentes de diferentes áreas e coletados entre 2003 e Tabela 6: Análise de restrição da região ITS do rdna de Xanthomonas campestris pv. viticola com as enzimas HaeIII e MspI, indicando a posição dos sítios de restrição na seqüência e tamanho dos fragmentos gerados. 51 Tabela 7: Designação, origem e ano de coleta dos isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola utilizados no estudo de tolerância ao cobre. 63 Tabela 8: Descrição dos primers desenhados com base nas seqüências do gene copa de Xanthomonas campestris pv. campestris e Xanthomonas axonopodis pv. citri. 66 Tabela 9: Porcentagem do número médio de colônias de Xanthomonas campestris pv. viticola observado em meio MMCC contendo sulfato de cobre em diferentes concentrações em relação ao meio sem cobre. 72

9 ii Tabela 10: Porcentagem do número médio de colônias de Xanthomonas campestris pv. viticola observado em meio MMCC contendo oxicloreto de cobre em diferentes concentrações em relação ao meio sem cobre. 74 Tabela 11: Sensibilidade ao cobre em Xanthomonas campestris pv. viticola expressa em CMI (µg/ml de Cu ++ ), comparando-se áreas de coleta. 75 Tabela 12: Níveis de tolerância de isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola cobre in vitro, segundo metodologia utilizada por Araújo (2001), em meio NA. 76 Tabela 13: Comparação (NCBI BLAST) do gene copa seqüenciado de Xanthomonas campestris pv. viticola com seqüências depositadas no GenBank. 78 Tabela 14: Número médio de colônias de Xanthomonas campestris pv. viticola observado in vitro em meio MMCC contendo sulfato de cobre em diferentes concentrações. 109 Tabela 15: Número médio de colônias de Xanthomonas campestris pv. viticola observado in vitro em meio MMCC contendo oxicloreto de cobre em diferentes concentrações. 110

10 iii LISTA DE FIGURAS Página Figura 1: Cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris pv. viticola, em cv. Red Globe. A- Lesões angulares; B- Escurecimento das nervuras; C- Formação do cancro no caule; D- Lesões na gavinha; E- Necrose nas bagas; F- Seca da inflorescência e G- Lesões na ráquis. 7 Figura 2: Reação de hipersensibilidade induzida por Xanthomonas campestris pv. viticola em folhas de tomate após 24 horas da inoculação. 36 Figura 3: Eletroforese em gel de agarose 1% do produto de PCR obtido com os primers Xcv1F Xcv3R correspondente à região do cluster hrpb de diferentes isolados 37 Figura 4: Análise eletroforética dos fragmentos gerados através de BOX-PCR, a partir de DNA purificado de isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola. 39 Figura 5: Dendrograma baseado no método UPGMA, de acordo com os perfis de amplificação gerada por BOX-PCR. 40 Figura 6: Análise eletroforética dos fragmentos gerados através de ERIC-PCR, a partir de DNA purificado de isolados utilizados de Xanthomonas campestris pv. viticola. 42 Figura 7: Dendrograma baseado no método UPGMA, de acordo com os perfis de amplificação gerada por ERIC-PCR. 43 Figura 8: Análise eletroforética dos fragmentos gerados através de REP-PCR, a partir de DNA purificado de isolados utilizados de Xanthomonas campestris pv. viticola. 45 Figura 9: Dendrograma baseado no método UPGMA, de acordo com os perfis de amplificação gerada por REP-PCR. 46 Figura 10: Dendrograma baseado no método UPGMA, de acordo com os perfis de amplificação gerados por rep-pcr (REP, ERIC e BOX) 48

11 iv Figura 11: Amplificação de fragmentos gerados pelos primers C1 L1 referentes à região espaçadora 16S 23S (ITS) do DNA dos isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola 49 Figura 12: Eletroforese em gel de poliacrilamida a 8 % da região espaçadora 16-23S amplificada pelos primers C1 L1 referentes (ITS) com o DNA purificado de diferentes isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola e produtos digeridos com as enzimas de restrição HaeIII e MspI. 50 Figura 13: Figura 13. Evolução na tolerância ao cobre, expressa pela concentração mínima inibitória em µg/ml Cu ++, de isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola coletados entre os anos de 1998 e Figura 14: Variabilidade na tolerância ao cobre, expressa pela concentração mínima inibitória em µg/ml Cu ++, dos isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola coletados entre os anos de 1998 e Figura 15: Eletroforese em gel de agarose 1 % do produto de PCR obtido com os primers copal copar com DNA de diferentes isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola. 77 Figura 16: Árvore filogenética obtida por Consensus Tree a partir do sequenciamento do gene copa de X. campestris pv. viticola e seqüências depositadas no GenBank de X. campestris. pv. campestris, X. axonopodis pv. citri e X. oryzae pv. oryzae. 79

12 v RESUMO O cultivo de uvas de mesa no Brasil tem se intensificado principalmente em áreas próximas ao Submédio do Vale do São Francisco. Essa região é responsável por 15 % da produção de uvas de mesa finas do país, correspondendo a cerca de 98 % das exportações brasileiras anuais de uva, tanto em volume quanto em valores de produção. Entretanto, muitos são os problemas fitossanitários que ocorrem nessa cultura. Dentre as doenças de etiologia bacteriana apenas o cancro bacteriano, causado por Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), apresenta hoje incidência expressiva e importância econômica em videira. Embora tenha sido relatada em 1998, acredita-se que a bacteriose já estivesse presente na região desde 1996, sem ter sido detectada. Assim torna-se importante monitorar a variabilidade das populações bacterianas ao longo dos anos, o que pode ser conseguido de maneira eficiente utilizando marcadores moleculares. Outro fator a ser considerado é o uso contínuo e muitas vezes indiscriminado de compostos cúpricos na agricultura o que pode levar a ocorrência de bactérias fitopatogênicas ou saprofíticas resistentes ao cobre. Considerando a importância do cancro bacteriano para a viticultura no Brasil e buscando maior conhecimento sobre variabilidade do patógeno e seu comportamento quanto a tolerância aos cúpricos, foram objetivos deste trabalho: (1) Caracterizar a diversidade genética, através de rep-pcr, de isolados de Xcv coletados no Vale do São Francisco, entre os anos de 2003 e 2006, comparando-os aos isolados já caracterizados, coletados entre 1998 e 2001; (2) Determinar níveis de tolerância ao cobre em isolados de Xcv representativos de diferentes épocas (1998 a 2006) e áreas de coleta; (3) Detectar e caracterizar em Xcv a presença de regiões homólogas ao gene copa que confere resistência ao cobre em Xanthomonas spp. Os fingerprints gerados por rep-pcr, a partir do DNA purificado de Xcv coletados em diferentes anos, áreas e variedades de Vitis vinifera L. foram eficientes e reprodutíveis, constituindo-se em uma importante ferramenta no estudo da genética populacional deste patógeno. Os resultados indicaram ter ocorrido uma possível estabilização da população heterogênea observada por Trindade et al. (2005), além de permitir a observação de bandas comuns e perfis homogêneos entre os isolados que podem

13 vi ser utilizados para o diagnóstico. Entretanto, não foi possível correlacionar, através dos estudos das seqüências repetitivas, a origem geográfica, a época de coleta ou a cultivar de origem dos isolados com os perfis genômicos. Nos testes de tolerância in vitro aos íons de cobre, de uma forma geral observou-se uma evolução no crescimento da tolerância ao cobre ao longo dos anos, em que isolados de Xcv foram coletados nas áreas de ocorrência do cancro bacteriano de 1998 a Os resultados do presente estudo confirmam aqueles já relatados anteriormente, de que as estirpes brasileiras apresentaram variabilidade na tolerância ao cobre e que esta tolerância ocorre naturalmente nas regiões produtoras. Araújo (2001) mostrou que essas estirpes mais tolerantes ocorrem na região de Petrolina, e no presente trabalho, demonstrou-se que também ocorrem em outras áreas como Bahia e Piauí. Amplificações com os primers desenhados a partir de seqüências do gene copa de X. axonopodis pv. citri e X. campestris. pv. campestris foram observadas para todos os isolados de Xcv testados. A alta homologia entre os produtos das amplificações com os primers copar e copal a partir do DNA dos isolados de Xcv com o gene cop A, confirmou a existência do gene em Xcv. A árvore filogenética gerada com alta reprodutibilidade mostrou maior distância de Xcv em relação a X. oryzae pv. oryzae e X. campestris pv. campestris e maior proximidade com X. axonopodis pv. citri. Este fato pode ser um indicativo de maior afinidade de X. campestris pv. viticola com a espécie X. axonopodis do que com X. campestris, confirmando as observações de Takita et al. (2004) em trabalho analisando a região rpf.

14 vii ABSTRACT The production of table grapes (Vitis vinifera L.) in Brazil has increased mainly in the irrigated areas of the Submédio of the São Francisco valley, northeastern Brazil. This region is responsible for 15 % of the grape production of the country, corresponding to nearly 98 % of the annual exports. Among the many phytosanitary problems that affect grape production, bacterial canker is the most important bacterial disease affecting several V. vinifera cultivars in that region. The disease is caused by Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv). Although it was reported in 1998, it is believed that it has been present in the region since 1996, without being detected. It is important to monitor the population variability through time, which can be achieved by using molecular markers. Another relevant fact is the continuous, excessive and frequently inadequate use of copper-based fungicides that can lead to resistance in bacteria. Considering the importance of bacterial canker for grape production in Brazil and the lack of information on pathogen variability and its behavior regarding copper tolerance, the objectives of this work were: (1) to characterize the genetic diversity, using rep-pcr, among Xcv strains collected from 2003 to 2006, comparing them to a population already characterized, collected between 1998 and 2001; (2) to determine tolerance levels to copper in Xcv strains, selected to represent different collection years (1998 to 2006) and collection sites; and (3) to detect and characterize in Xcv the presence of homologous regions to the copa gene, which is involved in copper resistance in Xanthomonas spp. The fingerprints generated by rep-pcr using bacterial purified DNA from isolates collected in different years, areas and from different grape cultivars were reproducible and the results indicated lower levels of polymorphism among the isolates collected from than among the isolates previously characterized by Trindade et al. (2005). The profiles were generally very homogeneous and several common bands among isolates were detected. However, it was not possible to correlate geographic origin, collection year or cultivar with the rep-pcr genomic patterns. In vitro tests were conducted to assess tolerance to copper ions in Xcv. The results showed a general increase in copper tolerance from 1998 through 2006 and also showed

15 viii variation in the minimum inhibitory concentration among the isolates. Previous studies demonstrated that this tolerance occurs naturally in the Petrolina region (Pernambuco state). Here we observed variation in tolerance also in isolates from Bahia and Piauí states. PCRamplifications with primers (copar and copal) selected from the copa sequences of X. axonopodis pv. citri and X. campestris pv. campestris were observed for all Xcv isolates. After sequencing of the 925-bp PCR product, high sequence homology between Xcv sequences and those from X. axonopodis citri and X. campestris pv. campestris was observed, thus confirming the presence of the copa gene in Xcv. The phylogenetic analysis showed a closer relationship between Xcv and X. axonopodis pv. citri than with X. oryzae pv. oryzae or X. campestris pv. campestris. This suggests a closer proximity with the species X. axonopodis than with X. campestris, confirming the observations of Takita et al. (2004) when analyzing the rpf gene region.

16 1 CAPÍTULO 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1- Videira importância A família Vitaceae é dividida em várias subfamílias que compreendem um grande número de gêneros e espécies, dentre os quais se destacam as espécies Vitis vinifera L. (de origem européia) e Vitis labrusca L. (de origem americana), que são as mais cultivadas devido às suas características agronômicas superiores (Teixeira & Azevedo, 1996). As uvas finas de mesa são variedades da espécie V. vinifera, em geral, suscetíveis às doenças fúngicas e altamente exigentes em tratos culturais. Todas as variedades exportadas pelo Brasil estão incluídas nesse grupo ou são híbridas entre elas e alguma outra espécie de Vitis (Tavares, 2004). A produção de uvas brasileira destina-se basicamente a vinificação, uvas para mesa, para passas, sucos e doces (Leão, 2000). Apesar da superioridade de produção dos países europeus, o cultivo de uva encontrase espalhado por todos os continentes. No Brasil a viticultura começou por volta de 1553 com a colonização, mas somente no século XIX adquiriu significativa importância econômica devido à intensificação do cultivo de variedades como Isabel, Concord, Goethe e outras americanas (Pommer & Maia, 2003), desenvolvendo pólos vinícolas em São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, impulsionados pelas correntes imigratórias italianas (Leão & Possídio, 2000). Tendo em vista o crescimento das áreas de produção, além da maior participação no mercado internacional, o plantio de uva no Brasil tem se intensificado. Presente no Nordeste brasileiro desde o século XVI (Leão & Possídio, 2000), em regiões como Petrolina PE e Juazeiro BA (Submédio do Vale do São Francisco), a viticultura intensificou-se nesta região na década de 50 com um aumento expressivo de produção na década de 90 sendo responsáveis atualmente por 15 % da produção de uvas de mesa finas do país. A participação da produção dessa região corresponde à cerca de 98 % das exportações brasileiras anuais de uva, tanto em volume quanto em valores de produção. Outras áreas

17 2 como Maringá e Marialva no Norte do Paraná, Jales no Nordeste de São Paulo e o município de Pirapora no Norte de Minas Gerais também começam a se destacar como pólos produtores de uvas de mesa (Lima & Moreira, 2002). Essa expansão da viticultura, especialmente no Vale do São Francisco, se deve a evolução tecnológica (Freire & Oliveira, 2001; Camargo, 2003) em viticultura tropical, fazendo com que a produção de uvas de mesa ocorra durante todo o ano, garantindo além do estabelecimento interno, a exportação em períodos de escassez no mercado internacional (Camargo, 2003). As principais variedades utilizadas no Submédio do Vale do São Francisco estão indicadas no Quadro 1. Quadro 1. Principais variedades de uvas para porta-enxertos, com sementes e sem sementes utilizados no Vale do São Francisco*. Porta-enxertos Com sementes Sem sementes IAC 313 (Tropical) Itália ou Piróvano 65 Perlette IAC 572 (Jales) Piratininga Catalunha IAC 766 (Campinas) Red Globe Superior Sedles SALT Creek Benitaka Centennial Seedless Dodge Ridge Patrícia Flame Seedless Courdec 1613 Alphonse Labllée ou Ribier Vênus Harmony 420-A Dattier de Beritouth Marroo Seedles Paulsen 1103 Christmas Rose --- *Fonte: Leão (2002). Em termos globais a produção mundial de uva de mesa, entre os anos de 1996 a 2004, foi em média de 10 milhões de t/ano. Já a produção brasileira de uva, destinada à mesa, produção de vinho e outros fins industriais, foi de t, no ano de 2004 em uma área colhida de ha. A região Sul apresenta-se como a maior produtora ( t); entretanto, no Sudeste ( t) e no Nordeste ( t) a cultura está em franca expansão (Agrianual, 2005).

18 3 2- Doenças da videira no Brasil Ao longo da história do cultivo de plantas o homem tem sido considerado um dos grandes agentes de dispersão de pragas e doenças. Danos irreparáveis foram causados ao transportar fitopatógenos involuntariamente. Especificamente no caso da videira podem ser citados os exemplos clássicos da introdução do oídio (Uncinula necator De Bary {Shear}) e do míldio (Plasmopara viticola Berk. et Curtis ex. de Bary) na Europa no século XIX. No Brasil exemplos recentes são a ocorrência da doença conhecida como declínio da videira (Eutypa lata Pers.), na região de Jundiaí, São Paulo e da ferrugem (Phakopsora euvitis Ono) com seu primeiro relato no município de Jandaia do Sul PR (Tessmann et al., 2003). Entre as doenças de origem fúngica que afetam a videira pode-se citar: podridão-seca (Botryodiplodia theobromae Pat.); oídio (Uncinula necator); mofo-cinzento (Botrytis cinérea Pers.); antracnose (Elsinoe ampelina Shear); fusariose (Fusarium oxysporum f. sp. herbemontis W.L.Gordon); declínio da videira (Eutypa lata); a ferrugem (Phakopsora euvitis) (Amorim & Kuniyuki, 2005; Tavares, 2004), míldio (Plasmopora viticola) (Tavares, 2004); mancha da folha (Mycosphaerella personata B.B.Higgins); podridão amarga (Greeneria uvicola {Berk. & M.A Curtis} Punith.) e a podridão da uva madura (Glomerella cingulata Stoneman) (Amorim & Kuniyuki, 2005). Entre os nematóides destaca-se o das galhas (Meloydogyne spp.), e entre os vírus, o vírus do enrolamento da folha da videira (Grapevine leafroll-associated vírus); o vírus da folha em leque (Grapevine fanleaf vírus) ou dos entrenós curtos da videira; o vírus do intumescimento dos ramos da videira (Grapevine corky bark disease); doenças das caneluras do tronco da videira (Grapevine stem pitting disease); manchas ou mosaico das nervuras (Grapevine fleck virus) e a necrose das nervuras (Vein necrosis diasease) (Amorim & Kuniyuki, 2005; Tavares, 2004). Dentre as doenças de etiologia bacteriana, apenas duas, causadas por Agrobacterium vitis e Agrobacterium sp., haviam sido descritas até o ano de A formação de galhas induzida pela bactéria não apresenta expressão para a cultura e já foi descrita em parreirais dos estados de Minas Gerais, Rio Grande do Norte, São Paulo e no Submédio do Vale do São Francisco (Lima & Moreira, 2002). Em 1998, uma nova doença, o cancro bacteriano, foi detectada no Vale do São Francisco e apresenta hoje incidência expressiva e importância

19 4 econômica em videira no Brasil. Embora relatada em 1998, acredita-se que a bacteriose já estivesse presente na região desde 1996, sem ter sido detectada (Lima et al., 1999; Lima & Moreira, 2002). 3- Cancro bacteriano da videira 3.1- Histórico e distribuição geográfica O primeiro relato do cancro bacteriano da videira ocorreu na Índia em 1969, na variedade Anab-e-Shahi, causado por uma bactéria classificada inicialmente como Pseudomonas viticola sp. nov. por Nayudu (1972), e posteriormente reclassificada como Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) por Dye, em 1978 (Lima & Moreira, 2002). Em 1998, no pólo Petrolina (PE) Juazeiro (BA) foi identificado em lavouras de cultivo comercial, o segundo relato da bacteriose no mundo (Lima et al., 1999; Malavolta Jr. et al., 1999). As plantas apresentavam sintomas nas folhas, ramos, ráquis e nas bagas. As variedades mais afetadas foram Red Globe e as variedades sem sementes, principalmente aquelas oriundas de Thompson Seedless, com perdas de 10 a 100 % (Lima & Moreira, 2002). Inicialmente em plantios novos (2 3 anos após enxertia) a incidência era de 100 % de plantas infectadas (Lima et al., 1999). Em maio de 1998 sintomas característicos da doença foram observados em ramos e folhas das variedades Red Globe, Itália e Ribier em cultivos comerciais da região de Teresina PI, sendo, portanto, o segundo relato do patógeno no país (Malavolta Jr. et al., 1995a). Entre os anos de 1998 e 1999 o cancro bacteriano já havia sido encontrado em parreirais de vários municípios de Petrolina e Santa Maria da Boa Vista PE, além de outros municípios da Bahia. Inspeções fitopatológicas realizadas no ano de 2001 no Município de Jaguaruana CE comprovaram a ocorrência do cancro bacteriano nas variedades Red Globe, Flame e Superior (Freire & Oliveira, 2001). Em julho de 2006, em plantações de uva de Boa Vista RR, verificou-se a presença de plantas com sintomas de cancro e necrose nas folhas. Testes realizados pelo laboratório de Fitopatologia da Embrapa confirmaram o primeiro relato do cancro bacteriano da videira em Roraima e o quinto relato da bacteriose no Brasil. As plantações de uva em Boa Vista

20 5 têm sido estabelecidas com material propagativo oriundo de Petrolina PE, local de ocorrência da bacteriose e esta pode ter sido a forma de introdução da doença no Estado (Halfed-Vieira & Nechet, 2006). A introdução do patógeno no Brasil ocorreu provavelmente por meio de material propagativo originário da Índia (Malavolta Jr. et al., 1999). Segundo Freire & Oliveira (2001) o patógeno foi introduzido inadvertidamente por produtores do Vale do São Francisco, diretamente da Índia, através de estacas da variedade Red Globe. Estudo de variabilidade genética, realizados por Trindade et al. (2005), mostraram que os isolados brasileiros e o isolado tipo NCPPB 2475, da Índia, possuem perfis genômicos semelhantes, o que suporta a hipótese para esta via de introdução. Com a ocorrência e a elevada incidência do cancro bacteriano, praticamente eliminou-se a produção da variedade Red Globe na Região do Vale do São Francisco (Gava, 2006). O principal prejuízo verificado nas variedades suscetíveis à doença foi à redução na produção. Plantas infectadas, geralmente, produzem cachos com sintomas de cancro no engaço, inutilizando os frutos para a comercialização. Em 1999, 100 ha de videiras em produção foram erradicadas no Vale do São Francisco (Lima et al., 1999). As perdas na região de Petrolina, foram estimadas em mais de 3 milhões de reais em 120 ha (Araújo, 2001). Em levantamento realizado no início do ano de 2004 observou-se a presença de sintomas da doença em 17 de 18 das propriedades visitadas, com incidência variando entre 10 e 100 % nas parcelas amostradas da cv. Festival e entre 92 e 100 % nas áreas com Red Globe (Lopes & Nascimento, 2004). Segundo a Instrução Normativa SDA nº 38, de 14 de outubro de 1999, Xcv é classificada como praga quarentenária A2. As Pragas Quarentenárias A2 são aquelas de importância econômica potencial, já presentes no país, mas que não se encontram amplamente distribuídas e estão sob programa oficial de controle. Essa IN, assim como a Instrução Normativa nº 9 de 20 de abril de 2006 estabelecem medidas de prevenção, controle e erradicação do patógeno.

21 Sintomatologia Nas folhas as lesões são escuras, pequenas (1 2 mm), angulares, distribuídas de forma esparsa (Figura 1), mas podendo ocorrer em grande número ao redor das nervuras ou de ferimentos, circundadas ou não por halo amarelado (Lima & Moreira, 2002). Quando coalescem causam crestamento e destruição de extensas regiões do limbo foliar. Em alguns casos também pode ocorrer formação de manchas setoriais, pardacentas, semelhantes às causadas por Xylophilus ampelinus (Freire & Oliveira, 2001), agente causal da queima da videira, doença ainda não relatada no Brasil (Marques & Fonseca, 2005). Em estádios mais avançados de infecção, as folhas tornam-se amarelas e caem. Mais tarde os sintomas podem surgir nas nervuras principais e nos pecíolos das folhas, como manchas escuras alongadas e irregulares que, sem seguida, evoluem formando cancros. Em ramos verdes, surgem estrias e/ou manchas escuras irregulares, cujas áreas, posteriormente, tornam-se necróticas e com fendilhamentos longitudinais de coloração negra que, com o agravamento da infecção, gradualmente, alargam-se expondo os tecidos internos. A infecção pode atingir o sistema vascular da planta, tornando-se sistêmica. Em corte longitudinal de ramos infectados, principalmente próximos aos cancros, constata-se a presença de descoloração vascular, em uma pequena extensão (Lima & Moreira, 2002). Na inflorescência ocorre necrose e os sintomas podem surgir a partir da extremidade em direção a base. Na ráquis ou engaço dos cachos verificam-se sintomas similares aos observados em ramos, com a presença de manchas escuras e a formação de cancros. Em bagas, podem ocorrer lesões escuras e levemente arredondadas. Em cachos já formados, há murcha de bagas, após necrose da ráquis e dos pedicelos. O ataque da doença é mais intenso nos frutos, quando a infecção ocorre no início da frutificação, e os sintomas são constatados na extremidade dos cachos ou no ponto de inserção do pedúnculo no ramo (Lima & Moreira, 2002).

22 7 A B C D E F G Figura 1. Cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris pv. viticola, em cv. Red Globe. A- Lesões angulares; B- Escurecimento das nervuras; C- Formação do cancro no caule; D- Lesões na gavinha; E- Necrose nas bagas (L.C. Trindade); F- Seca da inflorescência e G- Lesões na ráquis (Lima et al., 1999).

23 8 A severidade dos sintomas da doença varia segundo o nível de tolerância da variedade e segundo condições ambientais. A variedade Red Globe e algumas variedades sem sementes, principalmente aquelas oriundas de Thompson Seedless, mostram-se mais suscetíveis. Focos da doença também foram identificados nas variedades Itália, Festival, Brasil, Piratininga, Patrícia, Benitaka, Ribier, Superior e Catalunha, entretanto com incidência variável, sobretudo em Itália e Benitaka, que apresentaram, inicialmente, maior tolerância a doença, quando comparadas às outras variedades (Lima & Moreira, 2002). No Submédio do São Francisco, a incidência e a severidade da doença em variedades suscetíveis tem sido maior no primeiro semestre do ano, devido à ocorrência de chuvas, condição que propicia a disseminação e a penetração da bactéria na planta. Operações que ocasionam ferimentos nas plantas, como desbrota e poda, realizadas nesse período, podem favorecer a ocorrência da doença em variedades suscetíveis. O período seco é o mais propício para o manejo (Lima & Moreira, 2002) Etiologia O agente causal do cancro bacteriano da videira foi inicialmente identificado através de testes bioquímicos, fisiológicos e de patogenicidade e classificado como Pseudomonas viticola sp. nov. (Nayudu, 1972). Posteriormente Dye (1978) propôs alterações na classificação designando-a como Xanthomonas campestris pv. viticola (Nayudu) Dye. Considerando a nomenclatura proposta por Vauterin et al. (1995; 2000), o patógeno deve ser referido como X. sp. pv. viticola (Nayudu) Vauterin et al., uma vez que Xcv não foi incluída no sistema de reclassificação proposto, em Garrity et al. (2005) classificam Xcv no Domínio Bacteria, Classe Gammaproteobacteria, Ordem Xanthomonadales, Família Xanthomonadaceae e Gênero Xanthomonas, mas dentro das espécies incertas. Em trabalho realizado analisando-se a região rpf (Regulação de Fatores de Patogenicidade) na diferenciação de espécies de Xanthomonas, Takita et al. (2004) observaram que Xcv não apresentou esta região, mostrando maior similaridade com X. axonopodis pv. citri, sendo dessa forma agrupada com outras espécies de Xanthomonas. Os autores concluíram que Xcv não pertence ao grupo de patovares de X. campestris.

24 9 Apesar de pertencer ao gênero Xanthomonas, Xcv não produz o pigmento xanthomonadina. Apresenta células em forma de bastonete, medindo de 1,2 a 2,5 µm (Nayudu, 1972), monocapsuladas, possuindo apenas um flagelo polar. As colônias são arredondadas, apigmentadas, convexas, brilhantes e de bordos lisos em meio agar-nutritivo, oxidativas e gram negativas. Xcv não produz pigmento fluorescente em meio King s B e não apresenta atividade de urease e oxidase, além de não utilizar asparagina como única fonte de carbono e nitrogênio, nem apresentam inclusões de poli-β-hidroxibutirato. A tolerância a NaCl varia entre 1 a 2 %, segundo (Lima et al., 1999), entretanto Nascimento et al. (2005a) verificaram que cresce em até 3 %, sendo que a 6 % é letal. Xcv cresce bem em sais de amônio e ácido glutâmico, embora seu melhor crescimento seja em caseína hidrolisada (Nayudu, 1972). Produz ácidos a partir de glucose, manose, galactose, trealose, celobiose e frutose (Lima et al., 1999), mas não de dulcitol, glicerol, m-inositol, lactose, rafinose e sorbitol. Malavolta Jr. et al. (1999) não detectaram a produção de ácidos a partir de celobiose. Seu crescimento médio se dá por volta de 48 a 72 h, a 28 ºC 33 ºC, não crescendo a 41 ºC (Malavolta Jr. et al., 1999; Lima et al., 1999). Nascimento et al. (2005a) verificou um crescimento ótimo entre ºC, não crescendo a 40 ºC. O ph ótimo é de 7,5. A reação de hipersensibilidade é negativa em folhas de fumo (Nicotiana tabacum cv. White Burley), mas positiva em folhas de tomate (Lycopersicum esculentum cv. Santa Clara) (Malavolta Jr. et al., 1999) Diagnose A diagnose do cancro bacteriano da videira pode ser realizada com base na avaliação dos sintomas, isolamento em meio de cultura, realização de testes bioquímicos e testes de patogenicidade. Esforços estão sendo feitos no sentido de se desenvolver métodos de diagnóstico mais eficientes para a bacteriose, tais como métodos moleculares e imunológicos. Nesse sentido, Araújo et al. (2005) produziram anticorpos policlonais que se mostraram altamente reativos contra o patógeno, podendo ser empregados no diagnóstico da doença. Paralelamente, Trindade et al. (2007) desenvolveram um método de detecção molecular de

25 10 Xcv a partir do sequenciamento parcial do gene hrpb e posterior seleção de oligonucleotídeos iniciadores ( primers ) para uso em PCR (reação em cadeia da polimerase) Epidemiologia e controle Epidemiologia O cancro bacteriano da videira é uma doença nova na cultura da videira no Brasil, tendo sido relatada apenas na Índia, onde não tem causado grandes prejuízos (Nascimento & Mariano, 2004). Apesar da importância dessa bacteriose, os primeiros estudos epidemiológicos no Brasil, foram realizados recentemente por Nascimento et al. (2005b), que propuseram uma escala diagramática para avaliação dos sintomas e severidade da doença. Segundo Robbs & Neto (1999) a infecção de Xcv ocorre por meio de aberturas naturais ou micro injúrias nos tecidos ainda verdes do filoplano de V. vinifera. A bactéria sobrevive de um ciclo para o outro em plantas infectadas, ou como epifítica em órgãos da parte aérea de plantas, em condições de umidade e temperaturas elevadas. Além de infectar videira, Xcv também infecta naturalmente plantas de neem (Azadirachta indica, Meliaceae), Phyllanthus maderaspatensis (Euphorbiaceae) (Nayudu, 1972). Em trabalho de levantamento do cancro bacteriano da videira em parreirais do Submédio do Vale do São Francisco também se observou infecção natural de Xcv em plantas invasoras como Alternanthera tenella, Amaranthus sp., Glycine sp., Senna obtusifolia, Mormordica charantia e Phyllanthus sp. (Peixoto et al., 2006). No Brasil inoculações artificiais em mangueira (Mangifera indica), cajueiro (Anacardium occidentale), cajá-manga (Spondias dulcis), umbuzeiro (Spondias tuberosa) e aroeira (Schinus terebenthifolius) resultaram em infecções características, apesar de infecções naturais não terem sido registradas nessas espécies (Araújo et al., 1999). Em plantas de neem foram observadas lesões necróticas, sendo possível o reisolamento da

26 11 bactéria em cultura pura (Moreira et al., 2006). Também a partir de inoculações artificiais Peixoto et al. (2006) observaram sintomas típicos do cancro em plantas invasoras como Chamaesyce hirta (erva-de-santa-luzia), Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd (capim-péde-galinha), Eragrostis pilosa (capim-meloso), Euphorbia prostata (quebra-pedra rasteiro) e Pilea sp. (madrepérola). Por outro lado, Braga & Ferreira (2000) não observaram sintomas da doença inoculando-se artificialmente a bactéria em plantas de fumo, cebola, tomate, beterraba, cenoura, repolho, pepino, soja, feijão e alface. Dessa forma, o neem aparece como um hospedeiro alternativo do patógeno que pode servir como fonte de inóculo. Na Índia, o neem também é utilizado como quebra-vento e seu extrato como inseticida natural. A infecção desta planta por Xcv leva a manchas foliares e cancros em ramos e pecíolos, sintomas semelhantes aos observados em videira (Lima & Moreira, 2002). A maioria dessas espécies potencialmente hospedeiras de Xcv ocorrem naturalmente no Submédio do São Francisco, outras são amplamente cultivadas em todas as regiões como a mangueira (Lima & Moreira, 2002). Robbs & Neto (1999), levantaram a possibilidade de um ciclo epifítico de Xcv em mangueiras, devido às semelhanças na sintomatologia e epidemiologia entre Xcv e X. campestris pv. mangiferaeindicae. As principais fontes de inóculo são células bacterianas liberadas dos cancros e veiculadas por meio de gotas de água a média e curta distâncias, infectando tecidos suscetíveis que surgem em função da poda. Tais cancros representam importante nicho de sobrevivência, onde o patógeno permanece latente e inerte na estação seca, passando a exsudar abundantemente com as chuvas (Robbs & Neto, 1999). A disseminação da bactéria também pode ocorrer através de restos de cultura infectados e deixados no pomar. Da mesma forma, pode ser veiculada em roupas, veículos, contentores, tesouras, canivetes e luvas não desinfestados utilizados na colheita de frutos de plantas doentes. Tratos culturais como desbrota, poda, raleio de bagas, colheita, torção de ramos, capina, gradagem, roçagem, pulverizações e aplicação de herbicidas por barra favorecem a disseminação da bactéria no parreiral. A irrigação do tipo sobrecopa, tais como, a aspersão convencional e pivô central também favorecem a distribuição da doença (Nascimento & Mariano, 2004).

27 12 Apesar do curto período chuvoso na região do Submédio São Francisco, a disseminação da bactéria ocorre mais rapidamente e a infecção pode ser mais intensa durante esse período. O vento seco não dissemina a bactéria, sendo necessário sempre a presença de água. A transmissão do cancro bacteriano dentro do pomar pode ocorrer mais rapidamente que entre pomares. Todos os agentes de ferimentos são importantes para a penetração de bactéria destacando-se os tratos culturais e ventos fortes (Lima & Moreira, 2002). Após a penetração, a bactéria multiplica-se rapidamente colonizando os espaços intercelulares e atingindo o sistema vascular, sendo transmitida a todos os órgãos da planta (Nascimento & Mariano, 2004). Fatores como temperaturas em torno de 25 a 30 C e alta umidade relativa do ar proporcionam condições favoráveis ao desenvolvimento do patógeno. Nascimento et al. (2000) observaram que mesmo após a eliminação da parte aérea, de plantas da cv. Red Globe infectadas com Xcv, os ramos emitidos após brotação apresentavam sintomas da doença caracterizando a infecção latente em porta-enxertos da cv. Tropical 572, até então não relatado. No mesmo ano Lima & Ferreira observaram que plantas da cv. Red Globe enxertadas com Tropical 576 com 100 % de infecção de Xcv apresentavam infecção latente dos porta-enxertos. Observaram também que as plantas mesmo após recepa, eliminando a copa suscetível, e posterior enxertia com a mesma cultivar, a doença reincidia. Os sintomas em variedades suscetíveis são observados após a primeira poda, na floração, início da frutificação na fase de chumbinho, no raleio das bagas e, em alguns casos, na maturação dos cachos e na fase de repouso (Lima & Moreira, 2002). Araújo (2001) propôs que a fase parasítica de Xcv ocorre no período chuvoso no semi-árido do São Francisco, período que vai de novembro a março, quando surgem sintomas foliares permanentes, fornecendo fonte de inóculo para a disseminação local. Na estação seca não se observam sintomas devido ao fato de que o patógeno sobrevive protegido no interior dos tecidos vegetais e/ou como epífita (residente) sobre as folhagens da videira. O patógeno pode ser disseminado a longas distâncias introduzido em parreirais isentos da doença, veiculado por mudas ou bacelos infectados, os quais irão originar plantas

28 13 doentes (Araújo, 2001), tanto em material de copa como de porta-enxerto (Lima & Moreira, 2002). Ramos e folhas de videira com e sem sintomas do cancro, revelam intensa colonização de Xcv (Araújo et al., 2004). Observações feitas ao microscópio eletrônico de varredura permitiram confirmar que as células bacterianas aderem aleatoriamente às superfícies vegetais por meio de fixação apolar em monocamada, raramente formando agregados e que maior freqüência dessa adesão ocorre sobre nervuras e tricomas, no limbo foliar. Assim, pressupõe-se que, uma vez as bactérias atingindo um sítio favorável, sua habilidade de resistir à remoção constitui-se em vantagem seletiva, sendo responsável pelo aumento e estabilidade da população residente (Araújo, 2001). Essas populações constituem importante fonte de inóculo do patógeno. Tecidos internos de folhas, ramos e pecíolos mostram perda de integridade celular devido à presença de matriz polissacarídica. Esta observação pode ser um indicativo da formação de biofilmes (Costerton et al., 1995) em Xcv o que poderá ser investigado em estudos futuros. Através da imunomarcação com partículas de ouro, Araújo e colaboradores (2004) verificaram a presença de densa massa bacteriana nos tecidos do parênquima xilemático, levando a uma maceração dos tecidos devido à desfibrilação da parede celular do hospedeiro, o que ocasiona um congestionamento de água nos tecidos infectados. Com o progresso da doença o patógeno multiplica-se nos espaços intercelulares, alcançando o parênquima, feixes vasculares do xilema e floema adjacentes caracterizando a colonização sistêmica da bactéria Medidas de controle O manejo para esta doença é complexo devido à ausência de produtos registrados (Gava, 2006). A fase crítica para estabelecer estratégias para o manejo do cancro da videira é a época das chuvas, quando os parreirais devem estar protegidos (Nascimento & Mariano, 2004). A Embrapa Semi-Árido propôs a implantação do monitoramento de doenças na cultura da uva no Submédio do Vale do São Francisco, visando reduzir os prejuízos

29 14 provocados por patógenos aumentando, assim, as chances de sucesso das medidas de controle e a racionalização no uso de agrotóxicos pela redução no número de aplicações (Tavares et al., 2001) Controle cultural A recomendação de manejo em pomares já afetados é feita com base em práticas que visam interferir no ciclo da doença, principalmente na sobrevivência e disseminação da bactéria (Mariano, 2006). Material propagativo e mudas constituem os meios mais eficientes de disseminação do cancro bacteriano, principalmente a longas distâncias, o que reforça a necessidade de rigorosa inspeção fitossanitária. Além disso, outras exigências fitossanitárias são feitas, pela Instrução Normativa nº 09 de 20 de abril de 2006, como medidas de prevenção, controle e erradicação de Xcv e fixação de normas sobre exigências, critérios e procedimentos, tais como: a. Coleta de material contaminado para diagnóstico em laboratório oficial; b. Se confirmada a incidência da bactéria, aplicar medida de erradicação (poda drástica ou eliminação total das plantas); c. Tratamento das plantas podadas com 0,1 % de cobre metálico; d. Inspeções periódicas em plantas remanescentes ou circunvizinhas as podadas e/ou erradicadas a cada 8 dias, durante 60 dias; e. Cumpridas as exigências deve-se liberar as áreas focos; f. Obediência à legislação de sementes e mudas quanto a produção de material propagativo; g. Proibição do trânsito de plantas de videira e suas partes das propriedades ou talhões onde for constatada a doença; h. Adoção de exigências para variedades e cultivares suscetíveis a bacteriose, tais como: Material para enxertia sem sintomas; Viveiros cercados e com pédilúvio na entrada; Restrição de pessoas estranhas ao interior do viveiro;

30 15 Desinfecção de equipamentos e ferramentas com álcool iodato; i. Para mudas certificadas (com CFO Certificado Fitossanitário de Origem) observa-se o seguinte: Produção em ambiente protegido; Laudo laboratorial para ausência de Xcv. A verificação da ocorrência da doença no parreiral nos estágios iniciais facilita o seu manejo. O parreiral deve ser mantido sem plantas invasoras visando eliminar possíveis hospedeiros alternativos do patógeno (Lima, 2002). A poda de produção, cuja finalidade é assegurar a regularidade das colheitas em quantidade e qualidade, mantendo a planta em equilíbrio vegetativo, deve ser programada de modo a evitar que os estádios compreendidos entre brotação e chumbinho coincidam com o período de chuvas. Na Índia podas de cultivo a partir da segunda semana de outubro possibilitam um maior escape da doença nas áreas produtoras (Chand et al., 1991). Outras medidas que devem ser consideradas no controle da doença são o desbaste e o raleio (Mariano, 2006) Controle químico Como citado anteriormente, o manejo da doença torna-se muito complexo devido a ausência de produtos registrados (Gava, 2006). Entretanto, recomenda-se a aplicação preventiva de compostos cúpricos (Malavolta Jr. et al., 1999). Dessa forma, muitos ensaios com termoterapia de bacelos, indutores de resistência e antibióticos buscam alternativas de manejo da doença para as regiões produtoras (Lopes, 2006). Na região do Vale do São Francisco (Pólo Petrolina Juazeiro) recomenda-se a aplicação de vários produtos fungicidas/bactericidas (Quadro 2), tais como: Kasumin, combinação de Manzate + oxicloreto de cobre, Cuprozeb e combinação de Midas + Kocide. Vale ressaltar ainda que esses produtos não são utilizados exclusivamente no controle do cancro bacteriano. Os produtores visam controlar doenças fungícas, como o oídio, o que indiretamente auxilia no controle do cancro bacteriano (comunicação pessoal).

31 16 Quadro 2. Produtos químicos mais utilizados em videira no Vale do São Francisco (comunicação pessoal). Produto Composição Classe Grupo químico Kocide* Hidróxido de cobre Fungicida/bactericida Cúrprico Hokko Kasumin Cloridrato de Kasugamicina Fungicida/ Bactericida Antibiótico Manzate Mancozeb Fungicida Ditiocarbamato Cuprozeb Oxicloreto de cobre + Mancozeb Fungicida Midas Famoxadone + mancozeb Fungicida *Dados referentes aos produtos, fonte: Andrei (2005). Cúprico e ditiocarbamato Oxazolidinedionas e ditiocarbamato Controle genético A utilização de variedades resistentes é ainda um dos métodos mais eficientes para controle de fitobacterioses. Chand (1992), buscando fontes de resistência genética em videiras a Xcv, testou 14 espécies de Vitis ; espécies de sete gêneros pertencentes à família Vitaceae e 73 cultivares de V. vinifera e V. labrusca em condições de infecção natural e inoculação artificial. V. vinifera se mostrou altamente susceptível, enquanto outros gêneros, tais como, Ampelocissus sp., Ampelopsis sp., Cissus sp. e Leea sp. e algumas espécies de Vitis como V. champini, V. rupestris, V. candicans e V. cinerea foram altamente resistentes. Cultivares sem sementes de V. vinifera foram mais suscetíveis quando comparados a cultivares com sementes.

32 17 Na avaliação de genótipos de videira quanto à resistência a Xcv, Aguiar et al. (2001) observaram que dentre as variedades testadas, as que apresentaram menor índice de infecção foram V. shuttleworthis, Seyne Villard e V. jacquemonti. Malavolta Jr. et al. (2003) avaliaram a reação de variedades de videira pertencentes às espécies Vitis vinifera e V. labrusca x V. vinifera (híbrido) a Xcv, por meio de inoculações artificiais. As avaliações foram realizadas através de escala de notas variando de 0 a 4, trinta dias após a inoculação, e mostraram que as variedades avaliadas diferiram quanto ao grau de resistência à bactéria. Os híbridos de V. labrusca x V. vinifera (Niagara Branca e Niagara Rosada) destacaram-se pelos baixos índices de severidade de doença apresentados e as variedades de V. vinifera (Red Globe, Benitaka, Rubi e Itália) mostraram os maiores índices de severidade de doença. Em valores absolutos, o maior índice de severidade foi apresentado pela variedade Red Globe. Mesmo sendo as variedades de V. vinifera as mais suscetíveis a esse patógeno, os resultados mostraram que esse patógeno também pode infectar os híbridos de V. labrusca x V. vinifera. A Instrução Normativa nº 09, de 20 de abril de 2006, informa sobre os graus de suscetibilidade para Xcv nas diferentes variedades de videira (Quadro 3). Quadro 3. Graus de suscetibilidade de variedades e cultivares de videira a Xanthomonas campestris pv. viticola*. Cultivares Grau de suscetibilidade Red Globe alto Thompson médio Benitaka médio Festival médio Sonaka médio Itália médio Rubi médio Niagara Rosa baixo Niagara Branca baixo Princês baixo *Fonte: Instrução Normativa nº 09, de 20 de abril de 2006

33 18 OBJETIVOS O cancro bacteriano é hoje uma das doenças mais importantes para a viticultura no Brasil. Desde 1998, o Laboratório de Fitopatologia da UnB tem mantido uma Coleção de isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola, visando sua caracterização e o monitoramento da sua variabilidade na região ao longo do tempo. Desta forma, buscando maior conhecimento sobre variabilidade do patógeno e seu comportamento quanto a tolerância aos cúpricos, produtos que vem sendo amplamente empregados no controle da doença, foram objetivos deste trabalho: (1) Caracterizar a diversidade genética de isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola coletados entre os anos de 2003 e 2006, comparando-os aos isolados já caracterizados, coletados entre 1998 e (2) Determinar níveis de tolerância ao cobre em isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola representativos de diferentes épocas, de 1998 a 2006 e áreas de coleta. (3) Detectar e caracterizar, em Xanthomonas campestris pv. viticola, a presença de regiões homólogas ao gene copa que confere resistência ao cobre em Xanthomonas spp.

34 19 CAPÍTULO 2 VARIABILIDADE MOLECULAR EM XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. VITICOLA 1- INTRODUÇÃO No Brasil observa-se um grande crescimento da viticultura e expansão da fronteira agrícola para novas áreas, tais como a região do Vale do São Francisco, que já se destaca atualmente como pólo produtor da viticultura tropical (Freire & Oliveira, 2001; Camargo, 2003). Com a expansão da produção de uvas aumenta também a importância das doenças que ocorrem nessa cultura. Dentre as várias doenças, o cancro bacteriano causado por Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), tem se destacado tanto pelos prejuízos causados quanto por sua distribuição, restrita a somente algumas regiões produtoras no nordeste brasileiro. A publicação da estrutura do DNA é considerada como umas das sete maiores descobertas científicas da História. A partir de então técnicas avançadas foram desenvolvidas, compondo o que é conhecido hoje como a Biotecnologia Moderna. A cultura da videira, assim como muitas outras culturas, beneficiaram-se das tecnologias surgidas com esta descoberta e atualmente experimenta o estágio de investigação em escala genômica (Ravers, 2003). Com o advento da técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), descrita por Saiki et al. (1988), que utiliza a amplificação enzimática in vitro direcionada por primers na síntese de milhões de cópias de uma seqüência nucleotídica (Batista, 1993), foi possível o desenvolvimento de muitas ferramentas, entre elas os marcadores moleculares, possibilitando a caracterização, facilitando a pesquisa na avaliação da diversidade genética de populações de microrganismos (Louws et al., 1999). As tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar pontos de referência nos cromossomos, tecnicamente denominados de marcadores. Um

35 20 marcador é todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso. Diversas técnicas de biologia molecular estão disponíveis hoje para a detecção de variabilidade genética ao nível de seqüência de DNA, ou seja, para a detecção de polimorfismo genético (Ferreira & Grattapaglia, 1995). Dessa forma a diversidade de grandes populações pode ser avaliada de maneira relativamente eficiente utilizando marcadores. Segundo Louws et al. (1999) a diversidade se refere ao grau de variação genética dentro de populações bacterianas. Os estudos de diversidade baseada em PCR são geralmente realizados com primers universais que geram fingerprints (impressões digitais). Três protocolos têm sido comumente empregados para fingerprints em fitobactérias: primers arbitrários ou randômicos que amplificam regiões polimórficas do DNA (AP-PCR e RAPDs Random Amplified Polymorphic DNA) (Louws et al., 1999), e baseados em seqüências repetitivas (rep-pcr) (Versalovic et al., 1991). Os estudos de homologia de DNA e o sequenciamento do DNA ribossomal formam a base para diferenciação e classificação de bactérias ao nível de espécie. Entretanto, a análise da seqüência 16S RNA mostra variabilidade limitada e não tem resolução suficiente para diferenciamento de todas espécies. Em contrapartida, a alta correlação entre estudos de homologia de DNA-DNA, rep-pcr e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) sugere que estes métodos podem ser considerados como uma ferramenta na sistemática bacteriana (Rademaker et al., 2005). A análise de rep-pcr foi desenvolvida com base na ocorrência de seqüências repetitivas conservadas denominadas: REP (Repetitive Extragenic Palindromic), ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus), e elementos BOX, distribuídas ao longo do genoma de diversas bactérias. Os protocolos são chamados de REP, ERIC e BOX-PCR, respectivamente, e rep-pcr em geral (Louws et al., 1994). Essas regiões conservadas estão amplamente distribuídas em isolados fitopatogênicos de Xanthomonas e Pseudomonas. Utilizando os primers REP, ERIC e BOX em isolados pertencentes a esses gêneros, Louws et al. (1994) observaram que a distribuição dessas seqüências reflete sua estrutura genômica, além de ser uma técnica simples e reprodutível na identificação e classificação de isolados desses gêneros. De Bruijn et al. (1996) consideram rep-pcr um método simples e altamente reprodutível na distinção

36 21 de isolados relacionados, na dedução de relações filogenéticas e nos estudos da diversidade em uma variedade de ecossistemas. As possíveis funções destas seqüências ainda são discutidas, entretanto algumas podem ser consideradas, tais como: degradação do RNA mensageiro (estabilização), estrutura cromossômica, recombinação (Stern et al., 1984) e regulação da expressão gênica (Higgins et al., 1982). Outros estudos sugerem que estas seqüências estão também envolvidas na ligação de proteínas específicas da DNA polimerase I (Gilson et al., 1990) e DNA girase (Yang & Ames, 1988). Entretanto, como citado anteriormente a função real destes elementos repetitivos ainda é um enigma (Rademaker et al., 2005). As seqüências nucleotídicas conservadas chamadas de REP foram descritas pela primeira vez em Escherichia coli e Salmonella typhimurium (Higgins et al., 1982) ocupando até 1 % de seus genomas (Stern et al., 1984). Também são referidas como PUs (Palindromic Units) (Gilson et al., 1990). Estas seqüências possuem mais ou menos 35 nucleotídeos, na região central uma inversão repetida e podem ocorrer isoladamente ou em múltiplas cópias adjacentes (Stern et al., 1984). A segunda família de elementos conservados ERIC, também conhecidas por Intergenic Repeat Units (IRUs), também foram descritas inicialmente em regiões intergênicas dos cromossomos de E. coli e S. typhimurium, entre outras espécies (Sharples & Lloyd, 1990). Apresenta uma seqüência de 126 pb e também uma seqüência central invertida, além de características semelhantes ao REP, apesar de a seqüência nucleotídica ser completamente diferente. Sua localização é variável entre as espécies (Hulton et al., 1991). A função especifica dessas seqüências ainda á discutida (Hulton et al., 1991; Sharples & Lloyd, 1990). Os elementos BOX consistem de várias combinações de três subunidades: BOX A, BOX B e BOX C, com 59, 45 e 50 nucleotídeos, respectivamente, e foram descritos primeiramente em Streptococcus pneumoniae (Martin et al., 1992). Estudos realizados por Koeuth et al. (1995) indicam que a subunidade BOX A parece ser conservada em muitas espécies bacterianas, demonstrando a utilidade dessas seqüências repetitivas no estudo em microrganismos. Podem estar relacionados com processos de transformação ou virulência, ou seja, como elementos regulatórios em S. pneumoniae (Martin et al., 1992).

37 22 A aplicação do rep-pcr como uma ferramenta exclusiva na definição de espécies não é aconselhável. Em contrapartida, os dados gerados pela técnica de rep-pcr permitem uma avaliação detalhada da diversidade genética a níveis sub-específicos. Com isso podem ser gerados bancos de dados de padrões genômicos que podem ser utilizados para comparação (Rademaker et al., 2005). Como rep-pcr é um método utilizado na distinção de isolados relacionados, na dedução de relações filogenéticas e no estudo da diversidade genética, muitos trabalhos reportam essa utilidade em vários gêneros e espécies bacterianas, tais como: na identificação e classificação de isolados de Rhizobium meliloti e outras bactérias de solo (De Bruijn, 1992); na diferenciação de isolados relacionados de Bradyrhizobium japonicum (Judd et al., 1993); na identificação e classificação de isolados de Xanthomonas e Pseudomonas (Louws et al., 1994); na análise da diversidade genética de Ralstonia solanacearum (Horita & Tsuchiya, 2000); e na diferenciação de fontes humanas e animais de contaminação fecal com E. coli (Dombek et al., 2000). Visando confirmar e refinar o esquema de classificação atual de X. translucens e identificar novos isolados de aspargo ornamental, Rademaker et al. (2006) utilizaram perfis de rep-pcr. Os perfis gerados foram comparados com perfis de um banco de dados englobando vários outras patovares. Este estudo facilitou a caracterização e diferenciação dos isolados de aspargos como X. translucens pv. undulosa, além da redefinição de várias outras patovares. Ainda no gênero Xanthomonas, Kaur et al. (2005) utilizou rep-pcr, entre outras técnicas, para elucidar a estrutura populacional e o relacionamento intrapatovar de isolados bacterianos de diferentes partes da Índia de X. axonopodis pv. cyamopsidis, agente causal da ferrugem em feijão de corda. Em seus estudos puderam observar uma variação tanto na patogenicidade quanto na estrutura genética da população, sendo que o alto grau de variação genética revelado pelos marcadores deve ser considerado na procura por fontes de resistência. Além disso, nenhuma correlação pode ser observada com respeito a área de coleta, sugerindo que o patógeno foi difundido por meio de germoplasma contaminado. Isolados de Xanthomonas de alho foram caracterizados por Gent et al. (2004) utilizando várias técnicas, incluindo rep-pcr. Os perfis genômicos gerados pela técnica

38 23 foram altamente conservados e representaram uma forte ferramenta na investigação da disseminação de X. axonopodis pv. allii por sementes entre diferentes regiões produtoras. A diversidade genética de X. campestris pv. vitians foi avaliada com várias técnicas, entre elas a de rep-pcr por Barak & Gilbertson (2003). A análise com o marcador mostrou que a população estudada foi homogênea, e que pode ser distinguida de outras patovares. Visando comparar técnicas de fingerprints genômicos, como AFLP e rep-pcr, com estudos de homologia de DNA-DNA no gênero Xanthomonas, Rademaker et al. (2000) observaram uma alta correlação entre as diferentes técnicas de fingerprints, uma vez que revelaram uma alta correlação filogenética e genotípica dos organismos. Com isso esses padrões podem ser utilizados na determinação da diversidade e na estrutura filogenética das populações bacterianas. Em X. fragariae, rep-pcr também foi útil na identificação de isolados de campo, sendo considerado uma ferramenta no desenvolvimento de métodos de detecção a ser utilizado na produção de mudas de morango livres da doença (Opgenorth et al., 1996). Para isolados de X. campestris pv. vesicatoria, rep-pcr foi utilizada por Louws et al. (1995). A técnica permitiu identificar quatro genótipos distintos em meio a isolados não identificados dessa patovar. Uma caracterização molecular de 41 isolados de X. campestris pv. viticola, coletados entre 1998 e 2001, foi realizada por Trindade et al. (2005) e estes foram comparados através da análise combinada dos padrões obtidos com os primers REP, ERIC e BOX. Observouse alta similaridade entre a maioria dos isolados de Xcv e foi possível distinguí-los de isolados de outras patovares de Xanthomonas. O polimorfismo observado com a técnica permitiu a diferenciação de cinco subgrupos entre os isolados brasileiros, sem nenhuma correlação com a cultivar de origem, local ou época de coleta. Além do rep-pcr, outra técnica que pode ser empregada na identificação de isolados e caracterização da diversidade genética em fitobactérias é o ITS-PCR, que consiste na utilização de primers conservados dos genes ribossomais 16S e 23S para amplificar os espaços transcritos internos (Jensen et al., 1993). A região ITS entre os genes 16S e 23S do rrna pode incluir vários genes do trna e regiões não codificadas (Louws et al., 1999). Para a definição genômica de espécies e estudos de diversidade genética, utiliza-se a amplificação por PCR (ITS-PCR) e posterior restrição com endonucleases (RFLP

39 24 Restriction Fragment Lenght Polymorphism). A técnica de RFLP faz uso de enzimas de restrição para fragmentar o DNA (Batista, 1993). As enzimas de restrição também chamadas de endonucleases de restrição, reconhecem uma seqüência de bases específica na dupla hélice de DNA e cortam ambas as fitas, em sítios determinados. A utilização de análises do rdna amplificado aliadas à análise de restrição tem sido relatada em vários trabalhos. O relacionamento filogenético entre 77 isolados bacterianos de Pseudomonas syringae e Pseudomonas viridiflava foi avaliada por RFLP dos genes rrs e rrl e da região ITS1. A técnica de ITS-RFLP permitiu observar que P. syringae pv. tomato formam um grupo homogêneo que é filogeneticamente distinto de outras patovares e da espécie P. viridiflava (Manceau & Horvais, 1996). OBJETIVOS Considerando a ocorrência do cancro bacteriano da videira no Brasil desde 1998, os prejuízos causados por esse patógeno e a importância em se monitorar a variabilidade das populações ao longo dos anos, foram objetivos deste trabalho: (1) Caracterizar, através da técnica de rep-pcr, 27 isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola coletados entre os anos de 2003 e 2006 e compará-los com isolados já caracterizados por Trindade et al. (2005). (2) Confirmar a variabilidade observada com o uso de outro marcador molecular, o ITS- RFLP.

40 25 2- MATERIAL E MÉTODOS 2.1- Local e período de realização dos trabalhos Os trabalhos foram conduzidos no Laboratório de Fitopatologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília, de outubro de 2005 a março de Isolados bacterianos Os isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola foram obtidos de amostras de videira coletadas na região do Vale do São Francisco e/ou recebidas para análise no Laboratório de Fitopatologia UnB. No presente estudo foram utilizados 27 isolados de videira (Tabela 1, isolados de 1 a 27). Outras 5 estirpes, da Coleção de Bactérias Fitopatogênicas do Departamento de Fitopatologia da Universidade de Brasília (Tabela 1, isolados de 29 a 33), foram selecionadas e incluídas, uma vez que se mostraram os mais divergentes em estudo de caracterização da variabilidade genética realizado anteriormente por Trindade et al. (2005). A estirpe tipo (NCPPB 2475), originária da Índia, obtida junto à National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, Central Science Laboratory (Sand Hutton, York, Reino Unido, import permit nº05227) também foi incluída neste estudo, totalizando 33 isolados bacterianos.

41 26 Tabela 1. Designação, origem e ano de coleta dos isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola utilizados neste estudo. Designação Origem Cultivar Local de coleta Ano de Coleta 1 UnB 1292 cv.red Globe Projeto Mandacaru, Juazeiro BA UnB 1293 cv.superior x IAC 766 Faz. Vale das Uvas PE UnB 1294 cv.thompson x Paulsen Faz. Boa Esperança, Petrolina PE UnB 1295 cv.festival Projeto Bebedouro, Petrolina PE UnB 1296 cv.itália PISNC, Petroli7na PE UnB 1297 cv.festival PISNC, Petrolina PE UnB 1298 cv.itália Faz. Mariad, Petrolina PE UnB 1299 cv.thompson Faz. DAN, Petrolina PE UnB 1300 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1301 cv.thompson Petrolina PE UnB 1302 cv.thompson Petrolina PE UnB 1303 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1304 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1305 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1306 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1307 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1308 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1309 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1310 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1311 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1312 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1313 cv.festival Faz. Frutirenda, Petrolina PE UnB 1314 cv.red Globe Faz. Boa Esperança, Petrolina PE UnB 1315 cv.red Globe Faz. Boa Esperança, Petrolina PE UnB 1316 cv.red Globe Faz. PECEL, Petrolina PE UnB 1317 cv.festival Petrolina PE UnB 1318 cv.brs Morena Caldas MG UnB 1183 cv.red Globe Faz. Vale das Uvas PE UnB 1204 cv.red Globe Projeto Maniçoba, Juazeiro BA UnB 1212 cv.itália Projeto Senador Nilo Coelho PE UnB 1222 cv.perlette Projeto Bebedouro PE UnB 1227 cv.red Globe Projeto Senador Nilo Coelho PE NCPPB 2475 cv.anab-e-shahi Índia 1972

42 Cultivo e preservação dos isolados Nas repicagens de rotina e preparo de inóculo para realização dos testes bioquímicos e moleculares foi utilizado o meio 523 modificado de Kado & Heskett (1970). Os isolados foram preservados em água estéril, mantidos a temperatura ambiente e em glicerol a 30 %, congelados a 80 ºC Caracterização bioquímica de Xanthomonas campestris pv. viticola Testes bioquímicos foram realizados com a finalidade de confirmar a identidade dos 27 isolados bacterianos oriundos de amostras coletadas ou recebidas para análise. A partir do isolamento em meio de cultura sólido e caracterização cultural, os isolados que apresentaram colônias convexas, brilhantes, lisas e de cor creme-esbranquiçada foram repicadas e submetidos aos seguintes testes: teste KOH (alternativo ao teste de Gram); oxidação/fermentação da glicose; fluorescência em meio King s B; utilização de asparagina como fonte única de carbono e nitrogênio; crescimento em meio TTC (cloreto de trifenil tetrazólio) a 0,1 % e atividade da catalase. Os testes e meios de cultura (Anexo) foram utilizados de acordo com os protocolos convencionais descritos por Schaad et al. (1994); Lelliot & Stead (1987); Hugh & Leifson (1953); Starr & Weiss (1943) e Lozano & Sequeira (1970) Reação de hipersensibilidade em plantas de tomate (Lycopersicon esculentum cv. Santa Cruz) Uma suspensão, equivalente a Escala 7 de MacFarland (aproximadamente 10 9 ufc/ ml) foi preparada a partir de uma cultura bacteriana de 48 h. As suspensões foram infiltradas sobre a epiderme, no espaço internerval da face inferior da folha de tomate. Para isso procedeu-se pressionando a seringa com a suspensão até a obtenção de uma área encharcada de aproximadamente 1cm de diâmetro. A reação foi observada até o quarto dia após a

43 28 infiltração. Como padrões positivos foram utilizados os isolados X. campestris pv. campestris (UnB 159), Xcv (UnB 1183) e como controle negativo, água destilada estéril Caracterização molecular de Xanthomonas campestris pv. viticola Extração de DNA genômico Para a extração do DNA total do genoma bacteriano utilizou-se o protocolo modificado de Ausubel et al. (1992). Inicialmente os isolados bacterianos foram cultivados em 10 ml de meio 523 líquido (Modificado de Kado & Heskett, 1970) por 20 h, a 28 ºC. Em seguida 1,5 µl desse cultivo foi transferido para tubos Eppendorf e centrifugados a rpm (4600 x g) em microcentrífuga (Labnet Force 7 National labnet Company, Inc.), por 5 min. Os precipitados foram ressuspendidos em 520 µl de tampão TE: 10 mm Tris-HCl, ph 8.0; 1 mm EDTA. Em seguida adicionou-se 25 µl de SDS 20 %, 3 µl de Proteinase K (20 mg/ml) e incubou-se a 37 ºC por 1 h. Posteriormente adicionou-se 100 µl de NaCl 5 M e 80 µl de CTAB/NaCl (CTAB 10 % em NaCl 0,7 M). Incubou-se no gelo por 14 min. Adicionou-se 1 volume de clorofórmio: álcool isoamil (24:1), o equivalente a aproximadamente 720 µl. As amostras foram novamente incubadas no gelo por 5 min e centrifugadas a rpm (7200 x g), por 20 min. Após a centrifugação transferiu-se os sobrenadantes para novos tubos; e novamente adicionou-se igual volume de clorofórmio: álcool isoamil (24:1), repetindo-se o mesmo procedimento anterior. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, onde se adicionou 0,6 do volume de isopropanol, seguido de incubação por cerca de 16 h, a 20 ºC. As amostras foram centrifugadas por 10 min a rpm (7200 x g). Os precipitados foram lavados duas vezes em 500 µl de etanol 70 % e centrifugados a rpm (7200 x g) por 5 min. Na última etapa descartou-se o sobrenadante e retirou-se cuidadosamente o líquido restante. Os tubos foram secos em estufa a 37 ºC, durante 30 min e os ácidos nucléicos precipitados foram ressuspendidos em 25 µl de TE e armazenados, a 20 ºC.

44 Quantificação do DNA genômico A quantificação foi realizada com base na análise comparativa da intensidade das bandas das amostras com o marcador High DNA Mass Ladder (GIBCO BRL), por meio de eletroforese em gel de agarose a 0,8 % preparado em tampão 0,5 X TBE (5,4 g de Trisbase, 2,75 g de ácido bórico e 0,375 g de EDTA para 1000 ml), onde 5 µl do DNA genômico foram misturados a 1 µl do tampão de carregamento 10 X (50 % de glicerol, 1 mm EDTA; 0,4 % Bromophenol blue e 0,4 % de Xylene cyanol). As amostras foram submetidas a uma corrente de 80 V por 1 h, seguido da coloração com brometo de etídio (0,5 µg/ml), descoloração em água destilada e posterior fotodocumentação em Eagle EYE TM II (Stratagene ). Após a quantificação foram preparadas alíquotas de trabalho em uma concentração final de 10 ng/µl de DNA Identificação com iniciadores ( primers ) específicos A fim de confirmar a identidade dos isolados bacterianos em estudo utilizou-se PCR (Reação em cadeia da polimerase) com iniciadores ( primers ) específicos (Xcv1F Xcv3R) (Tabela 2) para amplificação de um fragmento de 240 pb do gene hrpb de Xcv (Trindade et al., 2005; Trindade et al., 2007). Para as reações de amplificação foram utilizados: tampão Taq 1 X (20 mm Tris HCl, ph 8,4; 50 mm de KCl); 1,5 mm de MgCl 2 ; 0,2 mm de cada um dos dntp s (GIBCO BRL); 25 ρmol de cada primer ; 1,25 U de Taq DNA polimerase (GIBCO BRL); 0,4 ng de DNA por µl de reação e água milliq para um volume final de 25 µl. Tabela 2. Seqüências dos primers desenhados para a região correspondente ao gene hrpb de Xanthomonas campestris pv. viticola (Trindade et al., 2007). Nº de Região alvo Primer Seqüência 5 3 nucleotídeos Xcv1F TGCAGGTGAGCTGTGC 16 hrpb Xcv3R AGTTCGACCACCTTGCCATA 20

45 30 As amostras foram submetidas à amplificação em termociclador RoboCycler96 (Stratagene ), sendo inicialmente aquecidas a 95 ºC por 2 min, posteriormente submetidas a 35 ciclos de 95 ºC por 1 min para desnaturação, 1 min a 64 ºC para o anelamento dos primers e 72 ºC por 2 min para extensão e extensão final a 72 ºC por 10 min. Os produtos da amplificação por PCR foram analisados em gel de agarose a 1 %, preparado em tampão 0,5 X TBE, onde 12 µl de cada amostra foram misturados a 1 µl de tampão de carregamento 10 X e aplicados ao gel. A eletroforese foi realizada a 85 V durante 50 min. Após a corrida, o gel foi corado, descorado e fotografado. O marcador utilizado foi o 100 pb DNA Ladder (Promega) rep-pcr Para as reações de rep-pcr com os primers (Tabela 3) correspondentes às seqüências REP, ERIC e BOX, foram utilizados: tampão Taq 1 X (50 mm KCl, 20 mm Tris HCl); 1,5 mm de MgCl 2 ; 0,2 mm de cada um dos dntps (GIBCO BRL); 25 ρmol de cada primer; 1,25 U de Taq DNA polimerase (GIBICO BRL); 1,2 ng de DNA por µl de reação e água milliq para um volume final de 25 µl. As amostras foram submetidas à amplificação em termociclador RoboCycler96 (Stratagene ), sendo inicialmente aquecidas a 95 ºC por 7 min, e posteriormente submetidas a 35 ciclos de 94 ºC por 1 min para desnaturação, 8 min a 44 ºC para anelamento dos primers (REP1R I e REP2 I) e 15 min a 65 ºC para a extensão. Para ERIC e BOX- PCR as amostras foram submetidas ao seguinte programa: 95 ºC por 7 min, 30 ciclos de 94 ºC por 1 min, 8 min a 52 ºC (ERIC) e 53 ºC (BOX), e 15 min a 65 ºC. Para o término da extensão pela Taq DNA polimerase, após os ciclos, a temperatura foi mantida a 65 ºC por 15 min. As reações foram realizadas em duplicata para cada isolado. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose a 1,5 %. A eletroforese foi realizada a 75 V durante 4 h e 30 min Após a corrida, o gel foi corado, descorado e fotografado, conforme já descrito anteriormente. O marcador utilizado foi o de 100 pb DNA Ladder (GIBCO BRL).

46 31 Tabela 3. Descrição dos primers utilizados para rep-pcr (Louws et al., 1994). Seqüência alvo Primers Seqüência dos primers (5 3 ) REP ERIC REP1R-I REP2-I ERIC1R ERIC2 IIICGICGICATCIGGC ICGITTATCIGGCCTAC ATGTAAGCTCCTGGGGATTCA AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG BOX BOXA1R CTCCGGCAAGGCGACGCTGAC Os perfis de amplificação com REP, ERIC e BOX-PCR dos 33 isolados bacterianos foram analisados visualmente de acordo com a presença (1) e ausência (0) de bandas, independente da intensidade, separada e conjuntamente por meio do programa MVSP 3.1 (Multi-Variate Statistical Package, Version 3.11h/ Kovach Computing Services). Os relacionamentos genéticos entre os isolados foram determinados pelos coeficientes de similaridade de Jaccard e análise de agrupamento de acordo com o método UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages) (Dias, 1998) ITS-RFLP Amplificação da região ITS Para a amplificação da região intergênica 16S 23S rrna foram usados os primers L1 (Jensen et al., 1993) e C1 (Maes et al., 1996) (Tabela 4), que amplificam um fragmento em torno de 600 pb.

47 32 Tabela 4. Descrição dos primers utilizados na amplificação da região intergênica (16S 23) do DNA ribossomal. Primer Seqüência (5 3 ) C1 L1 AGT AGT AAC AAG GTA ACC CCA GGC ATC CAC CGT Cada reação foi composta de 0,2 mm de cada um dos dntps; 1,5 mm de MgCl 2 ; tampão da enzima 1 X (20 mm Tris HCL, ph 8.4; 50 mm de KCL); 25 ρmol de cada primer ; 1,25 U de Taq DNA polimerase (GIBCO BRL); 0,4 ng de DNA por reação e água milliq, para um volume final de 25 µl. As reações de amplificação foram realizadas em termociclador PT 100 TM (MJ Research, Watertown, Mass). A temperatura de desnaturação inicial foi de 95 ºC por 4 min, seguida de 30 ciclos de: 95 ºC por 1 min, 50 ºC por 1 min e 72 ºC por 2 min, com extensão final a 72 ºC por 10 min. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose a 1 %. A eletroforese foi realizada a 75 V durante 3 h e 30 min. Após a corrida, o gel foi corado, descorado e fotografado. O marcador utilizado foi o de 100 pb DNA Ladder (GIBCO BRL) Digestão dos produtos de PCR Os produtos de PCR obtidos com os primers C1 L1 foram submetidos à análise de restrição com as endonucleases: HaeIII (GIBCO BRL) e MspI (Pharmacia). Cada reação foi preparada com: 2 µl de tampão 10 X da enzima; 0,5 U da enzima de restrição por µl de reação ; 5 µl de DNA (produto de PCR) e água milliq estéril, para um volume final de 20 µl. As amostras foram mantidas a 37 ºC, por 16 h. Os produtos da digestão com as enzimas foram analisados em gel de poliacrilamida 0,8 % (10 ml de TBE 5 X; 13,3 ml de acrilamida 30 %; 350 µl de persulfato de amônio; 20 µl de TEMED e 26,35 ml de água). A eletroforese foi realizada em TBE 1 X a 75 V durante 4 h e 30 min e os fragmentos de restrição

48 33 visualizados após coloração com brometo de etídio. O marcador utilizado foi o de 100 pb Ladder (Promega). Os perfis de restrição gerados dos 33 isolados bacterianos foram analisados visualmente de acordo com a presença (1) e ausência (0) de bandas, assim como descrito anteriormente para rep-pcr.

49 34 3- RESULTADOS 3.1- Caracterização bioquímica De acordo com os testes bioquímicos realizados (Tabela 5) observou-se que: Todos os 27 isolados apresentaram reação positiva solúvel no teste de KOH, ou seja, são Gram-negativos. Em relação ao teste O/F (oxidativo/fermentativo), todos apresentaram metabolismo oxidativo. A utilização de asparagina, como fonte única de carbono e nitrogênio, não foi observada para nenhum dos isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola.. O teste de fluorescência em meio King s B mostrou ausência de pigmentos em todos os isolados. Foi observada atividade da catalase para todo os isolados. Todos os isolados testados tiveram seu crescimento inibido, exibindo dessa forma, tolerância ao sal de tetrazólio a 0,1 %. O teste de hipersensibilidade (RH) em folhas de tomate Santa Cruz (Figura 2) foi positivo para todos os 27 isolados, com reação necrótica observada 24 h após a inoculação. Dessa forma todos os 27 isolados apresentaram as características típicas do gênero Xanthomonas e condizentes com a descrição de X. campestris pv. viticola (Nayudu, 1972; Malavolta Jr. et al., 1999; Lima et al., 1999; Trindade et al., 2005).

50 35 Tabela 5. Caracterização bioquímica e reação de hipersensibilidade, em folha de tomate, dos isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola, procedentes de diferentes áreas e coletados entre 2003 e Isolado Gram a O/F Asparagina King s B b Catalase RH c 1 UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O UnB O a Reação de gram realizada pelo método de KOH b Teste de produção de pigmentos fluorescentes utilizando o meio de cultura B de King c RH: Reação de hipersensibilidade observada em folhas de tomate cv. Santa Cruz, 24 h após infiltração.

51 Figura 2. Reação de hipersensibilidade induzida por Xanthomonas campestris pv. viticola em folhas de tomate, após 24 h da inoculação. (1) UnB 1293; (2) UnB 1299; (3) UnB 1309; (4) UnB 1318; (5) UnB 1183 e (6) Controle negativo (água destilada estéril). 8

52 Caracterização molecular Identificação com iniciadores ( primers ) específicos As amplificações a partir do DNA genômico purificado dos 33 isolados de Xcv com os oligonucleotídeos específicos (Xcv1F Xcv3R), visualizadas em gel de agarose, resultaram em fragmentos de tamanho esperado de 240 pb (Figura 3). Os resultados obtidos concordam com os testes bioquímicos, confirmando a identidade dos isolados como X. campestris pv. viticola. O mesmo foi observado para o isolado tipo NCPPB 2475 cujo DNA foi utilizado como controle positivo do experimento. M1 CN M2 500 pb 240 pb 500 pb Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 1 % do produto de PCR obtido com os primers Xcv1F Xcv3R correspondente à região do cluster hrpb de diferentes isolados: CN: Controle Negativo (reação sem DNA); (1) NCPPB 2475; (2) UnB 1302; (3) UnB 1303; (4) UnB 1304; (5) UnB 1305; (6) UnB 1306; (7) UnB 1307; (8) UnB 1308; (9) UnB 1309; (10) UnB 1310; (11) UnB M1 e M2 Marcador 100 pb DNA Ladder (Promega).

53 rep-pcr As amplificações do DNA purificado de Xcv com os primers REP, ERIC e BOX- PCR (rep-pcr) visualizadas em gel de agarose, geraram múltiplos produtos (um total de 39 bandas) com fragmentos variando de 170 a 2036 pb. BOX-PCR O primer BOXA 1R em PCR gerou 10 bandas variando de 190 a 2036 pb (Figura 4), estando a banda de aproximadamente 700 pb presente em todos os isolados de Xcv estudados. As bandas de 1100 e 800 pb também estiveram constantes em quase todos os isolados exceto para UnB 1212, UnB 1222 e UnB As bandas de 1700, 400 pb e 250 pb estiveram presentes somente nos isolados coletados entre 2003 e 2006 e também na estirpe tipo NCPPB 2475 da Índia, não sendo observada no restante das estirpes coletadas entre 1998 e O dendrograma (Figura 5) gerado para os isolados foi analisado em dois níveis, a 20 % e a 70 % de similaridade. Na primeira análise, a 20 % de similaridade, podese identificar dois grupos, A e B. O grupo A com estirpes UnB 1212, UnB 1222 e UnB 1227 todas de Pernambuco e o grupo B englobando a estirpe UnB 1204, da Bahia e todos os outros isolados de Xcv. A 70 % de similaridade pode-se dividir os isolados em 4 grupos. O grupo 4 com 29 isolados incluindo a estirpe tipo NCPPB 2475 da Índia e UnB 1183 de Pernambuco, que foram agrupados com 100 % de similaridade e todos os outros isolados coletados entre 2003 e 2006, em diferentes áreas da Bahia e Pernambuco, que formaram outro agrupamento com o mesmo nível de similaridade. A única exceção foi o isolado UnB 1317, mas apresentou similaridade superior a 84 %. As outras 4 estirpes foram agrupadas separadamente, exceto UnB 1212 e UnB 1222, ambas de Pernambuco, que formaram um grupo com mais de 70 % de similaridade entre si.

54 39 M M pb 1500 pb 600 pb Figura 4. Análise eletroforética dos fragmentos gerados através de BOX-PCR, a partir de DNA purificado de isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola. (1) UnB 1301; (2) UnB 1302; (3) UnB 1303; (4) UnB 1304; (5) UnB 1305; (6) UnB 1306; (7) UnB 1307; (8) UnB 1308; (9) UnB 1309; (10) UnB 1310; (11) UnB 1311; (12) UnB 1312; (13) UnB 1313; (14) UnB 1314; (15) UnB 1315; (16) UnB 1316; (17) UnB 1317; (18) UnB M1 e M2- Marcador 100 pb DNA Ladder (Gibco-BRL). A setas ( ) indicam Bandas em comum para todos os isolados coletados entre os anos de 2003 e E Região polimórfica encontrada apenas em UnB 1315, entre os isolados coletados entre os 2003 e 2006 ( ).

55 40 A B 0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0, UnB 1227 UnB 1222 UnB 1212 UnB 1204 UnB 1317 UnB 1318 UnB 1316 UnB 1315 UnB 1314 UnB 1313 UnaB 131 UnB 1311 UnB 1310 UnB 1309 UnB 1308 UnB 1307 UnB 1306 UnB 1305 UnB 1304 UnB 1303 UnB 1302 UnB 1301 UnB 1300 UnB 1299 UnB 1298 UnB 1297 UnB 1296 UnB 1295 UnB 1294 UnB 1293 UnB 1292 UnB 1183 NCPPB 24 Jaccard's Coefficient FIgura 5. Dendrograma baseado no método UPGMA, de acordo com os perfis de amplificação gerada por BOX-PCR, mostrando as relações entre os isolados entre isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola de videira.

56 41 ERIC-PCR A utilização dos primers ERIC (ERIC1R e ERIC2) gerou um total de 12 bandas variando entre 170 e 2000 pb (Figura 6). As bandas de 2000 e 270 pb estiveram presentes em quase todos os isolados exceto nas estirpes UnB 1212, UnB 1222 e UnB Da mesma forma as bandas de 800 e 600 pb que só não estiveram presentes nas estirpes UnB 1212 e UnB 1227, coletadas entre 1998 e A banda de 550 pb só esteve presente na estirpe UnB 1212 e a de 500 pb só nos isolados coletados entre 2003 e Os fragmentos de 400 e 170 pb estiveram presentes em todos os isolados exceto na estirpe UnB O dendrograma (Figura 7) obtido com os primers ERIC possibilitou a análise em dois níveis. Inicialmente a 20 % de similaridade foram estabelecidos dois grupos: o grupo A composto somente pela estirpe UnB 1212 e o grupo B que englobou todos os outros isolados de Xcv. A 70 % de similaridade, 5 grupos foram evidentes. Os grupos 1, 2, 3 e 4 agruparam separadamente as estirpes UnB 1212, UnB 1227, UnB 1204 e UnB 1222 respectivamente. O grupo 5 inclui todos os outros isolados e a estirpe UnB A estirpe da Índia NCPPB 2475 formou um único agrupamento com a estirpe UnB 1183 de Pernambuco, com similaridade superior a 84 %. Dois outros grandes grupos foram formados com 100 % de similaridade, o primeiro englobando isolados da Bahia e Pernambuco e o segundo com isolados somente de Pernambuco. Ainda dentro do grupo 5, o isolado UnB 1301 de Pernambuco foi agrupado separadamente com similaridade superior a 84 %.

57 42 M M pb 1500 pb 600 pb Figura 6. Análise eletroforética dos fragmentos gerados através de ERIC- PCR, a partir de DNA purificado de isolados utilizados de Xanthomonas campestris pv. viticola. (1) UnB 1301; (2) UnB 1302; (3) UnB 1303; (4) UnB 1304; (5) UnB 1305; (6) UnB 1306; (7) UnB 1307; (8) UnB 1308; (9) UnB 1309; (10) UnB 1310; (11) UnB 1311; (12) UnB 1312; (13) UnB 1313; (14) UnB 1314; (15) UnB 1315; (16) UnB 1316; (17) UnB 1317; (18) UnB M1 e M2- Marcador 100 pb DNA Ladder (Gibco-BRL). As setas indicam bandas comuns em todos os isolados coletados entre os anos de 2003 e 2006.

58 43 A B 0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0, UnB 1212 UnB 1227 UnB 1204 UnB 1222 UnB 1301 UnB 1318 UnB 1315 UnB 1309 UnB 1304 UnB 1303 UnB 1299 UnB 1297 UnB 1296 UnB 1295 UnB 1294 UnB 1317 UnB 1316 UnB 1314 UnB 1313 UnaB 131 UnB 1311 UnB 1310 UnB 1308 UnB 1307 UnB 1306 UnB 1305 UnB 1302 UnB 1300 UnB 1298 UnB 1293 UnB 1292 UnB 1183 NCPPB 24 Jaccard's Coefficient Figura 7. Dendrograma baseado no método UPGMA, de acordo com os perfis de amplificação gerada por ERIC-PCR, mostrando as relações entre os isolados entre isolados de Xanthomonas campestris pv. viticola de videira.

59 44 REP-PCR A utilização dos primers (REP1R I e REP2 I) gerou um total de 17 bandas variando de 190 a 2800 pb com várias bandas presentes em todos os isolados, entre elas a de aproximadamente 1500 pb indicada no gel (Figura 8). O dendrograma (Figura 9) gerado pela comparação entre os perfis dos isolados permitiu a separação dos isolados em dois níveis. A 40 % de similaridade foram estabelecidos dois grupos, o primeiro identificado como grupo A englobou somente os isolados UnB 1295 e UnB 1293, ambos de Petrolina. O outro grupo, B inclui todos os outros isolados. A 70 % de similaridade foi possível estabelecer 4 grupos. O primeiro grupo inclui os isolados UnB 1293 e UnB 1295, coletados em 2003 e 2004 respectivamente. O grupo dois incluiu somente a estirpe UnB O grupo 3 reuniu em quatro grandes grupos a 100 % de similaridade 9, 11, 4 e 2 isolados, respectivamente todos coletados entre os anos de 2003 e Ainda nesse grupo foram reunidas a estirpe UnB 1183 e o isolado UnB O quarto e último grupo reuniu a estirpe UnB 1212 e estirpe tipo NCPPB 2475.

60 pb M M pb 600 pb Figura 8. Análise eletroforética dos fragmentos gerados através de REP-PCR, a partir de DNA purificado de isolados utilizados de Xanthomonas campestris pv. viticola. (1) UnB 1301; (2) UnB 1302; (3) UnB 1303; (4) UnB 1304; (5) UnB 1305; (6) UnB 1306; (7) UnB 1307; (8) UnB 1308; (9) UnB 1309; (10) UnB 1310; (11) UnB 1311; (12) UnB 1312; (13) UnB 1313; (14) UnB 1314; (15) UnB 1315; (16) UnB 1316; (17) UnB 1317; (18) UnB M1 e M2- Marcador 100 pb DNA Ladder (Gibco-BRL).