BIOQUÍMICA I AULAS PRÁTICAS. 2º ano, 1º semestre

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1 BIOQUÍMICA I AULAS PRÁTICAS 2º ano, 1º semestre

2 Objectivo Bases teórico/práticas das metodologias experimentais necessárias ao estudo qualitativo e quantitativo de macromoléculas - péptidos e proteínas, glúcidos e lípidos -

3 Objectivo Bases teórico/práticas das metodologias experimentais necessárias ao estudo qualitativo e quantitativo de macromoléculas - péptidos e proteínas, glúcidos e lípidos - Metodologia de ensino: Realização de exercícios; Pesquisa e apresentação de temas relacionados com o programa da disciplina

4 Temas de trabalho A. AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); Derivatização de aminoácidos; 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos; 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; 4. Separação de proteínas por métodos cromatográficos: cromatografias de exclusão molecular, troca-iónica, afinidade e hidrófoba; electroforese mono/bidimensional; focagem isoeléctrica; 5. Métodos espectrofotométricos para análise quantitativa de proteínas: Métodos de Lowry, Bradford, Ácido bicinconínico (BCA) e absorção no UV; 6. Ferramentas bioinformáticas para estudo de proteínas: PDB (Protein Data Bank), Brenda, Expasy, Molecular Viewers (Chimera; Pymol)

5 Temas de trabalho B. ENZIMAS 1. Utilização de ferramentas informáticas para estudo e caracterização de enzimas: Determinação da actividade enzimática, parâmetros cinéticos de enzimas Michaelianas e de enzimas alostéricas e de constantes de inibição. C. GLÚCIDOS 1. Métodos de análise e caracterização de glúcidos: Métodos cromatográficos; reacções de identificação (reacções de Benedict, Barfoed, Selivanoff, Bial, Ácido múcico e Osazonas); marcha geral de identificação de açúcares. D. LÍPIDOS 1. Métodos de análise e caracterização de lípidos: Fraccionamento lipídico e análise qualitativa das fracções obtidas. E. METABOLISMO INTERMEDIÁRIO 1. Metabolismo energético: Estudo da fosforilação oxidativa; balanço energético do metabolismo glicídico e lipídico; 2. Doenças Hereditárias do Metabolismo

6 Calendário das aulas práticas Data 30/09 04/10 Prática 1 Apresentação da componente prática de Bioquímica I Apresentação do programa da componente prática e respectiva avaliação; regras de funcionamento; organização da turma em grupos Tema A: Aminoácidos e Proteínas A.1 - Identificação e separação de aminoácidos; Sequenciação peptídica; Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos; Determinação do pi de aminoácidos e péptidos. 07/10 11/10 Prática 2 Tema A: Aminoácidos e Proteínas A.2 - Exercícios: determinação da sequência e do pi de péptidos A.3 - Purificação, detecção e caracterização de proteínas: Introdução. 14/10 18/10 Prática 3 Tema A: Aminoácidos e Proteínas A.4 Apresentações: Tema Métodos cromatográficos e electroforéticos para separação e análise de proteínas : (1) cromatografia de exclusão molecular e troca-iónica; (2) cromatografia de afinidade e hidrófoba; (3) electroforese monodimensional desnaturante; (4) electroforese bidimensional e focagem isoeléctrica. 21/10 25/10 Prática 4 Tema A: Aminoácidos e Proteínas A.5 Apresentações: Tema Métodos espectrofotométricos para análise quantitativa de proteínas : (1) Método de Lowry; (2) Método do Ácido bicinconínico BCA; (3) Método de Bradford e (4) Absorvência no ultravioleta; A.6 - Exercícios: Utilização de curvas de calibração para determinação do teor proteico por métodos espectrofotométricos.

7 Calendário das aulas práticas Data 28/10-01/11 Prática 5 Tema A: Aminoácidos e Proteínas A.7 Exercícios: utilização de ferramentas Bioinformáticas para estudo de proteínas. 04/11 08/11 Prática 6 Tema B: Enzimas B.1 Exercícios: determinação de actividades enzimáticas e de parâmetros cinéticos de enzimas Michaelianas. 11/11 15/11 Prática 7 Tema B: Enzimas B.2 - Exercícios: determinação de parâmetros cinéticos de enzimas alostéricas; B.3 - Exercícios: determinação de constantes de inibição. 18/11 22/11 Prática 8 Tema C: Glúcidos C.1 - Estrutura e função dos glúcidos: propriedades químicas e estruturais; C.2- Apresentações: Tema Métodos de Análise e Caracterização de Glúcidos : (1) Provas de Benedict e Barfoed; (2) Provas do ácido múcico e de Selivanoff; (3) Prova de Bial e Prova das Ozasonas; (4) Técnicas cromatográficas. Tema D : Lípidos D.1 - Estrutura e função dos Lípidos: propriedades químicas e estruturais;

8 Calendário das aulas práticas Data 25/11 29/11 Prática 9 Tema D : Lípidos D.2 Apresentações: Tema Métodos de extracção, separação, identificação e quantificação de lípidos : (1) Métodos de extracção de lípidos totais e de extracção diferencial; (2) Separação e identificação de fosfolípidos por técnicas cromatográficas; (3) Métodos de doseamento de fosfolípidos; (4) Métodos de doseamento de colesterol. Tema E : Metabolismo Intermediário E.1 Exercícios: fosforilação oxidativa 02/12 06/12 Prática 10 Tema E : Metabolismo Intermediário E.2 Exercícios: balanço energético do metabolismo glucídico e lipídico 09/12 13/12 Prática 11 16/12 20/12 Prática 12 Tema E : Metabolismo Intermediário E.3 Apresentações: Tema Doenças Hereditárias do Metabolismo : (1) Deficiência em PDH; (2) Deficiência em MCAD; (3) Doença de Gaucher; (4) Galactosémia clássica. Tema E : Metabolismo Intermediário E.3 Apresentações: Tema Doenças Hereditárias do Metabolismo : (1) Fenilcetonúria; (2) Homocistinúria clássica; (3) Deficiência em CPSI; (4) Tirosinémia tipo I

9 Avaliação 1. Frequência de (no mínimo) 2/3 das aulas realizadas (8 aulas). 2. Os conhecimentos adquiridos pelos alunos serão avaliados de forma contínua ao longo do semestre. Esta avaliação terá em conta a preparação dos exercícios a realizar, o interesse e participação nas aulas, a preparação dos Temas a apresentar e a Avaliação final. 3. A ponderação dos vários elementos de avaliação prática será a seguinte: a) 5% - Assiduidade (onde se inclui ausência de reparos em relação ao material exigido para as aulas); b) 10% - Desempenho na resolução dos exercícios apresentados (onde de se inclui o interesse e participação nas aulas); c) 45% - Apresentação dos Temas de Trabalho; d) 40% - Teste. 4. A classificação final da disciplina é a média ponderada da classificação obtida no exame teórico final (70%) e no ensino prático (30%).

10 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); Derivatização de aminoácidos; 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos; 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;

11 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); Elevada reactividade do Grupo NH 2 e -COOH

12 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); Classificação de acordo com a polaridade do grupo R: 1. Não polares alifáticos 2. Não polares aromáticos 3. Polares não carregados 4. Polares carregados positivamente 5. Polares carregados negativamente

13 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);

14 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); Ninidrina: Reage com aminas Coloração violeta com grupos -NH 2 Coloração amarelada com iminoácidos (ex: Pro) Elevada sensibilidade

15 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); Ninidrina: Reage com aminas Coloração violeta com grupos -NH 2 Coloração amarelada com iminoácidos (ex: Pro) Elevada sensibilidade

16 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); Cloreto de Dansilo: Reage com aminas (grupo -NH 2 ) Emissão de luz amarelo-esverdeada no UV Elevada sensibilidade U.V.

17 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); TLC monodimensional Coloração Ninidrina/UV Suporte utilizado em geral celulose (característica hidrófilas dos aminoácidos)

18 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); TLC bidimensional Coloração Ninidrina/UV Suporte utilizado em geral celulose (característica hidrófilas dos aminoácidos)

19 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC); Cromatografia em coluna Derivatização: Pré-coluna Pós-coluna

20 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos; Propriedades Anfotéricas Dador de protões (carga +1) (carga 0) Aceitador de protões (carga -1)

21 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos; (carga +1) (carga 0) (carga -1) pk 1 - -COOH (Gly 2.3) pk 2 - -NH 2 (Gly 9.6) pi - ponto isoeléctrico pk1 pk 2 pi 2

22 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos; Péptido (Grupos dadores/aceitadores Protões) * * * Apenas R dos aa: Asp/Glu; His/Arg/Lys; Cys/Tyr

23 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos;

24 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos; His Asp 1. 1ª forma completamente protonada 2. Calcular a carga desta forma (tem que ser positiva) 3. Retirar o 1º protão (do grupo COOH mais perto do grupo -amina) 4. Aa com carga 0: -COO - e NH + 3

25 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos; (-1) (0) 3 pk: 1. pk pk pk3 9.3 (+2) pi pk 2 pk3 2 pi = 7.6 (+1)

26 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos; NH 2 -Ala-Lys-COOH Lys H NH 2 NH Grupos ionizáveis NH Grupo -NH 2 da Ala (9,69) Grupo -COOH da Lys (2,18) Grupo R da Lys (10.53)

27 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos: Determinação do pi de aminoácidos e péptidos; NH 2 -Ala-Lys-COOH Grupo -NH 2 da Ala (9,69) Grupo -COOH da Lys (2,18) Grupo R da Lys (10.53) Lys: Ala: H NH 2 2,18 8,9 10,53 NH 2 H 2,3 9,69 NH 2 NH 2 Grupo ph 1 ph 3-5 ph 7 ph 10 ph 11 Ala -NH 2 (pk 9,69) Lys -COOH (pk 2,18) pi pk 2 pk3 2 Lys R (pk 10,53) Total

28 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Péptido Ligação peptídica Terminal -NH 2 Terminal COOH

29 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; HCl 6M/110ºC Bases fortes/temp Agentes químicos Endopeptidases Carboxipeptidases Geral Específica

30 Clivagem enzimática Clivagem química A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Agente Local de clivagem Observações Brometo de cianogénio Terminal carboxílico dos resíduos de Metionina Met-X O-Iodobenzoato Terminal carboxílico dos resíduos de Triptofano Trp-X Hidroxilamina Ligação Asparagina-Glicina Asn-Gly 2-Nitro-5-tiobenzoato Terminal amina dos resíduos de Cisteína X-Cys Lys-X; Arg-X Tripsina Terminal carboxílico dos resíduos de Lisina e Argina Proetease submaxilar Terminal carboxílico do resíduo de Arginina Arg-X Clostripan Terminal carboxílico dos resíduos de Arginina Arg-X Protease stafilococica Terminal carboxílico dos resíduos de Aspartato e Glutamato (glutamato apenas em certas condições) Asp-X; Glu-X Asp-N-protease Terminal amina dos resíduos de Aspartato e Glutamato X-Asp; X-Glu Pepsina Terminal amina dos resíduos de Fenilalanina, Triptofano e Tirosina X-Phe; X-Trp; X-Tyr Trombina Terminal carboxílico da Arginina Arg-X Endoproteinase Lys C Terminal carboxílico da Lisina Lys-X Quimotripsina Terminal carboxílico da Tirosina, Triptofano, Fenilalanina Tyr-X; Trp-X; Phe-X Carboxipeptidase A Cliva a ligações peptídicas C-terminal, excepto na presença de Arginina, Lisina e Prolina X-Aminoácido (excepto quando Arg, Lys, Pro Carboxipeptidase B Actua sobre a extremidade C-terminal de um péptido ou proteína mas apenas quando o aminoácido C-terminal é Arginina ou Lisina X-Arg; X-Lys

31 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Insulina Sequenciação peptídica: Processo de identificar a sequência de amino ácidos numa cadeia polipeptídica (estrutura primária)

32 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Insulina Estratégia analítica: 1. Separar as diferentes cadeias polipeptídicas (se existirem) 2. Para cadeia polipeptídica: 1. Identificar o aa N-terminal e C-terminal 2. Identificar os aa totais constituintes de cada ppa proteína 3. Cortar a proteína em fragmentos mais pequenos (péptidos) sobreponíveis 3. Identificar o aa N-terminal e C-terminal de cada péptido 4. Sequenciar os fragmentos individualmente 5. Montar o puzzle

33 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Insulina Estratégia analítica: 1. Separar as diferentes cadeias polipeptídicas (se existirem) -mercapto etanol Técnicas Cromatográficas

34 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Estratégia analítica: 2. Para cadeia polipeptídica: Identificar o aa N-terminal e C-terminal Derivatização Identificação técnicas cromatográficas (ex: Cl-Dns) HCl 6M/110ºC (hidrólise) Apenas a Gly se encontra marcada, os restantes aa libertados não se encontram marcados

35 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Estratégia analítica: 2. Para cadeia polipeptídica: Identificar o aa N-terminal e C-terminal Hidrólise Carboxipeptidase Identificação técnicas cromatográficas Liberta apenas Asn

36 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Estratégia analítica: 2. Para cadeia polipeptídica: Identificar a composição em aa Hidrólise HCl 6M/110ºC Liberta todos os aminoácidos Derivatização (ex: Cl-Dns) Identificação técnicas cromatográficas Todos os aa ficam marcados

37 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Estratégia analítica: 2. Para cadeia polipeptídica: Cortar a proteína em fragmentos mais pequenos (péptidos) sobreponíveis (endopeptidases ou agentes químicos) Hidrólise Pepsina (Ligação amina de aa aromáticos) + + Repetir os passos anteriores para cada um dos péptidos obtidos

38 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; Estratégia analítica: 2. Para cadeia polipeptídica: Cortar a proteína em fragmentos mais pequenos (péptidos) sobreponíveis (carboxipeptidases) Hidrólise Carboxipeptidase 5 min: 10 min: 15 min: Identificação técnicas cromatográficas

39 3. Sequenciação peptídica: Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman; PITC: Fenil isotiocianato

40 Hidrolizar e separar aa Proteína constituida por 38 aa. Como tem R (Arg) e K (Lys) pode-se utilizar Tripsina. Por ter M (Met) pode utilizar-se CnBr Dansilar/ Hidrolizar e separar aa Digerir com tripsina/separar os péptidos e sequenciar cada um E Aa N-terminal: E(Glu) T2 é o primeiro péptido (começa com um E) T3 é o último (não termina com R ou K) Digerir com CnBr/separar os péptidos e sequenciar cada um Ordem: C1, C3, C2