MIRIAM GHEDINI GARCIA LOPES

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1 MIRIAM GHEDINI GARCIA LOPES SUPLEMENTAÇÃO COM COLECALCIFEROL EM PACIENTES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA E HIPOVITAMINOSE D Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutora em Ciências. São Paulo 2011

2 MIRIAM GHEDINI GARCIA LOPES SUPLEMENTAÇÃO COM COLECALCIFEROL EM PACIENTES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA E HIPOVITAMINOSE D Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutora em Ciências. Orientadora: Profa. Dra. Lilian Cuppari Coordenador: Prof. Dr. Mauro Batista de Morais São Paulo 2011

3 Ficha Catalográfica Garcia-Lopes, Miriam Ghedini Suplementação com cholecalciferol em pacientes com doença renal crônica e hipovitaminose D Tese (Doutorado) Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Nutrição. 1. Doença renal crônica. 2. Hipovitaminose D. 3. Vitamina D. 4. Adiposidade 5. Hiperparatireoidismo secundário.

4 Apoios: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Fundação Oswaldo Ramos

5 A felicidade às vezes é uma bênção, mas geralmente é uma conquista (Paulo Coelho)

6 Dedicatória especial Ao meu querido primo, Marcos Paulo Obrigada por ensinar me a importância da nutrição para os pacientes com doença renal e por guiar a minha vida profissional para que eu pudesse chegar até aqui! Obrigada por ensinar me o verdadeiro sentido da vida! Com carinho e muita saudade... dedico!

7 Dedicatória Ao meus pais, José e Ivani Meus maiores exemplos de vida aos quais devo tudo o que sou hoje!! Obrigada por terem me ensinado a ir sempre em busca dos meus ideais. Com amor, dedico! Ao meu marido, Edivaldo Pelos momentos que na minha ausência soube respeitar e valorizar meu esforço mesmo sentindo-se só. Obrigada por estar sempre ao meu lado em todos os momentos da minha vida, nas alegrias e nas tristezas!!! Com todo amor e carinho, dedico!

8 Agradecimento Especial À minha orientadora, a querida Profa. Dra. Lilian Cuppari, agradeço por acreditar em mim, mostrar me o caminho maravilhoso da ciência, por ter colaborado com a minha formação profissional, por fazer parte da minha vida nos momentos bons e ruins, por ser exemplo de profissional e de mulher a qual sempre fará parte da minha vida. Com muito carinho e admiração, agradeço imensamente!!

9 Agradecimentos À pessoas muito especiais, À querida Professora Dra. e amiga Maria Ayako Kamimura, pela sua dedicação, apoio e incentivo para a realização desse trabalho. Agradeço, sobretudo, pelos ensinamentos valiosos que contribuíram muito para minha vida!!! Te admiro muito!!! Com carinho, agradeço!! À minha amiga ( irmã ), Professora Dra. Ana Paula Bazanelli, pela sua amizade sincera, carinho e companheirismo.juntas erramos, acertamos e continuamos aprendendo! Obrigada por estar sempre ao meu lado. Seu apoio foi fundamental para a conclusão dessa tese! Adoro você!!! Com carinho, agradeço!! À minha querida amiga Flavia Baria Rossini de Souza e Souza, a Flavinha, uma pessoa maravilhosa e especial de ser! Com você não só aprendi sobre nutrição, mas principalmente o verdadeiro amor: de mãe!! Obrigada pelo apoio para que eu chegasse ao final dessa etapa. Você é uma amiga muito especial... Adoro você!!! Com carinho, agradeço!! À minha querida amiga Roberta Pillar, a Robert s, pela qual tenho grande carinho e admiração!! Você faz parte dessa conquista, desse trabalho!! Obrigada pelo apoio e amizade! Você é uma pessoa muito especial... Adoro você!!! Com carinho, agradeço!!

10 À minha família e amigos, Agradecimentos À minha irmã Gláucia, que não foi apenas irmã, mas amiga e companheira em todos os momentos da minha vida. Seu apoio foi fundamental para a conclusão dessa tese! Você faz parte dessa conquista!! Com muito carinho, agradeço!! A toda a minha família, meus avós Sidney e Jandira, tios Edson e Ivanete, Célio e Rita e primos Guilherme, Marcelo e Júlia. Obrigada pelo amor, carinho e orações que me fortaleceram em busca desse sonho!! Com carinho, agradeço!! À minha querida amiga e sogra Cida que nos momentos difíceis sempre me incentivou e apoiou e nas alegrias vibrou!! Muito obrigada por tudo... Ao amigo José, pelos momentos de alegria que sempre me proporcionou. Com carinho, agradeço!! À toda família do Edivaldo, por todo carinho, incentivo e maneira especial com que sempre me trataram. Com carinho, agradeço!! Aos queridos Tios Paulo e Mariazinha e aos meus primos Marcelo e Adriana que sempre me apoiaram e pela certeza de que poderei sempre contar! Vocês são muito especiais!! Com carinho, agradeço!! Aos queridos amigos Ricardo, Flavinha e Clarinha que compartilharam vários momentos importantes da minha vida e hoje divido com vocês mais essa conquista!!! Obrigada pela amizade verdade!!! Adoro vocês!! Com carinho, agradeço!! À minha querida amiga e eterna professora Giovana por acreditar em mim e por ensinarme a dar os primeiros passos na minha vida acadêmica. Fico feliz por ter você ao meu lado nesse momento tão importante da minha vida!! Te admiro muito!!!

11 Agradecimentos Às queridas amigas Lilietes com as quais tive o privilégio de conviver e trabalhar durante esses 8 anos. Muito obrigada por vocês fazerem parte da minha vida e por me darem certeza que posso sempre contar!!! À Lillian Rocha pela convivência agradável e colaboração para a realização deste trabalho. Aos doutores Aluízio e Maria Eugênia, pela convivência tão agradável durante estes anos em que estive na casinha e, principalmente, pelas contribuições valiosas para a realização e finalização desse trabalho. Admiro muito o trabalho de vocês!! À todos os funcionários da Fundação Oswaldo Ramos, pela convivência sempre agradável, por toda atenção e por estarem sempre prontos a me ajudar no que fosse preciso. Finalmente, muito obrigada às pessoas que não citei, mas que de forma especial contribuíram para que eu chegasse até aqui e realizasse esse grande sonho!

12 Agradeço especialmente a todos os pacientes, que apesar das dificuldades, aceitaram participar desse estudo e a todos os quais eu convivi e aprendi ao longo desses anos... Oro para que Deus os abençoe!

13 1. RESUMO Considerando a elevada prevalência de hipovitaminose D em pacientes na fase não dialítica da doença renal crônica (DRC) e os efeitos benéficos da restauração do estado nutricional de vitamina D nos pacientes com DRC nos parâmetros do metabolismo mineral, os guias de práticas clínicas para prevenção e tratamento dos distúrbios do metabolismo mineral ósseo, Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (K-DOQI) e Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO), sugerem a suplementação com vitamina D (ergocalciferol ou colecalciferol) para pacientes com DRC na fase não dialítica com hipovitaminose D. No entanto, poucos estudos avaliaram o efeito da suplementação nessa população. Dessa forma, este estudo tem como objetivo investigar os efeitos da suplementação com colecalciferol sobre marcadores séricos do metabolismo mineral de pacientes com hipovitaminose D na fase não dialítica da DRC. Estudo 1. Suplementação com colecalciferol na doença renal crônica: restauração do estado nutricional de vitamina D e impacto sobre o paratormônio. O estudo foi prospectivo com duração de 6 meses. Foram incluídos 45 pacientes com deficiência de vitamina D 25-hidroxivitamina D [25(OH)D] < 15 ng/ml. Os pacientes foram suplementados com UI/semana de colecalciferol durante 3 meses, sendo que naqueles que alcançaram níveis de 25(OH)D 30 ng/ml a dose foi modificada para UI/mês durante os próximos 3 meses. Para os demais pacientes, a mesma dose inicial foi mantida por mais 3 meses. Após o início da suplementação observou-se um aumento significativo nos níveis de 25(OH)D no tempo 3 e no tempo 6. Nos primeiros 3 meses de suplementação, 78% dos pacientes atingiram níveis de 25(OH)D 30 ng/ml. No entanto, após o ajuste da dose, somente 43% mantiveram esses níveis. Houve uma diminuição nos níveis de paratormônio (PTH) no tempo 3, período em que os pacientes receberam a maior dose de colecalciferol. As mudanças nos níveis de 25(OH)D durante os 3 meses correlacionaram-se positivamente com as mudanças dos níveis de 1,25-diidroxivitamina D [1,25(OH)2D] (r= 0,37; P= 0,01). As variações nos níveis de PTH correlacionaram-se inversamente com as mudanças nos níveis de cálcio sérico (r= -0,42; P= 0,004) e diretamente com as mudanças na creatinina sérica (r= 0,38; P= 0,01). A análise de regressão logística incluindo a proteinúria do início do estudo e as mudanças nos níveis séricos de creatinina, demonstrou que o excesso de adiposidade foi o principal fator associado com uma menor resposta à suplementação nos primeiros 3 meses (IMC 25 kg/m 2 : = 2,35, EP= 1,15, P= 0,04; índice de gordura do tronco: = 2,59, EP= 1,13, P= 0,02). Este estudo concluiu que o tratamento com UI por semana de colecalciferol foi efetivo em restaurar o estado nutricional de vitamina D na maioria dos pacientes sem apresentar efeitos adversos. A restauração dos níveis de vitamina D resultou na diminuição do PTH mesmo com uma redução da função renal. 1

14 Estudo 2. Suplementação com colecalciferol em pacientes com doença renal crônica e insuficiência de vitamina D. O estudo foi prospectivo com duração de 6 meses, randomizado e cego. Foram incluídos 75 pacientes com insuficiência de vitamina D [25(OH) D 15 e < 30 ng/ml. Os pacientes foram tratados de acordo com a recomendação de suplementação proposta pelo K-DOQI para pacientes com insuficiência de vitamina D ( UI de colecalciferol mensalmente durante 6 meses). Os mesmos foram aleatoriamente alocados em dois grupos: Grupo Colecalciferol (n= 38 pacientes) ou Grupo Placebo (n= 37 pacientes). O grupo colecalciferol recebeu durante todo período de estudo UI de colecalciferol mensalmente. Todos os pacientes incluídos no estudo receberam protetor solar durante o período de suplementação. Após o período de suplementação houve um aumento significativo nos níveis de 25(OH)D no grupo colecalciferol. Com relação aos demais parâmetros do metabolismo mineral, não foram observados modificações em nenhum dos parâmetros durante o seguimento. Após 6 meses de suplementação, 46% dos pacientes tratados não atingiram níveis de 25(OH)D > 30 ng/ml. Esses pacientes apresentaram uma maior quantidade de gordura corporal quando comparados com aqueles que alcançaram esses níveis. Já no grupo placebo, 40,5% dos pacientes atingiram níveis de 25(OH)D > 30 ng/ml no tempo 6. A época da coleta (verão/outono) para a determinação dos níveis de 25(OH)D no tempo 6 foi o único parâmetro que diferiu dos demais pacientes que mantiveram os níveis de 25(OH)D< 30 ng/ml. Em resumo, os resultados do presente estudo demonstram que o protocolo de tratamento proposto pelo K-DOQI parece não ser adequado para restaurar o estado nutricional de vitamina D em pacientes com insuficiência desta vitamina. No entanto, a gordura corporal e a época da coleta são fatores que podem ter contribuído para o achado negativo deste estudo. 2

15 2. INTRODUÇÃO A vitamina D representa um grupo de hormônios esteróides com diferentes graus de atividade, mas com ações biológicas semelhantes. 1 Poucos alimentos são fontes de vitamina D sendo a produção endógena pela exposição solar a principal fonte dessa vitamina nos seres humanos. 2 A vitamina D produzida endogenamente ou ingerida na dieta é metabolizada no fígado, resultando em 25-hidroxivitamina D [25(OH)D], o marcador do estado nutricional da vitamina D em humanos. Subsequentemente, a 25(OH)D é convertida em 1,25-diidroxivitamina D [1,25(OH)2D] no rim, transformandose na forma ativa dessa vitamina. Além da função clássica da 1,25(OH)2D na manutenção das concentrações intra e extracelular de cálcio dentro de uma faixa de variação fisiologicamente aceitável, estudos recentes demonstram que esta também pode exercer ações parácrinas e autócrinas por ser produzida em vários outros tecidos e células do organismo, como no colón, na próstata, na pele, nos macrófagos ativados, nas células pulmonares e, inclusive, nas paratireóides. 3 Alterações no metabolismo mineral são frequentes no curso da doença renal crônica com o surgimento do hiperparatireoidismo secundário já nas fases iniciais da doença. Apesar de vários fatores contribuírem para esse distúrbio, a redução da síntese de 1,25(OH)2D contribui para o desenvolvimento e manutenção do hiperparatireoidismo secundário nessa população. 4 É importante ressaltar que em situação de deficiência de 25(OH)D a síntese de 1,25(OH)2D pode estar prejudicada não somente pela diminuição da função renal, mas também devido à falta de substrato para a síntese. Além disso, alguns estudos in vitro demonstraram uma possível ação direta da 25(OH)D na supressão da 3

16 síntese e secreção do paratormônio (PTH). 5, 6 Portanto, sugere-se que a manutenção das concentrações adequadas de 25(OH)D na DRC pode prevenir e contribuir para o tratamento do hiperparatireoidismo secundário, principalmente nos estágios iniciais da doença. Apesar do valor de referência para determinação da hipovitaminose D ser conflitante entre os estudiosos 7-9, níveis de 25(OH)D em torno de 30 ng/ml tem sido utilizados na DRC. 10 Considerando esses valores, a prevalência de hipovitaminose D em pacientes na fase não dialítica da DRC é elevada, variando de 40 a 88% Mesmo no Brasil, considerado um país com abundante radiação solar, estudos realizados na cidade de São Paulo demonstram uma elevada prevalência de hipovitaminose D na DRC. 17, 18 Nesses pacientes, além dos fatores de risco tradicionais para a hipovitaminose D, outros relacionados à doença, como alterações na pigmentação da pele 19 e perda protéica na urina 17, 18, 20, 21 podem contribuir ainda mais para a elevada prevalência de hipovitaminose D observada nesta população. Considerando a elevada prevalência de hipovitaminose D na DRC e os efeitos benéficos da restauração do estado nutricional de vitamina D nessa população, os guias de práticas clínicas para prevenção e tratamento dos distúrbios do metabolismo mineral ósseo, Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (K-DOQI) 10 e Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) 22, sugerem a suplementação com vitamina D (ergocalciferol ou colecalciferol) para pacientes com DRC na fase não dialítica. Alguns estudos em pacientes na fase não dialítica da DRC utilizando diferentes protocolos de suplementação com ergocalciferol ou colecalciferol, demonstram um efeito benéfico do tratamento no aumento da concentração de 25(OH)D Porém o impacto da suplementação na redução dos níveis de PTH ainda é questionado. 4

17 Além disso, essas recomendações não são baseadas em evidências, já que não existem estudos prospectivos, randomizados e controlados que avaliem o impacto da suplementação com vitamina D (ergocalciferol ou colecalciferol) na normalização da concentração sérica dessa vitamina, bem como seus efeitos sobre o metabolismo mineral nessa população. 5

18 3. REVISÃO DA LITERATURA 1. Vitamina D O termo vitamina D representa um grupo de hormônios esteróides com diferentes graus de atividade, mas com ações biológicas semelhantes. 1 A vitamina D pode ser obtida naturalmente em um número restrito de alimentos ou por meio de alimentos fortificados. Porém, a produção endógena pela exposição solar é considerada a principal fonte de vitamina D, sendo capaz de suprir 90% das necessidades dessa vitamina nos seres humanos. 2 A vitamina D produzida na pele ou ingerida na dieta é metabolizada no fígado, resultando em 25-hidroxivitamina D [25(OH)D], o marcador do estado nutricional da vitamina D em humanos. Subsequentemente, a 25(OH)D é convertida em 1,25- diidroxivitamina D [1,25(OH)2D] no rim, transformando-se na forma ativa dessa vitamina. Os metabólitos da vitamina D apresentam diferentes nomenclaturas de acordo com sua origem: colecalciferol (vitamina D3) ou ergocalciferol (vitamina D2) (Tabela 1). Além disso, essa vitamina apresenta uma nomenclatura complexa, pois apesar de vitamina D ser um termo genérico utilizado frequentemente na literatura e na prática clínica, é importante ressaltar que essa deve ser considerada uma vitamina apenas quando se refere ao colecalciferol e ao ergocalciferol, sendo a 25(OH)D um pré hormônio e a 1,25(OH)2D um hormônio, dependendo das ações biológicas de cada metabólito (Tabela 1). 28 6

19 Tabela 1. Nomenclatura da Vitamina D Parâmetro D 2 e derivados D 3 e derivados Terminologia frequentemente utilizada Componente Vitamina Vitamina Vitamina Abreviação D 2 D 3 D Nomenclatura Vitamina D 2 Vitamina D 3 Vitamina D Sinônimo Ergocalciferol Colecalciferol Produto da 1ª Pré hormônio Pré hormônio Pré hormônio hidroxilação Abreviação 25(OH)D 2 25(OH)D 3 25(OH)D Nomenclatura 25-hidroxivitamina D 2 25-hidroxivitamina D 3 25-hidroxivitamina D Sinônimo Ercalcidiol Calcidiol Produto da 2ª Hormônio Hormônio Hormônio hidroxilação Abreviação 1,25(OH) 2 D 2 1,25(OH) 2 D 3 1,25(OH) 2D Nomenclatura 1,25-diidroxivitamina D 2 1,25-diidroxivitamina D 3 1,25-diidroxivitamina D Sinônimo Ercalcitriol Calcitriol Adaptada de Johal M, Fontes de Vitamina D A vitamina D pode ser obtida por fonte alimentar e alimentos fortificados ou pela produção endógena através da exposição solar Alimentação Na natureza, poucos alimentos são fontes naturais de vitamina D, entre eles o óleo de fígado de peixe, a gordura de peixe (vitamina D3) e as leveduras (vitamina D2). Portanto as fontes alimentares in natura de vitamina D (Tabela 2) são consideradas insuficientes para manter os níveis normais de 25(OH)D no organismo humano. 7

20 Tabela 2. Teor de vitamina D das principais fontes alimentares (100 g de alimento) 31 Alimento Vitamina D (UI) Salmão cozido 347 Ostras 319 Sardinha em óleo 271 Sardinha em água 183 Gema de ovo 107 Fígado bovino 16 Leite integral 41 Queijo (mussarela) 6 Manteiga 56 Em alguns países, principalmente nos Estados Unidos, a fortificação alimentar já é uma medida preventiva bastante empregada. Nesses países, quase toda ingestão de vitamina D se deve aos alimentos fortificados, destacando-se entre eles leite, iogurte, suco de laranja, pães, biscoitos, cereais matinais, cremes vegetais e margarinas. Apesar de ambas as formas da vitamina D serem utilizadas na fortificação de alimentos, a vitamina D3 tem sido mais utilizada. Apesar de no Brasil não existir legislação para a fortificação com vitamina D, as indústrias alimentícias adicionam-na a alguns alimentos, particularmente a fórmulas lácteas, iogurtes e alguns cremes vegetais. 8

21 A ingestão de vitamina D proveniente de alimentos e suplementos é expressa em unidades internacionais (UI) ou microgramas (µg). Uma UI de vitamina D corresponde a 0,025 µg de colecalciferol (vitamina D3). Desta forma, 1 µg equivale a 40 UI. 8 Estima-se que o organismo humano requer aproximadamente a UI de vitamina D2 ou D3 diariamente. 32 Recomendações Nutricionais de Vitamina D Em 1997, o comitê da National Academy of Science, Food and Nutrition Board estabeleceu por meio do documento Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes (DRIs), os valores de referência para ingestão adequada (AI) de vitamina D para a população dos Estados Unidos e Canadá. 33 A AI refere se ao nível de ingestão de um determinado nutriente que deve ser utilizado como base quando as evidências científicas não são suficientes para se estabelecer a sua Cota Diária Recomendada (RDA). Recentemente, em 2011, o comitê da National Academy of Science, Food and Nutrition Board revisou as recomendações anteriores (1997) de ingestão adequada e estabeleceu os valores de referência da Cota Diária Recomendada (RDA) de vitamina D para a população saudável dos Estados Unidos e Canadá, além da ingestão diária máxima de vitamina D isenta de riscos e de efeitos adversos à saúde (UL Upper level intake). 34 A AI, as RDAs e as ULs para vitamina D de acordo com os estágios de vida encontram-se na Tabela 3. Como pode ser observado, houve um aumento nas recomendações de ingestão de vitamina D em todas as faixas etárias, segundo a nova RDA. 9

22 Tabela 3. Cota Diária Recomendada (RDA) de vitamina D de acordo com os estágios de vida. Faixa etária AI (UI/dia) RDA (UI/dia) UL (UI/dia) (ambos os sexos) a 6 meses a 12 meses a 3 anos a 8 anos a 13 anos a 18 anos a 50 anos a 70 anos > 70 anos Gestantes/Lactantes Fonte: Institute of medicine/ Food and nutrition board. 34 Abreviações: AI, ingestão adequada; RDA, Cota Diária Recomendada; UL, ingestão diária máxima recomendada Exposição solar A principal fonte de vitamina D para o ser humano é a síntese endógena, na pele, em consequência da exposição à luz solar. Estudos mostram que, em circunstâncias normais, 90% das necessidades dessa vitamina podem ser atendidas por meio dessa fonte. 2 10

23 A pequena faixa de radiação ultravioleta UVB (comprimento de onda entre 290 e 315 nm) é capaz de penetrar na pele e converter o 7-DHC em pré-vitamina D3, que é rapidamente convertida em vitamina D3 (colecalciferol). Este processo ocorre na epiderme, onde aproximadamente 50% da pré-vitamina D3 é convertida em vitamina D3 em até 2 horas, sendo que entre 12 e 24 horas após a exposição à radiação UVB, a concentração circulante de vitamina D3 atinge níveis máximos. O prolongamento da exposição solar não aumenta a produção de pré-vitamina D3, já que o excesso de radiação promove a formação de isômeros biologicamente inertes de vitamina D (lumisterol e taquisterol), impedindo assim a intoxicação (Figura 1). 35, 36 Figura 1. Produção endógena de vitamina D na pele

24 A eficácia da síntese cutânea de vitamina D3 é determinada por vários fatores, como o conteúdo do 7-DHC na pele, a energia dos fótons que depende do comprimento da onda de radiação UVB ( nm) 37, o ângulo de incidência dos raios solares que é influenciado pela latitude, estação do ano e a hora do dia 38. A pele escura, que possui um maior conteúdo de melanina 39, e o uso de protetores solares 40 suprimem consideravelmente a fotólise do 7-DHC. Além disso, com o processo de envelhecimento ocorre a redução da quantidade de 7-DHC presente na pele Metabolismo da Vitamina D O metabolismo da vitamina está representado na Figura 2. As duas formas de vitamina D (D2 ou D3) são biologicamente inativas e requerem ativações no fígado e no rim. Quando provenientes da alimentação, a vitamina D2 e a D3 são predominantemente absorvidas no intestino delgado juntamente com as gorduras, auxiliadas pela bile produzida no fígado. Após absorção intestinal, a vitamina D é incorporada aos quilomicrons e transportada através do sistema linfático para a circulação. Após a absorção intestinal ou a síntese cutânea, a vitamina D se liga a uma proteína carreadora denominada proteína transportadora de vitamina D (DBP). No fígado, a vitamina D sofre a primeira hidroxilação pela ação da enzima 25-hidroxilase (CYP-450) presente na mitocôndria dos hepatócitos, gerando a 25(OH)D. Apesar de ter pouca atividade biológica, esta é a forma mais abundante e, portanto, o marcador do estado nutricional da vitamina D em humanos. A 25(OH)D, carreada pela DBP, é transportada para o rim, onde é finalmente hidroxilada no carbono 1 pela enzima 25-hidroxivitamina 12

25 D-1α-hidroxilase (1-α hidroxilase; CYP27B1) presente principalmente na mitocôndria das células do túbulo renal proximal, resultando na formação da 1,25(OH)2D, a forma biologicamente ativa da vitamina. Apesar do rim ser o principal sítio de ativação da 25(OH)D, estudos recentes demonstram que a enzima 1-α hidroxilase (CYP27B1) também é encontrada em queratócitos, testículos, cérebro, células ósseas, macrófagos, placenta, células prostáticas, células cancerígenas de cólon, ilhotas pancreáticas e até mesmo em células paratireoideanas. 3 A 1,25(OH)2D produzida no rim é a forma circulante desse hormônio e portanto possui ações endócrinas. Já a 1,25(OH)2D sintetizada em outros tecidos exerce ações parácrinas e autócrinas. A 1,25(OH)2D é excretada principalmente através da bile e da urina. Sabe-se que o passo inicial da degradação metabólica da 25(OH)D e da 1,25(OH)2D é a hidroxilação no carbono 24, formando a 24,25(OH)2D e a 1,24,25(OH)3D, que são excretadas através da urina. Alguns fatores são importantes e atuam diretamente estimulando ou suprimindo a síntese de 1,25(OH)2D. Entre eles destacam-se o paratormônio (PTH), o fósforo e o fator de crescimento de fibroblasto-23 (FGF-23). O PTH é um hormônio produzido pelas glândulas paratireoideanas cuja função é regular a homeostase do cálcio no organismo, e sua síntese é estimulada principalmente em situações de hipocalcemia. Nesta situação, o PTH estimula a atividade da enzima 1-α hidroxilase renal, aumentando a síntese de 1,25(OH)2D. Esta por sua vez, estimula a absorção intestinal de cálcio e atua nas células paratireoideanas inibindo a produção e secreção de PTH por meio da inibição da transcrição do RNA mensageiro do pré-pró- PTH. A concentração sérica de fósforo influencia a síntese de 1,25(OH)2D, independente 13

26 dos níveis de PTH. Assim, na deficiência de fósforo ocorre aumento da atividade da enzima 1-α hidroxilase e, ao contrário, em situações de elevação da carga de fósforo, a atividade dessa enzima é inibida. Dessa forma, a síntese de 1,25(OH)2D é regulada promovendo maior ou menor absorção intestinal de fósforo. 41 Adicionalmente, tanto a 1,25(OH)2D quanto o PTH são necessários no túbulo renal distal para aumentar a reabsorção de cálcio. 42, 43 Descoberto há aproximadamente 10 anos, o hormônio fosfatúrico FGF-23, membro da família dos fatores de crescimento de fibroblastos, é secretado pelos osteócitos e exerce efeitos no metabolismo mineral. Uma das funções do FGF-23 é estimular a fosfatúria por meio da internalização do co-transportador sódio-fósforo no túbulo proximal, causando uma diminuição da reabsorção renal de fósforo. De fato, na última década, inúmeros trabalhos têm mostrado que o FGF-23 está profundamente envolvido nos sistemas regulatórios do metabolismo do fósforo, assumindo um papel central na sua regulação. Além disso, o FGF-23 também age suprimindo a atividade da 1- α hidroxilase nas células renais e estimulando a atividade da enzima 24-hidroxilase, o que reduz a síntese e aumenta o catabolismo da 1,25(OH)2D. 44, 45 Adicionalmente, estudos em animais e in vitro com células da paratireóide demonstram que o FGF-23 também inibe a secreção de PTH. 46, 47 14

27 Adaptado de Holick, MF Figura 2. Metabolismo da vitamina D. 15

28 4. Mecanismos de Ação da Vitamina D A 1,25(OH)2D exerce suas ações através de vias não genômicas e genômicas. A via não genômica é responsável por gerar respostas rápidas, ainda não bem descritas. Provavelmente, a 1,25(OH)2D atua estimulando proteínas nas membranas celulares responsáveis pelo controle de fluxo intracelular de cálcio. Este mecanismo de ação é responsável, por exemplo, pelo estímulo rápido na absorção intestinal de cálcio. 49 A ação genômica da 1,25(OH)2D depende da ligação desta com o seu receptor nuclear (vitamin D receptor- VDR) contido em todos os tecidos responsivos à vitamina D. Este mecanismo de ação da vitamina D acontece quando a 1,25(OH)2D, após se dissociar da proteína de ligação da vitamina D (DBP), entra através da membrana celular por difusão simples e interage no núcleo celular com o VDR, formando um complexo receptor-esteróide (RXR- VDR). A ativação através dessa ligação possibilita a interação do RXR-VDR com genes responsivos à vitamina D ou a modulação de sua própria expressão gênica Funções da Vitamina D A função clássica da forma ativa da vitamina D [1,25(OH)2D] no organismo se dá no metabolismo mineral, tendo como órgãos alvo principalmente o intestino, os ossos e as paratireóides. Na ausência de vitamina D, somente 10 a 15% do cálcio e 60% do fósforo dietéticos são absorvidos, sendo que a ligação da 1,25(OH)2D com o seu receptor no enterócito aumenta a eficiência de absorção intestinal do cálcio para 30 a 40% e do fósforo para 80%. 8 No enterócito, a ligação da 1,25(OH)2D ao seu receptor (VDR) 16

29 estimula a síntese de RNA mensageiro da proteína de ligação do cálcio, aumentando a captação do cálcio pela borda-em-escova, facilitando o seu transporte. No tecido ósseo, a 1,25(OH)2D é reconhecida pelos receptores de vitamina D presentes nos osteoblastos. Esta ligação estimula a expressão de fatores de ativação nuclear (RANKL) no osteoblasto, que se ligam aos seus receptores (RANK) presentes em pré-osteoclastos, induzindo a sua diferenciação em osteoclasto maduro. O osteoclasto maduro, por sua vez, remove cálcio e fósforo do osso com objetivo de manter os níveis normais destes minerais na circulação, processo este conhecido como reabsorção óssea. 8 As funções não clássicas da vitamina D, aquelas não relacionadas ao metabolismo mineral, são possíveis porque diversos tecidos expressam a enzima 1-α hidroxilase (CYP27B1) em combinação com receptores (VDR) para 1,25(OH)2D. Portanto, a vitamina D também pode exercer ações parácrinas e autócrinas. Direta ou indiretamente, a 1,25(OH)2D controla mais de 200 genes. Acredita-se que a produção local de 1,25(OH)2D nas mamas, cólon, próstata, entre outros tecidos, regula genes envolvidos na proliferação celular, na inibição da angiogênese e na diferenciação e apoptose, especialmente em situações patológicas. 51 A 1,25(OH)2D é considerada também um potente imunomodulador, pois sua produção local em macrófagos estimula a catelicidina, um peptídio capaz de destruir agentes infecciosos. Age também em linfócitos T, possibilitando a síntese de citocinas, e nos linfócitos B, na regulação das imunoglobulinas. Dados recentes demonstram que a vitamina D parece inibir a síntese de renina, aumentar a produção e a sensibilidade à insulina e aumentar a contratibilidade miocárdica. 8, 51, 52 17

30 6. Avaliação do Estado Nutricional de Vitamina D A concentração circulante de 25(OH)D é o melhor parâmetro para determinar o estado nutricional da vitamina D, já que representa a soma da fotoprodução no decurso de várias semanas a vários meses, e da ingestão dietética tanto de vitamina D2 quanto de D3. 53 A meia vida da 25(OH)D é de três semanas, e suas concentrações são determinadas por um ensaio de proteína ligadora competitiva específica utilizando a proteína ligadora de vitamina D. 54 A concentração sérica de 25(OH)D pode ser expressa em ng/ml ou nmol/l, sendo que 2,5 nmol/l equivale a 1 ng/ml. O valor de referência para determinação de deficiência de vitamina D é conflitante entre os estudiosos. 7-9 Os valores são normalmente baseados na relação entre a concentração de 25(OH)D com a absorção de cálcio e com secreção de PTH. Sabe-se que valores de 25(OH)D próximos a 30 ng/ml estão associados com a absorção ideal de cálcio. 55 Níveis mais elevados não aumentam a absorção, ocorrendo provavelmente um platô. Em relação aos níveis de PTH, estudos mostram que existe uma associação inversa entre 25(OH)D e PTH, sendo que quando os valores de 25(OH)D estão em torno de 30 a 40 ng/ml, as concentrações de PTH se estabilizam. 56, 57 Da mesma forma, concentrações de 25(OH)D acima de 30 ng/ml também têm sido associadas com diversos benefícios para a saúde, como a redução do risco de fraturas, prevenção de câncer colorretal, capacidade funcional e saúde bucal. 7 Atualmente alguns autores consideram como deficiência níveis de 25(OH)D abaixo de 20 ng/ml, sendo a hipovitaminose D caracterizada por concentrações de 25(OH)D abaixo de 30 ng/ml. 8, 58 A intoxicação por vitamina D é rara e está geralmente associada a concentrações de 25(OH)D superiores a 150 ng/ml associadas com hipercalcemia e/ou hiperfosfatemia. 8 18

31 A 1,25(OH)2D, forma ativa da vitamina D, apresenta uma meia-vida circulante de 4 a 6 horas. Consideram-se valores normais de 1,25(OH)2D entre 16 e 60 pg/ml, entretanto sua utilização é de pequeno valor na avaliação da deficiência de vitamina D, pois à medida que a deficiência progride, há um aumento na produção e secreção do paratormônio, estimulando a atividade da enzima 1- -hidroxilase nos túbulos renais. Portanto, o hiperparatireoidismo secundário associado à deficiência de vitamina D acelera a conversão de 25(OH)D em 1,25(OH)2D. Como a concentração circulante de 25(OH)D é aproximadamente vezes maior que a de 1,25(OH)2D, concentrações séricas bastante reduzidas de 25(OH)D podem proporcionar substrato suficiente para a formação de 1,25(OH)2D. 59 Assim, observa-se uma relação bifásica entre estes dois metabólitos da vitamina D: positiva quando as concentrações de 25(OH)D estão dentro do normal, e negativa quando os valores estão reduzidos. 60 As concentrações séricas de vitamina D2 (ergocalciferol) e D3 (colecalciferol) não são indicadores do estado nutricional de vitamina D, pois além de terem uma meia vida relativamente curta (24 horas), apresentam uma ampla variação na concentração sanguínea, de 0 a 120 ng/ml dependendo da ingestão de vitamina D e da exposição a luz solar

32 7. Causas e Conseqüências da Hipovitaminose D As principais causas de deficiência de vitamina D estão relacionadas com a redução da síntese cutânea e da absorção intestinal e com as alterações metabólicas (Tabela 4). Tabela 4. Principais causas da hipovitaminose D. Pouca exposição à luz UVB Uso excessivo de roupas Países localizados em alta latitude Pouca penetração de luz UVB durante o inverno na atmosfera Uso de protetores ou filtros solares Confinamento em locais onde não há exposição à luz UVB Diminuição da capacidade de sintetizar vitamina D pela pele Envelhecimento Grande quantidade de melanina (pele negra) Obesidade Sequestro de vitamina D pelo tecido adiposo Menor exposição ao sol Doenças que alteram o metabolismo da 25(OH)D ou 1,25(OH)2D Doença renal crônica Síndrome nefrótica Doença hepática Má Absorção Doença de Crohn Doença de Whipple Fibrose Cística Doença Celíaca Adaptado de Premaor, ; Holick MF,

33 A melanina, pigmento presente na pele, é um dos fatores que reduz a síntese cutânea de vitamina D devido à competição com o 7-DHC por fótons ultravioleta. Ela surgiu como um fator de proteção para a produção excessiva de vitamina D, principalmente em populações que viviam em regiões situadas próximas a linha do equador, sendo assim, um protetor solar natural. Atualmente, essa proteção é obtida com o uso de filtro solar que pode reduzir a síntese de vitamina D em 97,5%. 2 A produção cutânea da vitamina D pode ainda ser influenciada pela latitude e pelo ângulo de incidência dos raios solares. Quando o ângulo da irradiação solar se torna mais oblíquo, os fótons UVB são mais eficientemente absorvidos pela camada de ozônio da atmosfera, e, consequentemente, um menor número deles alcança a superfície da Terra. Desta forma, fica evidente a variação cíclica na concentração de vitamina D3 em função da estação do ano e latitude, com picos no verão e redução significativa no inverno. 63 A idade também interfere na conversão da vitamina D na pele. Os idosos têm diminuição na concentração de pré-vitamina D3 na pele como consequência da redução do 7-DHC. Portanto, a carência de vitamina D em idosos é frequentemente devida à menor síntese cutânea, e não à redução da absorção intestinal da vitamina D. Outras causas da hipovitaminose D em idosos seriam a menor exposição solar, a ingestão alimentar insuficiente e as interações medicamentosas. 35 A obesidade também tem sido apontada como uma causa de deficiência de vitamina D A associação entre aumento da adiposidade e a redução da concentração sérica de 25(OH)D foi descrita há mais de 30 anos. A hipótese para esta relação é o fato da vitamina D ser uma substância lipossolúvel que pode ser facilmente sequestrada e estocada no tecido adiposo, sendo que sua liberação para a circulação, em situações de necessidade, é extremamente lenta. 8 De fato, vários estudos mostram que a 21

34 biodisponibilidade da vitamina D é menor em indivíduos obesos. 64, 65, 67, 68 Worstman e colaboradores demonstraram que a quantidade do precursor 7-DHC era similar entre obesos e não obesos, no entanto, após a exposição aos raios UVB, o nível circulante de vitamina D3 foi 57% menor nos obesos em relação aos indivíduos não obesos. 69 Outras causas da elevada prevalência de hipovitaminose D nos obesos incluem a menor exposição desses indivíduos à luz solar e um possível feedback negativo em decorrência dos níveis elevados de 1,25 (OH)2D na síntese hepática da 25(OH)D. 67, 70 A hipovitaminose D está associada, principalmente, ao desenvolvimento de doenças ósseas, como a osteoporose, osteomalácia, osteopenia e, em crianças, o raquitismo. Além disso, em idosos a deficiência de vitamina D leva a alterações musculares e aumento nas quedas e fraturas. 8 Estima-se que aproximadamente 33% das mulheres com idade entre 60 e 70 anos e 60% daquelas com mais de 80 anos tenham osteoporose. O déficit de vitamina D é um fator determinante desta alteração e a suplementação desta vitamina associada a suplementação com cálcio se mostrou como um fator de proteção óssea em diversos estudos. As doenças crônicas não transmissíveis representam cerca de 60% a 70% das causas de morte em países considerados desenvolvidos. Estudos epidemiológicos já demonstraram associação inversa entre latitude e níveis de vitamina D, com aumento no risco de desenvolvimento destas doenças, especialmente no aumento na taxa de mortalidade por câncer de mama, cólon, ovário, próstata, reto, rim, pulmão e mioloma múltiplo. 71 Esta relação foi reforçada após a descoberta da presença, em diversos tecidos, de 1-α hidroxilase e de receptores de vitamina D

35 8. Epidemiologia da Hipovitaminose D Cerca de 1 bilhão de pessoas em todo o mundo apresentam hipovitaminose D, sendo que, entre os idosos que vivem nos Estados Unidos e na Europa, a inadequação no estado nutricional de vitamina D está presente em % dos casos. 8 A deficiência de vitamina D é mais comum nos países da Europa quando comparados aos Estados Unidos, sendo que 40% dos adultos europeus apresentam deficiência de vitamina D durante o inverno. 72 No Brasil sempre se considerou que a prevalência de hipovitaminose D seria pequena em função da localização preponderantemente na região tropical, onde a incidência de luz solar é considerada abundante. Poucos estudos, entretanto, avaliaram o estado nutricional de vitamina D no país. O primeiro estudo, realizado em 1984 em Recife (latitude 8º), região com significativa irradiação solar durante todo o ano, mostrou que crianças desnutridas que viviam expostas a luz solar apresentavam os mesmos níveis de 25(OH)D de crianças eutróficas da mesma região, indicando a importância da irradiação solar. Os autores também observam que, comparando as concentrações de 25(OH)D, os dois grupos de crianças brasileiras apresentaram valores superiores aos de crianças inglesas. 73 Mais recentemente, com as mudanças no estilo de vida da população, uma elevada prevalência (60%) de insuficiência de vitamina D foi observada em adolescentes residentes no interior do estado de São Paulo (latitude 23º). 74 Um outro estudo que incluiu 250 idosos não instuticionalizados residentes na cidade de São Paulo, observou uma elevada prevalência de deficiência [15,4%; 25(OH)D< 10 ng/ml] e insuficiência [41,9%; 25(OH)D entre 10 e 20 ng/ml] de vitamina D. Estes achados são bastante semelhantes aos encontrados em países com menor irradiação solar. 75 Recentemente, Unger e 23

36 colaboradores demonstraram uma elevada prevalência (77,4%) de hipovitaminose D após o inverno em uma amostra de 603 indivíduos saudáveis na faixa etária de 18 a 90 anos residentes na cidade de São Paulo. No mesmo estudo, 209 indivíduos foram reavaliados novamente após o verão e foi observado que apesar da prevalência de hipovitaminose D ter diminuído de forma significativa, 37,3% dos indivíduos ainda permaneciam com níveis de 25(OH)D inferior a 30 ng/ml. 76 Embora a deficiência grave de vitamina D com conseqüências como raquitismo e osteomalácia seja rara no Brasil, estima-se que a prevalência de hipovitaminose D em toda população seja elevada, especialmente entre idosos, negros, pessoas que trabalham em ambientes fechados e que raramente se expõem ao sol ou ainda naqueles que usam protetor solar regularmente. Porém, estudos populacionais são necessários para conhecer a incidência e a prevalência de inadequação no estado nutricional de vitamina D na nossa população nas diferentes regiões, para avaliar a necessidade de ações de prevenção e tratamento, particularmente nos grupos de risco. 9. Tratamento da Hipovitaminose D Tanto o colecalciferol (vitamina D3) quanto o ergocalciferol (vitamina D2) podem ser empregados no tratamento da hipovitaminose D. Contudo, ainda existem controvérsias a respeito da similaridade dessas duas formas. Estudos sugerem que tanto o colecalciferol quanto o ergocalciferol são eficientes em elevar os níveis de 25(OH)D. No entanto, o colecalciferol parece ser mais eficiente na manutenção da concentração sérica de 25(OH)D quando comparado ao ergocalciferol. 77, 78 Um estudo realizado por Holick e colaboradores demonstrou que o colecalciferol e o ergocalciferol são equivalentes em 24

37 manter os níveis de 25(OH)D, porém, nesse estudo, a dose de tratamento utilizada foi menor que a utilizada nos demais estudos. 79 Recentemente, Heaney e colaboradores demonstraram que o colecalciferol é 87% mais potente que o ergocalciferol em aumentar e manter os níveis de 25(OH)D. 80 Apesar das controvérsias, os pesquisadores da área sugerem o uso de colecalciferol como suplemento para o tratamento da hipovitaminose D. A Tabela 5 mostra as estratégias propostas de suplementação com colecalciferol ou ergocalciferol utilizadas para a prevenção e para o tratamento da hipovitaminose em adultos saudáveis. 8 25

38 Tabela 5. Estratégias de suplementação para a prevenção e o tratamento da hipovitaminose D em indivíduos saudáveis. Causas de hipovitaminose D Prevenção Tratamento Adultos Exposição insuficiente à luz solar ou redução do 7-DHC na pele devido ao envelhecimento (acima de 50 anos de idade) UI de colecalciferol/dia; UI de ergocalciferol a cada 2 semanas ou a cada mês; Exposição à luz solar; UI de ergocalciferol semanalmente durante 8 semanas, se a concentração de 25(OH)D se mantiver < 30 ng/ml, repetir a mesma dose. Dose segura: até UI de colecalciferol /dia por 5 meses; Dose de manutenção: UI a cada 2 semanas ou a cada mês. Gestação e lactação (utilização fetal, inadequada exposição à luz solar) UI de colecalciferol/dia; UI de ergocalciferol a cada 2 semanas; UI de ergocalciferol semanalmente durante 8 semanas, se a concentração de 25(OH)D se manter < 30 ng/ml, repetir a mesma dose. Dose segura: Até UI de colecalciferol/dia por 5 meses; Dose de manutenção: UI de ergocalciferol a cada 2 ou 4 meses. Obesidade UI de colecalciferol /dia; UI de ergocalciferol a cada 2 semanas; UI de ergocalciferol semanalmente durante 8 a 12 semanas, se a concentração de 25(OH)D se manter < 30 ng/ml, repetir a mesma dose. Fonte: Adaptado de Holick, MF Dose de manutenção: UI de ergocalciferol a cada 1,2 ou 4 semanas. 26

39 10. Hipovitaminose D na Doença Renal Crônica A doença renal crônica (DRC) é uma síndrome clínica decorrente da perda lenta, progressiva e irreversível das funções renais. São classificados como portadores de DRC indivíduos com dano renal ou taxa de filtração glomerular inferior a 60 ml/min/1,73m 2 por um período maior ou igual a 3 meses. 81 Alterações no metabolismo mineral são frequentes no curso da DRC com o surgimento do hiperparatireoidismo secundário já nas fases iniciais da doença. Apesar de vários fatores contribuírem para esse distúrbio, a redução do cálcio sérico, o aumento do fósforo sérico e a redução da síntese de 1,25(OH)2D são os principais fatores que contribuem para o desenvolvimento e manutenção do hiperparatireoidismo secundário nessa população. 4 Com a progressão da DRC, a redução da síntese de 1,25(OH)2D ocorre como consequência da diminuição da atividade da enzima 1-α hidroxilase renal, devido à redução da massa renal funcionante ou em consequência do aumento dos níveis de FGF É importante ressaltar que a redução dos níveis de 25(OH)D também pode contribuir para a diminuição da síntese de 1,25(OH)2D devido à falta de substrato. Sempre se considerou que a avaliação e o acompanhamento da concentração sérica de 25(OH)D em pacientes com DRC não teria importância clínica, já que nessa doença a hidroxilação renal da 25(OH)D estaria prejudicada. No entanto, como já mencionado, a 1,25(OH)2D pode ser produzida em vários outros tecidos e células do organismo, como no colón, na próstata, na pele, nos macrófagos ativados, nas células pulmonares e, inclusive, nas paratireóides. Além disso, alguns estudos in vitro com células da paratireóide demonstraram uma possível ação direta da 25(OH)D na supressão da síntese e secreção do PTH. 5, 6 Portanto, sugere-se que a manutenção das concentrações 27

40 adequadas de 25(OH)D na DRC pode prevenir e contribuir para o tratamento do hiperparatireoidismo secundário, principalmente nos estágios iniciais da doença. Conforme descrito na Tabela 6, o guia de práticas clínicas para prevenção e tratamento dos distúrbios do metabolismo mineral ósseo Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (K-DOQI) 10, publicado em 2003, apresenta a classificação do estado nutricional de vitamina D na DRC. Tabela 6. Classificação do estado nutricional de vitamina D em pacientes com DRC. 10 Concentrações séricas de 25(OH)D (ng/ml) Classificação do estado nutricional de vitamina D <5 Deficiência grave 5-15 Deficiência leve Insuficiência >30 Suficiência Utilizando a concentração sérica de 25(OH)D inferior a 30 ng/ml, os estudos apontam que a hipovitaminose D é uma situação frequente em pacientes com DRC. A Tabela 7 mostra os principais estudos realizados em diversos países que avaliaram os níveis de 25(OH)D na fase não dialítica na DRC. Como pode ser observado, em média, o nível de 25(OH)D foi inferior a 30 ng/ml na maioria dos estudos, independente do estágio da doença, variando de 40 a 88%. Mesmo no Brasil, considerado um país com abundante radiação solar, estudos realizados na cidade de São Paulo (região subtropical) demonstram uma elevada prevalência de hipovitaminose D. 17, 18 Apesar de 28

41 algumas diferenças entre os estudos relacionadas aos fatores associados com os níveis circulantes de 25(OH)D, é importante ressaltar que na maioria deles foi observada uma associação direta entre os níveis de 25(OH)D e 1,25(OH)2D , 16, 17 Este resultado demonstra a importância da manutenção de níveis adequados 25(OH)D nos pacientes com DRC, visto que a atividade da enzima 1-α hidroxilase renal é substrato dependente e, dessa forma, quanto maior a concentração do precursor 25(OH)D, maior será a síntese de 1,25(OH)2D. Ademais, em quatro dos estudos descritos na Tabela 7 os níveis de PTH foram inversamente e independentemente associados com os níveis de 25(OH)D, sugerindo um efeito direto ou indireto da 25(OH)D na redução da síntese de PTH. 12, 13, 16, 18 Já em pacientes na fase dialítica, a prevalência de hipovitaminose D é mais elevada, chegando a atingir 92% dos pacientes em hemodiálise 82, 83 e 100% dos pacientes em diálise peritoneal 20 (Tabela 8). Além disso, pode-se observar que nos pacientes em diálise peritoneal os níveis de 25(OH)D são mais reduzidos quando comparado àqueles em hemodiálise. Os fatores associados com os níveis circulantes de 25(OH)D na fase dialítica são semelhantes aos encontrados na fase não dialítica da DRC. Nos pacientes portadores de DRC, além dos fatores de risco tradicionais para a hipovitaminose D, como a menor exposição ao sol, obesidade, uso de medicamentos e elevada proporção de pacientes idosos e diabéticos, outros fatores relacionados à doença, como alterações na pigmentação da pele 19 e perda protéica na urina ou possivelmente no fluído de diálise 14, 16-18, 20 podem contribuir ainda mais para a elevada prevalência de hipovitaminose D observada nesta população. 29

42 Tabela 7. Prevalência de hipovitaminose D na fase não dialítica da doença renal crônica. Estudos Amostra Localização Concentração sérica de 25(OH)D * (ng/ml) Ishimura E et al, Gonzalez EA et al, Laclair RE et al, Stavroulopoulos A et al, Cuppari, L et al, Mehrotra R et al, Ravani P et al, Figuiredo-Dias et al, pacientes (37 DM/ 39 não DM) 43 pacientes 201 pacientes (DRC estágio 3 e 4) 89 pacientes (DRC estágio 3 e 4; 34% DM) 144 pacientes (não DM) 3011 pacientes (DRC estágios 1 a 4) 168 pacientes (DRC estágios 2 a 5; 26%DM) 120 pacientes (DRC estágios 2 a 5) Japão Estados Unidos Estados Unidos Reino Unido Brasil (São Paulo) Prevalência de hipovitaminose D [25(OH)D < 30 ng/ml] 16,9 ± 9,4 (Grupo total) 22,3 ± 9,4 (não DM) Não disponível 11,4 ± 5,6 (DM) 18,5 ± 11,2 86% 19,4 ± 13,6 (Grupo total) 23,3 ± 14,5 (DRC estágio 3) 18,6 ± 13,3 (DRC estágio 4) 21,5 ± 12,8 78% 71% DRC estágio 3 84% DRC estágio 4 Fatores associados com a concentração sérica de 25(OH)D (+) 1,25(OH) 2D, (+) Albumina, (-) DM e (-) fósforo sérico. (+) 1,25(OH) 2D e (-) PTH. (+) 1,25(OH) 2D, (+) Cálcio sérico, (-) PTH e gênero. (-) IMC, (+) Albumina, (-) proteinuria e (+) etfg. 34,3 ± 18,3 40% (+) 1,25(OH) 2D, (+) Cálcio sérico e (-) proteinúria. Estados Unidos 27,5 ± 0,5 64% Associação não avaliada. Itália 18,1 (13-26)** Brasil (São Paulo) 23,8 ± 9,5 75% 62% estágio 2 79% estágio 3 85% estágio 4 88% estágio 5 (+) 1,25(OH) 2D, (-) Idade, (+) sexo masculino, (-) DM, (-) DCV, (+) albumina, (-) PCR, (+) etfg, (-) proteinuria, (+) cálcio sérico e (-) PTH. (-) proteinuria, (-) gordura corporal subcutânea, (-) PTH, (-) índice HOMA e (-) leptina. * média ± desvio-padrão; ** mediana e interquartis; (+) associação direta; (-) associação inversa. Abreviações: 25(OH)D, 25-hidroxivitamina D; 1,25(OH) 2D, 1,25-diidroxivitamina D; DM, diabetes mellitus; DRC, doença renal crônica; IMC, índice de massa corporal; etfg, taxa de filtração glomerular estimada; DCV, doença cardiovascular; PCR, proteína C-reativa. 30

43 Tabela 8. Prevalência de hipovitaminose D na fase dialítica da doença renal crônica. Estudos Amostra Tratamento Localização Concentração sérica de 25(OH)D* (ng/ml) Wolf M et al, Saab G et al, Del Valle E et al, pacientes incidentes HD Estados Unidos Prevalência 25(OH)D < 30 ng/m] Fatores associados com a concentração sérica de 25(OH)D 21,0 ± 13,0 78% (-) PTH, (+) albumina, (+) cálcio sérico e (+) 1,25(OH) 2D. 16,7 ± 8,3 92% Nenhuma associação foi 131 pacientes (início do HD Estados estudo) Unidos encontrada. 84 pacientes HD Argentina 24,4 (<5 79)*** 76% (-) IMC, (+) Albumina, (-) proteinuria e (+) etfg. Blair D et al, pacientes (início do estudo) HD Estados Unidos 28,6 ± 15,0 (homens) 18,9 ± 10,1 (homens) 92% (+) Grau de exposição solar, (+) creatinina, (+) Albumina e (-) IMC. Matias P J et al, 158 pacientes HD Portugal 22,3 ± 12,0 80% Associação não avaliada Shah N et al, pacientes DP Estados < 7,0 (6,9 8)*** 100% Associação não avaliada. Unidos Taskapan H, et al, pacientes DP Grécia/ Turquia 7,3 ± 8,4 (grupo total) 8,1 ± 9,2 (não DM) 4,8 ± 4,1 (DM) 96% (-) Idade, (+) DM, (+)cálcio sérico e (+) 1,25(OH) 2D. Wang AYM, et al pacientes DP Hong Kong 18,3 (14,3 24,3)** 87% (-) DM, (-) sexo feminino e (-) perda da função renal residual. Gracia-Iguacel et al, pacientes: HD= 94 (81%) DP= 21 (19%) HD DP Espanha 11 (6-16)*** (HD) 9 (6 12) *** (DP) 93% Associação não avaliada separadamente de acordo com o tipo de terapia. * média ± desvio-padrão; ** mediana e interquartis; *** extremos; (+) associação direta; (-) associação inversa. Abreviações: 25(OH)D, 25-hidroxivitamina D; 1,25(OH) 2D, 1,25-diidroxivitamina D; DM, diabetes mellitus; HD, hemodiálise; DP, diálise peritoneal; IMC, índice de massa corporal; etfg, taxa de filtração glomerular estimada. 31

44 11. Tratamento da hipovitaminose D na Doença Renal Crônica Nos pacientes com DRC e hipovitaminose D, a suplementação com vitamina D visa fornecer substrato [25(OH)D] suficiente para a síntese renal, particularmente naqueles pacientes que ainda têm função renal residual. Além disso, níveis adequados de 25(OH)D são necessários para que ocorra a síntese extra-renal de 1,25(OH)2D em diversos tecidos que expressam a enzima 1-α hidroxilase, incluindo as células da paratireóide. Dessa forma, o tratamento, entre outros benefícios, pode prevenir ou minimizar o desenvolvimento do hiperparatireoidismo nos estágios iniciais da DRC ou atenuar o aumento do PTH nas fases mais avançadas da doença. Considerando a elevada prevalência de hipovitaminose D na DRC e os efeitos benéficos da restauração do estado nutricional de vitamina D nessa população, os guias de práticas clínicas para prevenção e tratamento dos distúrbios do metabolismo mineral ósseo, Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (K-DOQI) 10 e Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) 22, sugerem a suplementação com vitamina D (ergocalciferol ou colecalciferol) para pacientes com DRC na fase não dialítica. A dose recomendada para a suplementação, segundo o K-DOQI, varia de acordo com o grau de deficiência ou insuficiência de vitamina D (Tabela 9). No entanto, essas recomendações não são baseadas em evidências, já que não existem estudos prospectivos, randomizados e controlados que avaliem o impacto da suplementação com vitamina D (ergocalciferol ou colecalciferol) na normalização da concentração sérica dessa vitamina, bem como seus efeitos sobre o metabolismo mineral nessa população. 32

45 Tabela 9. Recomendações para o uso de vitamina D2 no tratamento de deficiência ou insuficiência de vitamina D em pacientes com DRC (estágio 3 e 4) segundo o K-DOQI. 10 Concentração sérica de 25(OH)D Definição ng/ml (nmol/l) <5 (12) Deficiência grave de vitamina D 5-15 (12-37) Deficiência leve de vitamina D (40-75) Insuficiência de vitamina D Dose de Ergocalciferol Oral (Vitamina D 2 ) UI por semana durante 12 semanas; após esse período essa dose uma vez por mês UI por semana durante 4 semanas; após esse período essa dose uma vez por mês IU uma vez por mês Duração (meses) Comentários 6 Medida das concentrações de 25(OH)D depois de 6 meses 6 Medida das concentrações de 25(OH)D depois de 6 meses 6 meses Mais recentemente, o guia de práticas clínicas KDIGO sugere a suplementação com ergocalciferol ou colecalciferol em situações de hipovitaminose D com a mesma dose recomendada para a população geral. 22 A Tabela 10 mostra os principais estudos de suplementação com vitamina D (ergocalciferol/colecalciferol) em pacientes na fase não dialítica na DRC. Como pode ser observado, há uma grande variabilidade na metodologia utilizada entre os estudos, principalmente com relação ao tipo de suplemento (ergocalciferol ou colecalciferol), dose, duração do tratamento e tamanho da amostra. Apesar dos diferentes protocolos de suplementação, é possível observar que em todos os estudos houve um aumento significativo na concentração de 25(OH)D após o tratamento. Porém, somente em dois estudos 23, 25 o nível médio atingido foi superior a 30 ng/ml, considerado adequado segundo o K-DOQI. 10 É importante ressaltar que nenhum dos estudos avaliou os fatores associados com a resposta à suplementação. Dois estudos retrospectivos testaram a proposta de suplementação sugerida 33

46 pelo K-DOQI. 24, 27 Apesar de em ambos ter ocorrido um aumento significativo nos níveis de 25(OH)D, somente 54% 24 e 25% 27 dos pacientes atingiram níveis acima de 30 ng/ml. Com relação aos efeitos da suplementação na diminuição do PTH, somente no estudo onde aproximadamente metade dos pacientes restaurou os níveis de 25(OH)D foi observado esse efeito. 24 Dessa forma, parece que níveis mais elevados de 25(OH)D são necessários para que se tenha um impacto benéfico nos níveis de PTH. No entanto, não é possível concluir de forma definitiva sobre os efeitos da suplementação na redução do PTH, uma vez que a maioria dos estudos são retrospectivos e não controlados. Um estudo duplo-cego, randomizado e controlado realizado por Chandra et al demonstrou que a restauração dos níveis de 25(OH)D em 20 pacientes com DRC estágios 3 e 4 foi associada com uma diminuição de 31% nos níveis de PTH no grupo tratado (n= 10) em comparação com 7% no grupo placebo (n= 10). No entanto, esta redução não alcançou significância estatística provavelmente devido à variabilidade e ao tamanho amostral. 25 Nenhum efeito adverso, como hiperfosfatemia, hipercalcemia ou intoxicação por vitamina D foi observado nesses estudos. A suplementação com ergocalciferol ou colecalciferol também tem sido empregada em pacientes na fase dialítica da DRC (Tabela 11). Apesar da variabilidade na metodologia entre os estudos, principalmente com relação à estratégia de tratamento utilizada, em todos os eles o nível médio de 25(OH)D foi superior a 30 ng/ml após a suplementação, sendo que em três desses 82, 87, 92 o número de pacientes que atingiram tal nível foi maior que 86%. Adicionalmente, é importante ressaltar que mesmo em pacientes em hemodiálise, a suplementação com colecalciferol resultou num aumento da concentração sérica de 1,25(OH)2D. 87, 92 34

47 Dessa forma, estudos de intervenção, bem desenhados e com um número maior de pacientes são necessários não somente para determinar o tipo, a dose e a duração da suplementação com vitamina D, mas também para estabelecer a concentração sérica ideal de 25(OH)D para obter os efeitos benéficos da suplementação em pacientes com DRC. Considerando que nos pacientes na fase não dialítica da DRC a gravidade dos distúrbios do metabolismo mineral é menor, a manutenção da concentração sérica de 25(OH)D nessa população pode contribuir para a prevenção desses distúrbios durante a progressão da DRC. 35

48 Tabela 10. Suplementação com vitamina D em pacientes na fase não dialítica da DRC. Estudos Desenho do estudo e amostra Suplementação com vitamina D Principais resultados Zisman A et al, Observacional (n= 52; DRC estágios 3 e 4) Al-Aly et al, Retrospectivo (n= 66; DRC estágios 3 e 4) Ergocalciferol dose de acordo com a recomendação do K-DOQI Ergocalciferol - dose de acordo com a recomendação do K-DOQI 25(OH)D: Estágio 3 da DRC: 20,3 1,3 para 31,6 2,2 ng/ml; Estágio 4 da DRC: 18,8 1,3 to 35,4 1,9 ng/ml 25(OH)D > 30 ng/ml 60% dos pacientes PTH somente nos pacientes no estágio 3 da DRC 1,25 (OH) 2 D 25(OH)D (16,6 0,7 para 27,2 31,8 ng/ml) 25(OH)D < 30 ng/ml 50% dos pacientes PTH somente nos pacientes no estágio 3 da DRC Chandra P et al, Estudo piloto, duplo cego, randomizado e controlado (n=20; DRC estágios 3 e 4) Rucker D, Prospectivo, controlado (n=128; DRC estágios 3 a 5) Qunibi W.Y. et al, Retrospectivo (n=88; DRC; estágios 3 a 5) Colecalciferol UI/semana durante 12 semanas Colecalciferol Grupo tratado: UI/dia durante 3 meses Ergocalciferol dose de acordo com a recomendação do K-DOQI Grupo tratado: 25(OH)D ( 17,3 para 49,4 ng/ml)* 25(OH)D > 30 ng/ml 94% dos pacientes Não houve mudança nos níveis de PTH (P=0,07) e 1,25 (OH) 2 D Grupo tratado: 25(OH)D (16,0 5,6 para 26,8 10,4 ng/ml) 25(OH)D < 30 ng/ml 63% dos pacientes Não houve mudança nos níveis de PTH 25(OH)D (15,1 5,8 para 23,3 11,8 ng/ml) 25(OH)D > 30 ng/ml 25% dos pacientes Não houve mudança nos níveis de PTH * média geométrica Abreviações: 25(OH)D, 25-hidroxivitamina D; 1,25(OH)2D, 1,25-diidroxivitamina D; PTH, paratormônio; DRC, doença renal crônica 36

49 Tabela 11. Suplementação com vitamina D em pacientes na fase dialítica da DRC. Estudos Desenho do estudo e amostra Dose e tipo de vitamina D empregada Principais resultados Shah N et al, Prospectivo (n=29; pacientes em DP) Blair D et al, Retrospectivo (n= 171 com seguimento; pacientes em HD) Saab G et al, Retrospectivo (n= 118; pacientes em HD) Jean G. et al, Prospectivo (n=107; pacientes em HD) Matias P J, Prospectivo (n=158; pacientes em HD) Ergocalciferol IU/semana durante 4 semanas Ergocalciferol IU/semana durante 24 semanas Ergocalciferol UI/semana durante 6 meses Colecalciferol UI/mês durante 15 meses Colecalciferol (durante 1 ano) 25(OH)D<15 ng/ml UI/semana 25(OH)D entre 16 e 30 ng/ml UI/semana 25(OH)D>30 ng/ml UI 3 x/semana 25(OH)D (7 to 30 ng/ml)* 25(OH)D > 30 ng/ml 38% dos pacientes Não houve mudança nos níveis de PTH e 1,25(OH) 2 D 25(OH)D (18,4 9,0 to 42,0 24,7 ng/ml) cálcio sérico Não houve mudança nos níveis de PTH 25(OH)D (16,9 8,5 to 53,6 16,3 ng/ml) 25(OH)D > 30 ng/ml 95% dos pacientes Não houve mudança nos níveis de PTH 25(OH)D (12,8 5,2 para 42,3 10,8 ng/ml) 25(OH)D > 30 ng/ml 91% dos pacientes 1,25 (OH) 2 D PTH e fosfatase alcalina óssea 25(OH)D (22,3 12,0 para 42,0 12,1 ng/ml) 25(OH)D > 30 ng/ml 86% dos pacientes PTH, cálcio e fósforo séricos e albumina sérica 1,25 (OH) 2 D * mediana Abreviações: 25(OH)D, 25-hidroxivitamina D; 1,25(OH)2D, 1,25-diidroxivitamina D; PTH, paratormônio, HD, hemodiálise; DP, diálise peritoneal. 37

50 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. G MAH. Calcium, phosphorus, and vitamin D metabolism in renal disease and chronic renal failure. In: In: Kopple JDM, S.G., ed. Nutritional management of renal disease. 2nd ed ed. Baltimore: Williams & Wilkins;; 1997:p Holick MF. Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases, cancers, and cardiovascular disease. Am J Clin Nutr 2004;80:1678S-88S. 3. Segersten U, Correa P, Hewison M et al. 25-hydroxyvitamin D(3)-1alphahydroxylase expression in normal and pathological parathyroid glands. J Clin Endocrinol Metab 2002;87: Levin A, Bakris GL, Molitch M et al. Prevalence of abnormal serum vitamin D, PTH, calcium, and phosphorus in patients with chronic kidney disease: results of the study to evaluate early kidney disease. Kidney Int 2007;71: Kawahara M, Iwasaki Y, Sakaguchi K et al. Predominant role of 25OHD in the negative regulation of PTH expression: clinical relevance for hypovitaminosis D. Life Sci 2008;82: Ritter CS, Armbrecht HJ, Slatopolsky E, Brown AJ. 25-Hydroxyvitamin D(3) suppresses PTH synthesis and secretion by bovine parathyroid cells. Kidney Int 2006;70: Bischoff-Ferrari HA, Giovannucci E, Willett WC, Dietrich T, Dawson-Hughes B. Estimation of optimal serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Am J Clin Nutr 2006;84: Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007;357: Malabanan A, Veronikis IE, Holick MF. Redefining vitamin D insufficiency. Lancet 1998;351:

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60 5. OBJETIVOS Objetivo Geral Investigar os efeitos da suplementação com colecalciferol sobre marcadores séricos do metabolismo mineral de pacientes com hipovitaminose D na fase não dialítica da doença renal crônica. Objetivos Específicos Avaliar se o protocolo de suplementação com UI semanais de colecalciferol durante 3 meses, ajustado para UI mensais por mais 3 meses, é suficiente para normalizar a concentração sérica de 25(OH)D de pacientes com deficiência de vitamina D [25(OH)D< 15 ng/ml]; Avaliar se o protocolo de suplementação com UI mensais de colecalciferol durante 6 meses, é suficiente para normalizar a concentração sérica de 25(OH)D de pacientes com insuficiência de vitamina D [25(OH) D 15 e < 30 ng/ml]; Investigar os fatores associados com a resposta à suplementação com colecalciferol.. 48

61 6. PROTOCOLO DE ESTUDO Como os resultados do presente estudo estão resumidos nos dois artigos incluídos nessa sessão, optamos por incluir uma breve explicação do protocolo de estudo empregado. O seguinte protocolo de estudo foi realizado: Seleção (n= 319) Avaliação do status Pacientes com 25(OH) D 30 ng/ml (n= 177) Pacientes com 25(OH) D > 30 ng/ml (n= 142) Grupo Deficiente 25(OH) D < 15 ng/ml (n= 45) Grupo Insuficiente 25(OH) D 15 ng/ml n= 75 Tratamento Colecalciferol UI/semana Randomização Cego Placebo 50 gotas/mês n= 37 Colecalciferol (gotas) UI/mês n= 38 Figura 1. Fluxograma de diagnóstico e tratamento para o protocolo. 49

62 Seleção e protocolo de estudo De março de 2007 a julho de 2009 foram avaliados, em relação ao status de vitamina D, 319 pacientes que são acompanhados no Ambulatório de Tratamento Conservador da Doença Renal Crônica da Fundação Oswaldo Ramos Hospital do Rim e Hipertensão. Desse total, 142 pacientes apresentaram suficiência de vitamina D [25(OH)D 30 ng/ml]. Os 177 pacientes restantes que apresentaram 25(OH)D < 30 ng/ml realizaram os exames iniciais para avaliar a elegibilidade para o estudo. Desse total, 56 pacientes foram excluídos por diversos motivos como depuração de creatinina superior ou inferior ao valor determinado para a inclusão (entre 15 a 59 ml/min), recusa em participar, início de terapia dialítica, PTH > 500 pg/ml, proteinúria > 3g/mL e alteração de transaminases hepáticas. Assim, 121 pacientes foram incluídos no estudo sendo 46 pacientes com deficiência de vitamina D [25(OH) D < 15 ng/ml] e 75 pacientes com insuficiência de vitamina D [25(OH) D 15 e < 30 ng/ml]. Esses últimos foram aleatoriamente alocados em dois grupos: Grupo Colecalciferol (n= 38 pacientes) ou Grupo Placebo (n= 37 pacientes). Todos os pacientes incluídos no estudo receberam protetor solar durante o período de suplementação. Desta forma, o presente trabalho resultou em 2 estudos. 50

63 7. Cholecalciferol supplementation in chronic kidney disease: restoration of vitamin D status and impact on parathyroid hormone Abstract The benefits and the factors influencing the restoration of vitamin D status have been poorly investigated in patients with chronic kidney disease (CKD). We examined the impact of oral vitamin D supplementation on serum makers of bone and mineral metabolism in 45 CKD patients (stages 3 and 4) with vitamin D deficiency (25(OH)D <15 ng/ml) and investigated the factors associated with the response to the supplementation. There was a significant increase in 25(OH)D levels at 3 and 6 months when compared to baseline. In the first 3 months under the cholecalciferol dose of 50,000 IU per week, 78% of the patients achieved serum concentration of 25(OH)D 30 ng/ml. In the following 3 months, when the dose of cholecalciferol was adjusted to 50,000 IU per month, only 43% of those patients were able to maintain adequate vitamin D status. PTH levels decreased at 3 months of supplementation but returned to baseline levels after 6 months. Changes of 25(OH)D occurred in the first 3 months correlated positively with changes in 1,25(OH)2D. Changes in PTH correlated positively with changes in serum creatinine and negatively with changes in ionized calcium. Increased adiposity was associated with lower response to vitamin D supplementation. This study demonstrated that 50,000 IU of cholecalciferol per week was effective to restore vitamin D status with a significant reduction in the PTH levels of CKD patients with vitamin D deficiency. Keywords: vitamin D, chronic kidney disease, cholecalciferol, body fat, parathyroid hormone. 51

64 INTRODUCTION Hypovitaminosis D is highly prevalent among patients with chronic kidney disease (CKD) and it has been associated with mortality even in the earlier stages of the disease. 1, 2 Studies have documented that 40 to 100% of CKD patients are vitamin D deficient or insufficient. 3-8 The interest on the evaluation of vitamin D status in CKD has been revitalized in the last few years after the knowledge that extrarenal sites, including the parathyroid glands, are able to synthesize 1,25-dihydroxyvitamin D [1,25(OH)2D] locally via its precursor 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D]. Thus, restoration and maintenance of adequate vitamin D status has been considered of importance for these patients in view of the potential benefit of vitamin D in the prevention and treatment of bone and mineral metabolism derangements. Earlier 9 and more recent 10 guidelines on the management of CKD-related bone and mineral disorders point out the importance of treating hypovitaminosis D. However, a protocol of treatment with the greatest benefit for CKD population has not been well established. Although an increasing number of studies on vitamin D supplementation in CKD has emerged in the recent years 11-15, evidence is still lacking to define adequate dose, frequency and duration for the treatment of hypovitaminosis D in these patients. Furthermore, the factors associated with the response to vitamin D supplementation of CKD patients has not been investigated so far. Therefore, in the current study we aimed to evaluate the effect of cholecalciferol supplementation on serum markers of bone and mineral metabolism of CKD patients with vitamin D deficiency [25(OH)D <15 ng/ml] and to examine the factors associated with the response to vitamin D therapy in these patients. 52

65 PATIENTS AND METHODS Patients During the period between March 2007 and July 2009, 319 patients with CKD (stages 3 and 4) from a single renal outpatient clinic of Federal University of São Paulo (São Paulo, SP, Brazil) underwent assessement of vitamin D status. Vitamin D deficiency [25(OH)D <15 ng/ml] was found in 68 patients (21%) and 46 of them were eligible for participating in the study. Exclusion criteria were age < 18 years, CKD stage 1, 2 or 5, serum ionized calcium > 1.40 mmol/l, intact PTH > 500 pg/ml, urinary protein > 3 g/24 h, liver disease, active malignancy, autoimmune or infectious disease, human immunodeficiency virus and use of any type of vitamin D compounds, or corticosteroids or immunosuppressive drugs in the previous 3 months. The Human Investigation Review Committee of the Federal University of São Paulo approved the study protocol and informed consent was obtained from each patient. Study protocol This was a 6-month prospective interventional study. At baseline and at the end of 3 and 6 months, the following laboratory parameters were determined: 25(OH)D, 1,25(OH)2D, serum ionized calcium, serum phosphorus, intact parathormone (PTH), fibroblast growth factor 23 (FGF-23), creatinine, albumin, C-reactive protein (CRP) and 24-h urinary creatinine, protein, calcium and phosphorus. Serum glucose and insulin were determined only at baseline and after 6 months. Body composition analysis and nutritional assessment were performed at baseline. 53

66 During the period of treatment, patients had monthly visits to monitoring ionized calcium, phosphorus and PTH. A non-calcium phosphate binder was prescribed if serum phosphorus increased to values higher than 4.6 mg/dl. Patients were discontinued from the study if serum ionized calcium, PTH or 25(OH)D increased to values higher than 1.40 mmol/l, 500 pg/ml, and 150 ng/ml, respectively. Supplementation protocol The patients underwent oral supplementation of cholecalciferol (1,000 IU/drop; Magister Handling Pharmacy Ltd., São Paulo, SP, Brazil). During the first 3 months they were instructed to take 50 drops once a week (50,000 IU/week). After this period, the patients who achieved 25(OH)D levels 30ng/mL received a dose of 50,000 IU per month in the next 3 months. For the others, the dose of 50,000 IU/week was maintained. In order to minimize the effects of skin production of vitamin D all patients received a sunscreen (SPF 30) and were instructed to use it during the study period. Laboratory parameters Blood samples were obtained after an overnight fasting. All the procedures performed with the blood samples for the determination of 25(OH)D and 1,25(OH)2D were protected from light. The serum samples obtained were frozen at a temperature of 80ºC. 25-hydroxyvitamin D2 and D3 (chemiluminescence) and 1,25-dihydroxyvitamin D2 and D3 (radioimmunoassay) were determined by using a commercial kit (DiaSorin Inc, Stillwater, MN, USA). Intact PTH (Abbott Architect i2000 assay, chemiluminescence; normal range: 15 to 68 pg/ml), FGF-23 by ELISA (Kainos, Tokyo, Japan normal range: 8.2 to 54.3 pg/ml), albumin (bromcresol 54

67 green), insulin (immunofluorometric assay - normal range: 2.5 to 25.0 UI/mL) and highsensitivity C-reactive protein (chemiluminescence) were determined. Serum phosphorus (normal range: male= 2.4 to 4.6 mg/dl; female= 2.3 to 4.3 mg/dl) and ionized calcium (normal range: 1.11 to 1.40 mmol/l) were measured by using a standard autoanalyzer and bicarbonate (normal range: 23 to 27 mmol/l) with an automated potentiometer. Insulin resistance was assessed by HOMA index using the equation described by Mathews and coworkers. 16 Patients were carefully instructed to collect 24-h urine to measure creatinine, protein, calcium and phosphorus. Proteinuria was defined as any urinary protein excretion. Glomerular filtration rate was estimated by creatinine clearance corrected for body surface area. Nutritional status and body composition BMI was calculated as body weight divided by squared height. Nutritional status was evaluated by the 7-point Subjective Global Assessment. 17 Body composition was assessed by dual energy X-ray absorptiometry (DEXA) by using a scanner DPX model (Lunar Radiation Corporation Madison, WI, USA). Total body fat and truncal fat were divided by squared height (kg/m²) and were stratified according to the median values of the sample according to gender (body fat index: 10.7 kg/m² for women and 6.7 kg/m² for men; truncal fat index: 5.8 kg/m² for women and 4.1 kg/m² for men). Skin color According to the skin color the patients were classified as white (I, II, III, IV), brown (V) and black (VI) by Fitzpatrick Classification Scale. 18 For the analyses, patients were grouped as white (I, II, III) or dark (white IV, brown and black). 55

68 Statistical Analyses Data were expressed as mean ± SD or frequency. Non-normally distributed variables such as 25(OH)D, 1,25(OH)2D, PTH, FGF-23, CRP, HOMA index, serum creatinine, creatinine clearance, urinary protein and urinary calcium were log transformed (natural base). Analysis of variance (ANOVA) or paired t-test was used for analysis of follow-up data. Pearson linear correlation coefficients were calculated to evaluate associations among changes of variables. Independent Student t-test or chi-square test was performed for comparing the baseline characteristics between the groups according to the response to oral cholecalciferol supplementation. Multiple logistic regression analysis was performed to investigate the factors related to the response to vitamin D therapy. All tests were two-sided and a P values < 0.05 were considered significant. All analyses were performed using SPSS software, version 15.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). 56

69 RESULTS From the 46 patients included in the study one patient was discontinued due to hypercalcemia (serum ionized calcium > 1.40 nmol/l). Therefore, the study was completed with 45 patients (age was years, 58% women, 42% diabetics, and 56% dark skin color). According to the 7-point subjective global assessment criteria, the majority of patients (73%) was classified as well-nourished, and body mass index (BMI) was indicative of overweight ( kg/m²). Etiologies of kidney disease were diabetic nephropathy in 12 patients (27%), hypertensive nephropathy in 12 (27%), interstitial nephritis in 2 (4.4%), polycystic kidney disease in 3 (6.6%), glomerulonephritis in 3 (6.6%), other diseases in 3 (6.6%), and undetermined cause in 10 (22.2%). Proteinuria was found in 28 patients (62%). Sixty-two percent of the patients were using angiotensin-converting enzyme inhibitors, 29% angiotensin II receptor blockers and 9% were taking both antihypertensive medications. No patient was in use of calcium supplements or phosphate binders at baseline. The laboratory parameters during the follow-up are summarized in Table 1. There was a significant increase in 25(OH)D levels at 3 and 6 months when compared to baseline. At 3 months of the study, in which the cumulative dose of cholecalciferol was 656,444 ± 114,239 IU, 78% of the patients reached levels of 25(OH)D 30 ng/ml. At 6 months, in which the cumulative dose of cholecalciferol was reduced to 310,000 ± 222,741 IU, restoration of vitamin D was observed in 58%. Of note, from those patients who normalized vitamin D status at 3 months and underwent dose adjustment (from IU/week to IU/month) only 43% were able to maintain adequate 25(OH)D levels thereafter. Intact parathormone (PTH) levels decreased at 3 months of supplementation but at 6 months PTH 57

70 returned to levels similar to baseline. The monthly measurement of PTH depicted in Figure 1 allows us to visualize that the significant reductions of PTH occurred after at 3 and 4 months, which corresponds to the period that patients received the highest dose of cholecalciferol. Fibroblast growth factor 23 (FGF-23) increased at 3 months and returned to the baseline levels at 6 months (Table 1). A significant increase in serum creatinine and urinary calcium and a tendency of decreasing creatinine clearance were observed during the follow-up. No changes were observed in 1,25(OH)2D, ionized calcium, serum phosphorus, serum bicarbonate, albumin, C-reactive protein, HOMA index, and urinary protein and phosphorus. No adverse effects were observed during the study. The correlations of changes in 25(OH)D with changes in 1,25(OH)2D and PTH after 3 months are shown in Figure 2A and Figure 2B, respectively. The associations of changes among the laboratory parameters that occurred in the first 3 months are demonstrated in Table 2. Variations in PTH were inversely correlated with changes in ionized calcium and directly related with changes in serum creatinine. FGF-23 changes were directly correlated with changes in serum phosphorus and tended to correlate with changes in serum creatinine. While changes of serum phosphorus correlated directly with variations in serum creatinine, an inverse association between changes in serum calcium and changes in serum creatinine was observed. In order to investigate the factors associated with lower response to cholecalciferol supplementation, baseline characteristics of the patients who restored 25(OH)D to normal levels (n=35) were compared to those who did not normalize vitamin D status (n= 10) after 3 months, period in which all patients underwent the same protocol of vitamin D supplementation. The group of patients who did not respond to vitamin D supplementation 58

71 had lower renal function (P= 0.04), higher truncal fat index (P< 0.01), and a greater proportion of patients with BMI 25 kg/m 2 (P= 0.03) (Table 3). The multivariate logistic regression analysis adjusted for baseline urinary protein and changes in serum creatinine, pointed out increased adiposity as the main factor associated with lower response to vitamin D supplementation (BMI 25 kg/m 2 : = 2.35, SE= 1.15, P= 0.04; truncal fat index: = 2.59, SE= 1.13, P= 0.02). 59

72 TABLES Table 1. Laboratory parameters during the follow-up (n= 45). Baseline Month 3 Month 6 P 25(OH)D (ng/ml) 11.2 ± ± 16.4 a 38.1 ± 16.0 a Intact PTH (pg/ml) ± ± 76.6 a ± ,25(OH)2D (pg/ml) 42.1 ± ± ± Serum ionized calcium (mmol/l) 1.29 ± ± ± Serum phosphorus (mg/dl) 3.8 ± ± ± FGF-23 (pg/ml) 99.9 ± ± 92.2 a, b 98.6 ± Serum bicarbonate (mmol/l) 23.2 ± ± ± Serum albumin (g/dl) 4.2 ± ± ± C-reactive protein (mg/dl) 0.58 ± ± ± HOMA index 3.1 ± ± Serum creatinine (mg/dl) 2.3 ± ± 0.9 a 2.5 ± 1.0 a 0.01 Creatinine clearance (ml/min) 34.5 ± ± ± Urinary calcium (mg/24hs) 40.1 ± ± 49.3 a 53.4 ± 49.2 a Urinary protein (g/24hs) 0.8 ± ± ± Fractional excretion phosphorus (%) 28.1 ± ± ± Urinary phosphorus (g/24hs) ± ± ± Data presented as mean SD Abbreviations: 25(OH)D, 25-hydroxyvitamin D; 1,25(OH)2D, 1,25-dihydroxyvitamin D; PTH, pathormone; FGF-23, fibroblast growth factor 23. To convert serum 25-hydroxyvitamin D in ng/ml to nmol/l multiply by a P<0.01 vs Baseline b P<0.01 vs Month 6 60

73 Table 2. Correlation coefficients (r) of changes (baseline to month 3) of mineral metabolism parameters. 25(OH)D (ng/ml) r (P) Intact PTH (pg/ml) r (P) FGF-23 (pg/ml) r (P) Serum creatinine (pg/ml) r (P) 25(OH)D (ng/ml) (0.15) (0.99) (0.87) 1,25(OH)2D (pg/ml) 0.37 (0.01) (0.82) (0.63) (0.42) serum ionized calcium (mmol/l) 0.12 (0.45) (0.004) (0.69) (<0.001) serum phosphorus (mg/dl) 0.12 (0.43) 0.14 (0.35) 0.36 (0.02) 0.40 (0.007) serum creatinine (mg/dl) (0.87) 0.38 (0.01) 0.27 (0.07) Abbreviations: 25(OH)D, 25-hydroxyvitamin D; 1,25(OH)2D, 1,25-dihydroxyvitamin D; PTH, pathormone; FGF-23, fibroblast growth factor 23 61

74 Table 3. Baseline characteristics of the patients according to 25(OH)D levels at 3 months. Non responders Responders P N= 10 N= 35 25(OH)D ng/ml 23.9 ± ± 14.1 <0.001 Gender (women (%)] 6 (60) 20 (57) 1.0 Age (year) 60.2 ± ± Diabetes [n (%)] 5 (50) 14 (40) 0.57 Stage of CKD [n(%)] Stage 3 4 (40) 21 (60) 0.30 Stage 4 6 (60) 14 (40) BMI (kg/m²) 30.0 ± ± BMI 25.0 kg/m² [n(%)] 9 (90) 1 (49) 0.03 Truncal fat index (kg/m 2 ) 7.1 ± ± Higher than median value [n(%)] 9 (90) 13 (37) Total fat index (kg/m 2 ) 11.9 ± ± Higher than median value [n(%)] 8 (80) 16 (46) (OH)D (ng/ml) 11.5 ± ± ,25(OH)2D (pg/ml) 45.5 ± ± Intact PTH (pg/ml) ± ± FGF-23 (pg/ml) 87.4 ± ± Serum ionized calcium (nmol/l) 1.30 ± ± Serum phosphorus (mg/dl) 4.0 ± ± Serum creatinine (mg/dl) 2.6 ± ± Creatinine clearance (ml/min) 28.5 ± ± Urinary protein (g/24hs) 1.06 ± ± Data presented as mean SD Abbreviation: BMI, body mass index, 25(OH)D, 25-hydroxyvitamin D; 1,25(OH)2D, 1,25- dihydroxyvitamin D; PTH, pathormone; FGF-23, fibroblast growth factor 23. Truncal and total body fat index were stratified according to median values for each gender. To convert serum 25-hydroxyvitamin D in ng/ml to nmol/l multiply by

75 FIGURES 63

76 64

77 DISCUSSION Given the high prevalence of hypovitaminosis D in CKD population and its association with adverse outcomes, to find a protocol of vitamin D supplementation that provides the greatest benefit for these patients is of paramount importance. In the present study, we tested the impact of oral cholecalciferol supplementation of 50,000 IU per week for 3 months with a dose adjustment thereafter on serum parameters of bone and mineral metabolism in nondialyzed CKD patients with vitamin D deficiency. The majority of the patients normalized vitamin D status in the first 3 months on therapy and a significant reduction in the PTH levels was observed. However, after dose adjustment to 50,000 IU per month in those patients who normalized 25(OH)D levels, the protocol seemed to be not effective to preserve adequate vitamin D status and control PTH. Few studies have investigated the effects of vitamin D supplementation in the earlier stages of CKD and the results are not consistent In a prospective controlled trial with 128 CKD patients (stages 3 to 5) receiving a daily dose of 1,000 IU of cholecalciferol during 3 months, 25(OH)D levels increased from 16.0 ± 5.6 to 26.8 ±10.4 ng/ml, but 63% of the patients remained with levels below 30 ng/ml and no changes in PTH were observed. 14 In a doubleblinded randomized and controlled pilot study with 50,000 IU per week of cholecalciferol supplementation, Chandra et al found that 9 of the 10 patients (stages 3 and 4 of CKD) achieved 25(OH)D levels higher than 30 ng/ml within a period of 6 weeks and PTH tended to decrease. 13 The vitamin D supplementation protocol proposed by the NKF-DOQI has been tested in two retrospective studies. 11, 15 In both studies 25(OH)D increased significantly but about 54% of the patients achieved the target of 30 ng/ml in one study 11 and only 25% in the other 15. While in one study PTH reduced in patients on stage 3 of CKD 11 in the other no 65

78 changes in PTH were observed 15. In the current study the mean value of 25(OH)D reached levels higher than 30 ng/ml in both periods of evaluation ( ng/ml at 3 months ng/ml at 6 months) with the greatest impact on PTH at 3 months. A recent meta-analysis including observational and randomized clinical trials on vitamin D (cholecalciferol or ergocalciferol) supplementation in CKD concluded that the improvement in 25(OH)D is associated with the decline in PTH. 19 The mechanisms involved in the variations of PTH are difficult to clearly identify due to the complex and multiple interactions among markers of mineral metabolism. It is well known that calcium and vitamin D are potent regulators of PTH. In the current study serum calcium appeared to be the main factor to influence the decrease in PTH even in the presence of renal function reduction. Therefore, we could speculate that the effect of cholecalciferol supplementation on PTH was indirect by increasing intestinal calcium absorption. Indeed, urinary calcium excretion, a surrogate marker of calcium absorption, increased during the whole period of follow up. Although in our study the impact of vitamin D on PTH seemed to be due to the action of calcium, we cannot exclude a possible direct effect of 1,25(OH)2D or 25(OH)D in the suppression of PTH. However, since 1,25(OH)2D is highly regulated, it would be unlikely to find a relationship of its changes with changes in PTH. Accordingly, no association was observed between changes in 1,25(OH)2D with changes in PTH. Although the correlation between changes in 25(OH)D with changes in PTH did not reach statistical significance (Figure 2B), we could speculate that the greater availability of 25(OH)D might have suppressed PTH synthesis by either increasing the intracellular synthesis 1,25(OH)2D or through a direct interaction of 25(OH)D with the vitamin D receptor within the parathyroid cells as suggested by in vitro studies. 20, 21 66

79 A potential beneficial effect of treating hypovitaminosis D in CKD is to provide adequate amount of substrate [25(OH)D] for the kidney s generation of 1,25(OH)2D. Indeed, in the present study the increase of 25(OH)D was associated with increase in 1,25(OH)2D after the first 3 months of supplementation. In this initial period of treatment the greater availability of substrate might have contributed for the maintenance of 1,25(OH)2D levels since a decrease of 1,25(OH)2D would be expected in response to the reduction of PTH, renal function, and to the increase of FGF-23 that are well known conditions that inhibit 1,25(OH)2D renal synthesis. Proteinuria has been pointed as a contributing factor for decreased serum 25(OH)D in CKD patients. 3, 22 However, as far as we know, no study has investigated whether proteinuria also interferes with the response to vitamin D supplementation. In the current study we were not able to demonstrate clearly the independent role of proteinuria in the response to cholecalciferol, possibly due to the low degree of proteinuria of the patients. The maintenance of serum and urinary phosphorus observed throughout the period of study may have been a consequence of concomitant actions of increased FGF-23 and decreased PTH in month 3 and the other way around on month 6. The increase of FGF-23 in the initial 3 months of treatment is probably the result of increased load of phosphorus due to reduction of renal function or to the increased intestinal absorption of phosphorus as a result of improvement of vitamin D status. Since after 6 months of treatment, FGF-23 returned to baseline levels in face of a decreased renal function and lower 25(OH)D levels, we could speculate that the increased intestinal absorption of phosphorus was likely the main responsible for the FGF-23 elevation at 3 months. It is well known that the actions of FGF-23 are important for the maintenance of serum phosphorus within the normal range during the 67

80 progression of kidney disease. However, observational studies have suggested that increased FGF-23 is associated with progression of CKD 23, 24, cardiovascular events 25 and mortality 26. Whether this hormone actually contributes to these harmful effects or is only a marker of their risk, remains an important unsolved question. It is important to note that the magnitude of the response to cholecalciferol supplementation may vary considerably among individuals depending on the amount of body fat. In the current study, we found that BMI over 25 kg/m 2 and greater truncal fat were the main factors to affect negatively the response. In the general population 27 and, more recently, in CKD 8 obesity has been established as a risk factor for hypovitaminosis D. It has been suggested that vitamin D, either produced in skin or ingested in the diet, is sequestered by the adipose tissue. 28 Thus, it is expected that cholecalciferol given orally may also be sequestered by the adipose tissue cells. In fact, in the present study the group of patients with the lower response had higher proportion of patients with overweight or obesity in comparison with those with better response. To the best of our knowledge, this is the first study to show an association between increased adiposity and poor response to cholecalciferol therapy. A protocol of vitamin D supplementation taking into account the presence of overweight and obesity are warranted. In the present study, we were unable to include a control group given the ethical issues of maintaining patients with vitamin D deficiency untreated during 6 months. Considering the high burden of risk factors associated with bone mineral disturbances among CKD patients and the lack of understanding on the effect of vitamin D supplementation in these patients, we believe that the results of the present study may contribute to a better management of CKD patients in the clinical practice. 68

81 In summary, we demonstrated that the cholecalciferol regimen of 50,000 IU per week during 3 months was effective to restore vitamin D status in the majority of the patients. Replenishing vitamin D resulted in a decrease of PTH levels even with the decline of renal function. Further studies are still necessary not only to establish the most beneficial protocol of vitamin D supplementation but also to evaluate the impact of restoration of vitamin D status on morbity and mortality of CKD patients. 69

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85 25. Seiler S, Reichart B, Roth D, Seibert E, Fliser D, Heine GH. FGF-23 and future cardiovascular events in patients with chronic kidney disease before initiation of dialysis treatment. Nephrol Dial Transplant 2010;Dec;25: Gutierrez OM, Mannstadt M, Isakova T et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N Engl J Med 2008;359: Vilarrasa N, Maravall J, Estepa A et al. Low 25-hydroxyvitamin D concentrations in obese women: their clinical significance and relationship with anthropometric and body composition variables. J Endocrinol Invest 2007;30: Wortsman J, Matsuoka LY, Chen TC, Lu Z, Holick MF. Decreased bioavailability of vitamin D in obesity. Am J Clin Nutr 2000;72:

86 ACKNOWLEDGEMENTS We thank all patients for their participation in the study. This study was supported by the São Paulo Foundation for Research Support (FAPESP n. 2006/ ) and Oswaldo Ramos Foundation. Garcia-Lopes was a recipient of a grant from the São Paulo Foundation for Research Support (FAPESP n. 2006/ ). 74

87 CONFIRMAÇÃO DE SUBMISSÃO DO ARTIGO 1 Mensagem original De: [email protected] Para: [email protected] Assunto: Kidney International - Manuscript ID KI Enviada: 18/03/ :14 18-Mar-2011 Dear Dr. Cuppari: Your manuscript entitled "Cholecalciferol supplementation in chronic kidney disease: restoration of vitamin D status and impact on parathyroid hormone" has been successfully submitted online and is presently being given full consideration for publication in Kidney International. Your manuscript ID is KI Please mention the above manuscript ID in all future correspondence or when calling the office for questions. If there are any changes in your street address or address, please log in to ScholarOne Manuscripts at and edit your user information as appropriate. You can a lso view the status of your manuscript at any time by checking your Author Center after logging in to Thank you for submitting your manuscript to Kidney International. Sincerely, Kidney International Editorial Office 75

88 8. Cholecalciferol supplementation in chronic kidney disease patients with vitamin D insufficiency: a 6-month follow-up. ABSTRACT Background: The effective protocol for treatment of hypovitaminosis D in non-dialysis dependent chronic kidney disease (NDD-CKD) patients has not yet been defined. In the present study we aimed to investigate the impact of cholecalciferol supplementation on serum markers of bone and mineral metabolism using the K/DOQI recommendation for NDD- CKD patients with vitamin D insufficiency. Methods: This was a prospective, randomized, single-blinded interventional study with 6 month of follow-up. This study included 75 patients, randomly assigned for the cholecalciferol group (n=38; 50,000 IU per month for 6 months) or for the placebo group (n=37). Results: After cholecalciferol supplementation, 25(OH)D levels increased significantly at 3 and 6 months in the intervention group and was maintained in the placebo group. No change was found in serum parathyroid hormone as well as in the other serum markers of mineral metabolism studied during the follow-up in both groups. In the end of the study, 46% of the treated patients did not achieve 25(OH)D levels higher than 30 ng/ml. This group of patients had a greater body fat index when compared with those who achieved this level. In the placebo group 40.5% increased 25(OH)D levels higher than 30 ng/ml after 6 months. The season (summer/autumn) when blood was collected for 25(OH)D determination was the only parameter that differed from the group of patients who maintained 25(OH)D levels below 30 ng/ml. 76

89 Conclusion: Our results indicate that the protocol for treatment of vitamin D insufficiency proposed by the K/DOQI guideline seems not to be adequate for completely restore the vitamin D status of NDD-CKD patients. The lack of adequate response to cholecalciferol supplementation together with the unpredicted restoration of vitamin D status in the placebo group may account, at least in part, for the negative results of the present study. Keywords: chronic kidney disease, vitamin D, cholecalciferol, adiposity, season. 77

90 INTRODUCTION Hypovitaminosis D, that is generally defined as serum concentration of 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D] lower than 30 ng/ml, is frequently observed in the general population 1 and more frequently in patients with chronic kidney disease (CKD) 2. Although there is no definite consensus, the majority of experts agree that 25(OH)D levels should be maintained above 30 ng/ml to preserve bone health in individuals with normal renal function. 3-5 The complexity of bone and mineral metabolism disturbances due to CKD, makes it difficult to define what level of 25(OH)D would provide benefits, particularly for the management of secondary hyperparathyroidism. Therefore, since there is no definition of what level of 25(OH)D represents sufficiency in CKD a serum concentration of at least 30 ng/ml has been suggested as a value to be achieved in the treatment of hypovitaminosis D in this population of patients. 6 The ideal effective protocol for treatment of hypovitaminosis D in CKD has not yet been defined. The Clinical Practice Guidelines for Bone Metabolism and Disease in Chronic Kidney Disease (K/DOQI) has proposed a protocol that according to the severity of the hypovitaminosis D for non-dialysis dependent chronic kidney disease (NDD-CKD) patients. In general, for patients with vitamin D deficiency [25(OH) D< 15 e < 30 ng/ml] it is recommended 50,000 IU per week of vitamin D during 4 or 12 weeks depending on the degree of the deficiency. For patients with vitamin D insufficiency [25(OH) D > 16 e < 30 ng/ml] the same dose of vitamin D is recommended (50,000 IU) but the frequency of administration is once a month. 6 Two retrospective studies have tested this proposal. In both reports 25(OH)D increased significantly but, about 54% of the patients achieved the target of 30 ng/ml in one study, and only 25% in the other. 7, 8 A decrease in PTH was found only in 78

91 the study that half of the patients restored vitamin D status. 7 Thus, it seems that high levels of 25(OH)D should be achieved for a beneficial impact on PTH. Given the retrospective nature of these studies and the lack of a control group it is not possible to definitely conclude about the effectiveness and the impact of the K/DOQI proposal for treatment of hypovitaminosis D in NDD-CKD. In the present prospective controlled study, we aimed to investigate the impact of cholecalciferol supplementation on serum markers of bone and mineral metabolism using the K/DOQI recommendation for NDD-CKD patients with vitamin D insufficiency [25(OH) D 15 e < 30 ng/ml]. 79

92 PATIENTS AND METHODS Patients During the period between March 2007 and July 2009, 319 patients with CKD (stages 3 and 4) from a single renal outpatient clinic of Federal University of São Paulo (São Paulo, SP, Brazil) were assessed for vitamin D status. Vitamin D insufficiency [25(OH) D 15 e < 30 ng/ml] was found in 109 patients (34.2%) and 75 of them were eligible for participating in the study. Exclusion criteria were age < 18 years, serum ionized calcium > 1.40 mmol/l, intact PTH > 500 pg/ml and urinary protein > 3 g/24 h, liver disease, active malignancy, autoimmune or infectious disease, human immunodeficiency virus (HIV), use of any type of vitamin D compounds, corticosteroids or immunosuppressive drugs in the previous 3 months. The Human Investigation Review Committee of the Federal University of São Paulo approved the study protocol and informed consent was obtained from each patient. Study protocol This was a prospective, randomized, single-blinded interventional study with 6 month of follow-up. At baseline and at the end of 3 and 6 months, the following laboratory parameters were determined: 25(OH)D, 1,25(OH)2D, serum ionized calcium, serum phosphorus, intact pathyroid hormone (PTH), serum creatinine and 24-h urinary creatinine and protein. 80

93 Fibroblast growth factor 23 (FGF-23) was determined only at baseline and after 6 months. Body composition analysis and nutritional assessment were performed at baseline. During the period of treatment, patients had monthly visits to monitoring serum ionized calcium, phosphorus and PTH. A non-calcium phosphate binder was prescribed if serum phosphorus increased to values higher than 4.6 mg/dl. Patients were discontinued from the study if serum ionized calcium, PTH or 25(OH)D increased to values higher than 1.40 mmol/l, 500 pg/ml, and 150 ng/ml, respectively. Treatment protocol Patients were randomized in blocks of ten and then were assigned to cholecalciferol or placebo group. Cholecalciferol group received 50,000 IU per month of cholecalciferol (1,000 IU/drop). The placebo group received an identical drop in appearance and flavor to cholecalciferol. The cholecalciferol and the placebo drops were prepared in Magister Handling Pharmacy Ltd., São Paulo, SP, Brazil and were personally administrated by one of the investigators during each visit. To minimize the effects of skin production of vitamin D, all patients received a sunscreen protector (SPF 30) and were instructed to use it during the treatment period. Laboratory parameters Blood samples were obtained after an overnight fasting. All the procedures performed with the blood samples for the determination of 25(OH)D and 1,25(OH)2D were protected from 81

94 light. The serum samples obtained were frozen at a temperature of 80ºC. 25-hydroxyvitamin D2 and D3 (chemiluminescence) and 1,25-dihydroxyvitamin D2 and D3 (radioimmunoassay) were determined by using a commercial kit (DiaSorin Inc, Stillwater, MN, USA). Intact PTH (Abbott Architect i2000 assay, chemiluminescence; normal range: 15 to 68 pg/ml) and FGF-23 by ELISA (Kainos, Tokyo, Japan normal range: 8.2 to 54.3 pg/ml) were determined. Serum phosphorus and ionized calcium were measured by using a standard autoanalyzer. Patients were carefully instructed to collect 24-h urine to measure creatinine and protein. Glomerular filtration rate was estimated by creatinine clearance corrected for body surface area. Nutritional status and body composition BMI was calculated as body weight divided by squared height. Nutritional status was evaluated by the 7-point Subjective Global Assessment. 9 Body composition was assessed by dual energy X-ray absorptiometry (DEXA) by using a scanner DPX model (Lunar Radiation Corporation Madison, WI, USA). Total body fat and truncal fat were divided by squared height (kg/m²). Skin color and season According to the skin color the patients were classified as white (I, II, III, IV), brown (V) and black (VI) by Fitzpatrick Classification Scale. 10 For the analyses, patients were grouped as white (I, II, III) or dark (white IV, brown and black). 82

95 For analyses purposes, the season when the blood was collected was grouped in summer/autumn and winter/spring Statistical Analyses Data were expressed as frequencies and mean values with standard deviation (SD) for categorical and continuous variables, respectively. Non-normally distributed variables such as 25(OH)D, 1,25(OH)2D, intact PTH, FGF-23, serum creatinine, creatinine clearance and urinary protein were log transformed (natural base). Independent Student t-test, chi-square test or Fisher s exact-test were performed for comparing the baseline characteristics between cholecalciferol and placebo group and to compare the characteristics between the groups according to the response [25(OH)D < or 30 ng/ml] at 6 months. The mixed model analysis for repeated measures was employed to evaluate the effects of time, group and group-by-time interaction in the variables studied. Adjustments for season and baseline urinary protein was performed in the evaluation of changes of 25(OH)D. All other laboratory parameters were adjusted for changes in serum creatinine. All tests were two-sided and a P value < 0.05 was considered significant. The analyses were performed using SPSS software, version 15.0 (SPSS Inc, Chicago, IL) and SAS for Windows, v

96 RESULTS From the 75 patients included, 38 were randomly assigned for the cholecalciferol group and 37 for the placebo group. At baseline, no differences were observed between the groups in regards to demographic, clinical, nutritional and biochemical parameters (Table 1). No patient was in use of calcium supplements or phosphate binders at baseline. Table 2 shows the laboratory parameters of the groups during the follow-up. Serum 25(OH)D increased significantly at 3 and 6 months in the intervention group and was maintained in the placebo group (Figure 1). No modification in the serum parameters of mineral metabolism as well as in markers of renal function was observed in the cholecalciferol group when applying the mixed model analysis. It is of note however, that at the end of follow-up, 46% of the treated patients did not achieve 25(OH)D levels higher than 30 ng/ml. Comparing the characteristics of these patients with those who achieved this level, the former had a greater body fat index. No other differences were observed (Table 3). Although serum 25(OH)D levels have not increased significantly in the placebo group during the study period, in 40.5% of the patients 25(OH)D was increased to values higher than 30 ng/ml after 6 months. As depicted in Table 4, although a tendency for greater proportion of women and lower body fat index in the group of patients who improved 25(OH)D levels, the season (summer/autumn) when blood was collected was the only parameter that differed significantly from the group of patients who maintained 25(OH)D levels below 30 ng/ml. 84

97 TABLES Table 1. Comparison of baseline characteristics between the groups. Cholecalciferol n = 38 Placebo n = 37 Gender [female (%)] 22 (58) 16 (43) 0.29 Age (years) 64.8 ± ± Skin color White [n (%)] 15 (39.5) 17 (46.0) Dark [n (%)] 23 (60.5) 20 (54.0) Diabetes [n (%)] 15 (39.5) 7 (19) 0.09 Season of blood draw [n (%)] Summer/autumn 18 (47) 12 (32) 0.28 Winter/spring 20 (53) 25 (68) Etiologies of kidney disease Diabetes 10 (26) 3 (8) 0.25 Hypertension 11 (29) 14 (38) Glomerulonephritis 2 (5) 2 (5) Undetermined 9 (24) 8 (22) Other 6 (16) 10 (27) BMI (kg/m²) 27.6 ± ± Body fat index (kg/m²) 9.4 ± ± Truncal fat index (kg/m²) 5.5 ± ± Subjective global assessment [n (%)] well nourished 27 (73) 29 (78) mild-moderately malnourished 10 (27) 8 (22) severely malnourished (OH)D (ng/ml) 21.4 ± ± ,25 (OH) 2 D (pg/ml) 38.7 ± ± Intact PTH (pg/ml) ± ± Serum creatinine (mg/dl) 2.2 ± ± Creatinine clearance (ml/min) 36.7 ± ± Urinary protein (g/24hs) 0.32 ± ± Data presented as mean SD. Abbreviations: BMI: body mass index; 25-hydroxyvitamin D; 1,25(OH) 2D, 1,25- dihydroxyvitamin D; PTH, pathyroid hormone. P

98 Table 2. Laboratory parameters of patients treated with cholecalciferol and placebo during the followup. 25(OH)D (ng/ml) 1,25(OH) 2 D (pg/ml) Intact PTH (pg/ml) Data presented as mean SD Abbreviation: 25(OH)D, 25-hydroxyvitamin D; 1,25(OH) 2D, 1,25- dihydroxyvitamin D; PTH, pathyroid hormone; FGF-23, fibroblast growth factor 23. a P<0.05 vs Baseline Baseline Month 3 Month 6 Cholecalciferol 21.4 ± ± 12.7 a 32.1 ± 13.7 a Placebo 21.6 ± ± ± 11.7 Cholecalciferol 38.7 ± ± ± 19.6 Placebo 45.5 ± ± ± 18.4 Cholecalciferol ± ± ± 86.9 Placebo ± ± ± Serum phosphorus (mg/dl) Cholecalciferol 3.6 ± ± ± 0.6 FGF-23 (pg/ml) Placebo 3.3 ± ± ± 0.6 Cholecalciferol 69.6 ± ± 39.3 Placebo 73.6 ± ± 50.5 Serum ionized calcium (mmol/l) Cholecalciferol 1.30 ± ± ± 0.05 Placebo 1.30 ± ± ± 0.04 Serum creatinine (mg/dl) Cholecalciferol 2.2 ± ± ± 0.80 Placebo 2.2 ± ± ± 0.93 Creatinine clearance (ml/min) Cholecalciferol 36.7 ± ± ± 13.8 Placebo 34.4 ± ± ± 16.0 Urinary protein (g/24hs) Cholecalciferol 0.32 ± ± ± 0.49 Placebo 0.46 ± ± ±

99 Table 3 Parameters of cholecalciferol group according to response at 6 months. 25(OH)D < 30 ng/ml n = 16 Cholecalciferol group Data presented as mean SD; Baseline, 6 months Abbreviation: BMI, body mass index; 25(OH)D, 25-hydroxyvitamin D. a P= 0.41 vs 6 months b P< vs 6 months 25(OH)D 30 ng/ml n = 19 Gender [female (%)] 14 (74) 6 (37.5) 0.07 Age (years) 65.8 ± ± Skin color White [n (%)] 8 (42) 7 (44) Dark [n (%)] 11 (58) 9 (56) BMI (kg/m²) 27.7 ± ± Body fat index (kg/m²) 10.7 ± ± Creatinine clearance (ml/min) 38.3 ± ± Proteinuria [yes/ n (%)] 6 (32) 7 (44) (OH)D (ng/ml) 20.0 ± 3.9 a 22.3 ± 3.0 b (OH)D (ng/ml) 22.0 ± ± 9.9 <0.001 Season of blood draw [n (%)] Summer/autumn 11 (58) 5 (31) 0.21 Winter/spring 8 (42) 11 (69) P

100 Table 4 Characteristics of placebo group according to response at 6 months. 25(OH)D < 30 ng/ml n= 22 Data presented as mean SD; Baseline, 6 months Abbreviation: BMI, body mass index; 25(OH)D, 25-hydroxyvitamin D. a P< 0.02 vs 6 months Placebo group 25(OH)D 30 ng/ml n= 15 Gender [female (%)] 12 (54.5) 4 (27) 0.09 Age (years) 58.5 ± ± Skin color White [n (%)] 10 (45.5) 7 (47) Dark [n (%)] 12 (54.5) 8 (53) BMI (kg/m²) 27.0 ± ± Body fat index (kg/m²) 9.8 ± ± Truncal fat index (kg/m²) 5.6 ± ± Creatinine clearance (ml/min) 35.7 ± ± Urinary protein [n (%)] 15 (68) 8 (53) (OH)D (ng/ml) 21.7 ± 4.5 a 21.3 ± 4.5 a (OH)D (ng/ml) 18.9 ± ± 8.0 <0.001 Season of blood draw [n (%)] Summer/autumn 12 (54.5) 14 (93) Winter/spring 10 (45.5) 1 (7) P

101 FIGURE 89

102 DISCUSSION In the present study we were not able to demonstrate any effect of a 6-month cholecalciferol treatment on serum markers of mineral metabolism in NDD-CKD patients with hypovitaminosis D in the range of insufficiency. It is important to highlight, however, that uncontrolled factors may have contributed to this negative result. The protocol of cholecalciferol supplementation recommended by the K/DOQI guidelines 6 and employed in the current study demonstrated to be inefficient to restore the vitamin D status of a considerable number of patients. In fact, almost half of our treated patients (46%) did not achieve 25(OH)D levels higher than 30 ng/ml at the end of 6 months. Most important, in this group of patients the final level of 25(OH)D has not even changed in comparison to the baseline levels (P= 0.41). The suboptimal response to cholecalciferol supplementation cannot be attributed to poor compliance, given that the vitamin D was personally administrated by one of the investigators during each visit. The comparison of our study with other reports on vitamin D supplementation in regards to restoration of vitamin D status is complicated due to the great variability in the regimen of supplementation used. Nevertheless, the studies show in general, that more than half of the treated patients remain vitamin D insufficient. 7, 8, 11 The potential reasons for the low response have not been investigated in those studies. Our results point out that increased adiposity was the main factor that affected negatively the response to the treatment. Although obesity is a well recognized risk factor for hypovitaminosis D, 12 few studies have evaluated the impact of adiposity on the response to vitamin D supplementation in individuals with normal renal function or in CKD patients

103 Blum et al performed a 3-year interventional study with 257 healthy elderly subjects randomly assigned to treatment with 700 IU/day of cholecalciferol plus 500 mg/day of calcium or to placebo. The authors showed, in the multivariate analysis, that the change in serum 25(OH)D at one year was inversely associated with baseline BMI (P= 0.01) and total body fat (P= 0.04) in the treated subjects. Changes in 25(OH)D in subjects with BMI higher than 30 kg/m² was approximately 21% less than in those with BMI lower than 25 kg/m². 13 In a previous study from our group with NDD-CKD patients with vitamin D deficiency who received 50,000 IU of cholecalciferol for 3 months, we demonstrated that higher body fat affected negatively the response to cholecalciferol. 16 Therefore, it seems reasonable to presume that patients with greater fat mass may require a high dose of vitamin D to effectively treat hypovitaminosis D. In fact, the recommendation of vitamin D for obese individuals with normal renal function is 50,000 IU every week. 1 Thus, the monthly dose of 50,000 IU of cholecalciferol used in our study was probably not sufficient to restore the vitamin D status of patients with greater amount of body fat. Another important aspect that may have contributed to the negative result of our study relies on the fact that 40.5% of the patients in the placebo group spontaneously increased serum 25(OH)D to values higher than 30 ng/ml. The seasonal variation in the study period may have contributed for this finding. Actually, a recent study performed with a group of healthy subjects living in São Paulo as well, demonstrated that the prevalence of hypovitaminosis D was reduced from 76.5% in the winter to 37.3% after summer. 17 To minimize the potential interference of seasonality on 25(OH)D, all patients in our study were provided a sunscreen protector and were repeatedly instructed on how and why it was important using it. However, this conduct was not sufficient to avoid the restoration of 91

104 vitamin D status in a large proportion of patients (40.3%) in the placebo group (Table 4). More importantly, we found that the season when the blood was collected seemed to be the responsible for the restoration of vitamin D status of this group. Indeed, 93% of these patients had blood collected in the summer/autumn at 6 month (Table 4). The combination of these unpredicted events may have been responsible, at least in part, for the negative finding of the current study. Since the target for definition of vitamin D sufficiency in CKD patients has not been well established, we could speculate that a mild degree of hypovitaminosis D, such as in the patients of the present study, may not have relevant influence on the increase of PTH or much higher levels of 25(OH)D should be achieved to effectively promote a reduction of PTH. Recently, we tested in a group of 45 NDD-CKD patients with deficiency of vitamin D the impact of a weekly dose of 50,000 IU of cholcalciferol for 3 months with adjustment to 50,000 IU per month for further 3 months. A decrease of PTH was observed only when almost all patients achieved levels of 25(OH)D higher than 30 ng/ml with a mean level of 43.4 ± 16.4 ng/ml but when the dose adjusted, only 58% of the patients had 25(OH)D higher than 30 ng/ml and PTH returned to baseline levels. 16 In conclusion, our results indicate that the protocol for treatment of vitamin D insufficiency proposed by the K/DOQI guideline seems not to be adequate for completely restoring vitamin D status of these patients. Therefore, further studies are needed not only to establish an effective protocol for replenishing vitamin D but also to determine the impact of such therapy on bone and mineral metabolism in CKD patients. 92

105 REFERENCES 1. Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007;357: Mehrotra R, Kermah DA, Salusky IB et al. Chronic kidney disease, hypovitaminosis D, and mortality in the United States. Kidney Int 2009;76: Holick MF, Siris ES, Binkley N et al. Prevalence of Vitamin D inadequacy among postmenopausal North American women receiving osteoporosis therapy. J Clin Endocrinol Metab 2005;90: Heaney RP, Dowell MS, Hale CA, Bendich A. Calcium absorption varies within the reference range for serum 25-hydroxyvitamin D. J Am Coll Nutr 2003;22: Bischoff-Ferrari HA, Giovannucci E, Willett WC, Dietrich T, Dawson-Hughes B. Estimation of optimal serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Am J Clin Nutr 2006;84: K/DOQI clinical practice guidelines for bone metabolism and disease in chronic kidney disease. Am J Kidney Dis 2003;42:S Al-Aly Z, Qazi RA, Gonzalez EA, Zeringue A, Martin KJ. Changes in serum 25- hydroxyvitamin D and plasma intact PTH levels following treatment with ergocalciferol in patients with CKD. Am J Kidney Dis 2007;50: Qunibi WY, Abdellatif A, Sankar S et al. Treatment of vitamin D deficiency in CKD patients with ergocalciferol: are current K/DOQI treatment guidelines adequate? Clin Nephrol 2010;73: Adequacy of dialysis and nutrition in continuous peritoneal dialysis: association with clinical outcomes. Canada-USA (CANUSA) Peritoneal Dialysis Study Group. J Am Soc Nephrol 1996;7: Fitzpatrick TB. The validity and practicality of sun-reactive skin types I through VI. Arch Dermatol 1988;124:

106 11. Rucker D, Tonelli M, Coles MG, Yoo S, Young K, McMahon AW. Vitamin D insufficiency and treatment with oral vitamin D3 in northern-dwelling patients with chronic kidney disease. J Nephrol 2009;22: Figuiredo-Dias V CL, Garcia-Lopes MG, Carvalho AB, Draibe SA, Kamimura MA. Risk factors for hypovitaminosis D in nondialyzed chronic kidney disease patients. J Ren Nutr 2011;in press. 13. Blum M, Dallal GE, Dawson-Hughes B. Body size and serum 25 hydroxy vitamin D response to oral supplements in healthy older adults. J Am Coll Nutr 2008;27: Dong Y, Stallmann-Jorgensen IS, Pollock NK et al. A 16-week randomized clinical trial of 2000 international units daily vitamin D3 supplementation in black youth: 25-hydroxyvitamin D, adiposity, and arterial stiffness. J Clin Endocrinol Metab 2010;Oct;95: Wortsman J, Matsuoka LY, Chen TC, Lu Z, Holick MF. Decreased bioavailability of vitamin D in obesity. Am J Clin Nutr 2000;72: Garcia-Lopes MG, Pillar R, Kamimura MA, Rocha LA, Canziani ME, Carvalho AB, Cuppari L. Cholecalciferol supplementation in chronic kidney disease: restoration of vitamin D status and impact on parathyroid hormone. Kidney Int 2011;submitted. 17. Unger MD, Cuppari L, Titan SM et al. Vitamin D status in a sunny country: where has the sun gone? Clin Nutr 2010;29:

107 ACKNOWLEDGEMENTS We thank all patients for their participation in the study. This study was supported by the São Paulo Foundation for Research Support (FAPESP n. 2006/ ) and Oswaldo Ramos Foundation. Garcia-Lopes was a recipient of a grant from the São Paulo Foundation for Research Support (FAPESP n. 2006/ ). 95

108 9. CONSIDERAÇÕES FINAIS Os resultados do presente estudo demonstram que: 1. A suplementação com UI por semana de colecalciferol durante 3 meses é eficaz em restaurar o estado nutricional de vitamina D e reduzir os níveis de PTH em pacientes na fase não dialítica da DRC com deficiência de vitamina D. A dose de UI por mês parece não ser suficiente para manter o estado nutricional de vitamina D nesses pacientes. 2. A dose de suplementação de vitamina D recomendada pelo guia K-DOQI de UI por mês de colecalciferol durante 6 meses não exerceu efeitos sobre os parâmetros do metabolismo mineral em pacientes na fase não dialítica da DRC com insuficiência de vitamina D. Além disso, não foi suficiente para restaurar o estado nutricional de vitamina D nesses pacientes. 3. A maior quantidade de gordura corporal foi o principal fator que influenciou de forma negativa a resposta à suplementação com colecalciferol sobre os níveis de 25(OH)D de pacientes com deficiência ou insuficiência de vitamina D. 96

109 10. Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa 97

110 11. ANEXOS ANEXO 1. Trabalhos apresentados em eventos científicos: Effect of cholecalciferol on parameters of mineral metabolism in CKD patients with deficiency of vitamin D Trabalho apresentado na sessão de tema livre no XV International Congress on Metabolism and Nutrition in Renal Disease, Lausanne/Suíça Maio/2010. Autores: MG Garcia-Lopes, Pillar R, Canziani ME, Carvalho A, Draibe S, Cuppari L. Effect of cholecalciferol supplementation on mineral metabolism parameters in CKD patients with vitamin D deficiency Trabalho apresentado na forma de painel American Society of Nephrology - Renal Week San Diego, CA 22 de outubro a 01 de novembro de Autores: M.G.Garcia-Lopes; R. Pillar; L. Rocha; M. E. Canziani A. Barbosa; S.A. Draibe; L. Cuppari. O resultado do trabalho apresentado no evento foi incluído recentemente em uma metanálise publicada em 2010: - Kandula P, Dobre M, Schold JD, Schreiber MJ, Jr., Mehrotra R, Navaneethan SD. Vitamin d supplementation in chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis of observational studies and randomized controlled trials. Clin J Am Soc Nephrol 2010;6:

111 ANEXO 2. Artigos publicados em períodos: Figuiredo-Dias V, Cuppari L, Garcia-Lopes MG, Carvalho AB, Draibe SA, Kamimura MA. Risk factors for hypovitaminosis D in nondialyzed chronic kidney disease patients. J Ren Nutr 2011;in press. Cuppari L, Garcia Lopes MG, Kamimura MA. Vitamin D biology: from the discovery to its significance in chronic kidney disease. J Ren Nutr 2011;21: Cuppari L, Garcia-Lopes MG. Hypovitaminosis D in chronic kidney disease patients: prevalence and treatment. J Ren Nutr 2009;19: