MOLECULAR. Daniel Macedo de Melo Jorge. Acontecimentos na genética e genômica. e genômica. Escala Comparativa

Transcrição

1 SUMÁRIO ENÉI MOLEULR Daniel Macedo de Melo Jorge História da enética Molecular; Organização e estrutura dos genomas; DN e RN Dogma entral Replicação ranscrição radução enes e genomas; écnicas enética Molecular PR Sequenciamento ES O QUE É ENÉI? É o estudo dos genes e de sua transmissão para as gerações futuras. É dividida em: - enética lássica Mendel ( ) unidade fundamental da hereditariedade - enética Moderna Watson e rick (1953) pedaço de DN que codifica uma proteína O QUE É ENÉI? Escala omparativa erra País Estado élula romossomo Fragmento cromossômico Município Pessoas ene Bases de pares contecimentos na genética e genômica contecimentos na genética e genômica

2 contecimentos na genética e genômica Ácido desoxirribonucléico ico - DN estrutura do DN dupla hélice h de DN DN é o material genético Estrutura regular (difração de Raio-X) Fitas complementares de nucleotídeos Dupla hélice DN associado a proteínas estrutura do DN Nucleotídeo unidade de construção do DN Nucleotídeo: - çúcar: pentose, desoxirribose - Fosfato - Bases nitrogenadas: - Purina: denina guanina - Pirimidina: citosina timina - Pareamento - Ligadas por pontes de hidrogênio Ligações fosfodiester Quantidade de = quantidade de Quantidade de = quantidade de

3 Desoxirribose: o açúa çúcar do DN Bases nitrogenadas Purinas Pirimidinas Principais ipos de RN RN mensageiro (mrn): contém a informação genética para a seqüência de aminoácidos das proteínas Ácido ribonucléico ico - RN RN transportador (trn): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo RN ribossômico (rrn): constituinte dos ribossomos Ribonucleotídeo O bloco de construção do RN RN: um ácido nucléico com estrutura química diferente do DN

4 DN x RN Dogma entral da Biologia Molecular DN Desoxirribose RN Ribose ; ; ; ; ; ; U Dupla fita rmazena informações Molécula grande Fita simples; dobrada ransporta informações; funções estrutural e catalítica Molécula pequena Replicação ranscrição Reversa Replicação de RN Proteína ranscrição radução Replicação Regras básicas b do processo de replicação do DN É o processo na qual o DN é duplicado, a partir da fita molde. Processo semiconservativo Início da replicação -Origem Movimento da forquilha de replicação - Unidirecional ou bidirecional Direção da replicação - Semidescontinuidade da replicação Enzimas que participam da replicação Replicação DN Polimerase SSB (Single Strand Binding Protein) Primase Helicases (DnaB) opoisomerases DN ligase

5 ranscrição aracterísticas da transcrição É o processo pelo qual uma molécula de RN é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DN de fita dupla RN é imediatamente liberado do DN Produção simultânea de muitas cópias a partir do mesmo gene - ene com 1.500pb ranscrição = 50 segundos 15 RN-polimerase/gene 1 hora = milhares de transcritos ranscrição ranscrição DN fita codificadora DN fita molde RN transcrito Processamento do mrn Íntrons e Éxons introns exons Processamento do transcrito primário Excisão dos exons União dos exons Íntron região não-codificante de um gene, transcrita na mólecula de RN, mas removida pelo processamento do RN - 80 a nucleotídeos Éxon Seguimento de um gene formado por uma seqüência de nucleotídeos que serão representados no RN Processamento: processo de remoção de íntrons e junção de éxons no RN mensageiro de eucariotos

6 radução radução Processo na qual uma seqüência de mrn é convertido em uma proteína. ódigo enético ódigo enético aracterísticas do código genético onceito: São as instruções para sintetizar moléculas protéicas e estão inscritas em código nas moléculas de DN dos organismos vivos. ríplice: 3 bases = códon codificam um aa Degenerado ou redundante: um mesmo aminoácido pode ser codificado por vários códons diferentes Não é ambíguo: cada códon é corresponde a somente um aminoácido om sentido: Start códon a um stop códon; Universal: o mesmo para todos seres vivos Utilização preferencial de codons: codon usage ódigo enético ódigo enético rincas do ódigo enético ada trinca de nucleotídeo do DN corresponde a um aa na proteína. combinação das 4 letras genéticas, 3 a 3, permite obter 64 trincas diferentes. 61 correspondem a aminoácidos e 3 correspondem a códons de terminação; U, U e U.

7 radução Resumo da tradução DN fita codificadora DN fita molde RN transcrito rg-yr-ser-val Proteína traduzida Os enomas Os enomas Vírus DN ou ou RN Fita simples Organismos Procarióticos: Bactérias élulas DN e RN Fita Dupla romossomo Plasmídeo Procarióticas Eucarióticas romossomo Plasmídios romossomo Mitocôndrias loroplastos Os enomas Os Plasmídios romossomo + Plasmídeos O genoma da E. coli kb genes - 80% da molécula de DN genes codificantes de proteínas Elemento genético, extra-cromossômico, capaz de replicar independente do cromossomo - Dupla fita de DN; ircular (+) Kb; < 1/20 do cromossomo Diferentes dos vírus - Não causam danos às células - Não são formas extracelulares Diferentes do cromossomo - Não contém genes essenciais

8 O enoma Humano O enoma dos Organismos Eucarióticos 23 cromossomos genes milhões de bases O enoma Humano O enoma dos Eucarióticos Família enoma nuclear élula O genoma nuclear: - E. coli: genes; codificam proteínas - Saccharomyces cerevisiae: genes; codificam proteínas Exemplos utilização - Humanos: genes, codificam proteínas; genes > (+ íntrons) enoma mitocondrial enoma humano: O enoma dos Eucarióticos - Éxons 70% -Íntrons - DN repetitivo (não essencial?) - 30% - Não codifica - Não transcreve - Repetidas muitas vezes ompactação do DN em romossomos enoma humano - 23 cromossomos - 1 metro - ½ DN + ½ Proteínas Proteínas - RN polimerase, DN polimerase, reguladoras, Histonas romatina - DN-Proteína ompactação do DN

9 écnicas de enética Molecular Reação em adeia da Polimerase - PR PR Sequenciamento ES 1983: Kary Mullis 1985: 1º artigo Processo patenteado em 1989 por etus orporation & Hoffman-LaRoche 1993: Nobel da Química PR PR rande quantidade de DN em pouco tempo. Baixo custo amostra de DN não necessita de estar altamente purificada PR pode amplificar uma única molécula de DN / RN O produto do PR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado. É difícil exagerar o impacto da PR na Biologia Molecular Simplificou e democratizou as técnicas de Biologia Molecular Possibilitou extender a Biologia Molecular para disciplinas nunca pensadas como Ecologia, Direito, rqueologia, Economia, etc. O que é necessário? ermocicladores dnps dp dp dp dp Mg 2+ DN polimerase Iniciadores Em solução tampão de PR, H2O ultra-filtrada (ph 7,0) e óleo mineral.

10 Mecanismo Desnaturação Divide-se em 3 passos principais, que se repetem por 25 a 35 ciclos: - Desnaturação - Hibridação - Extensão Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DN por meio da elevação da temperatura. quantidade de DN final segue uma função exponencial, onde: N=N 0.2n N: número final de cadeias de DN N 0 : número inicial de DN molde (template) n: número de repetições do ciclo s amostras são aquecidas a º durante um a vários minutos. Hibridação Extensão temperatura é reduzida a º durante alguns minutos. Eleva-se a temperatura a 72º durante 2 minutos. Os iniciadores hibridam com as seqüências complementares do Molde. O DN polimerase atua junto dos iniciadores que hibridaram, começando a duplicação da cadeia e recrutando no meio os nucleótidos complementares disponíveis. Sequenciamento Sequenciamento Reação de Sequenciamento Método didesoxi conhecido também como de terminadores de cadeia ou de Sanger Molde aq polimerase Primer Deoxinucleotídeos Dideoxinucleotídeos

11 Polimerização de DN Polimerização de DN Polimerização de DN Polimerização de DN Polimerização de DN Polimerização de DN

12 Polimerização de DN Polimerização de DN Seqüenciamento enciamento de DN el de sequenciamento de DN Sequenciadores Seqüenciamento parcial de transcritos

13 O que são ESs? ES= Expressed Sequence ag (Etiquetas de Seqüências Expressas) cdn Seqüenciamento enciamento parcial de transcritos REIÃO ODIFIDOR SOP intron sexon s Processamento do transcrito primário Excisão dos exons União dos exons ES 5 ES 5 ES 5 ES 3 ES 3 ES 3 luster de ESs ou de reads Seqüência consenso Seqüenciamento enciamento parcial de transcritos ES 5 ES 3 ES 5 ES 5 ES 5 gradecimentos o Prof. Dr. Sergio Lifschitz. o comitê organizador do BSB e ao comitê do IWD. todos os presentes.