Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas SIMONI PARO SILVA

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1 Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas SIMONI PARO SILVA TERAPIA FOTODINÂNICA ASSOCIADA AO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO. ESTUDO CLÍNICO E MICROBIOLÓGICO EM HUMANOS BARRETOS 2009

2 Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas SIMONI PARO SILVA TERAPIA FOTODINÂMICA ASSOCIADA AO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO. ESTUDO CLÍNICO E MICROBIOLÓGICO EM HUMANOS Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos, para obtenção do título de Mestre em Periodontia. Orientadora: Profa. Dra. Letícia Helena Theodoro Co-Orientadora: Profa. Dra. Juliana Rico Pires BARRETOS 2009

3 Silva, Simoni Paro Terapia fotodinâmica associada ao tratamento periodontal não cirúrgico. Estudo clínico e microbiológico / Simoni Paro Silva. Barretos: [s.n.], f.; 30 cm. Dissertação (Mestrado) Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos, Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas Orientador: Profa. Dra. Leticia Helena Theodoro 1. Terapia fotodinâmica 2.Periodontite 3.Tratamento Periodontal Não Cirúrgico I. Terapia Fotodinâmica associada ao tratamento periodontal não cirúrgico. Estudo clínico e microbiológico em humanos.

4 TERAPIA FOTODINÂMICA ASSOCIADA AO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO. ESTUDO CLÍNICO E MICROBIOLÓGICO COMISSÃO JULGADORA DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE Presidente e Orientadora: Profa. Dra. Letícia Helena Theodoro 2º Examinadora: Prof. Dr. Juliano Milanezi Almeida 3º Examinador: Prof. Dr. Benedito Egbert Corrêa de Toledo Barretos, 09 de dezembro de Dissertação de Mestrado

5 DADOS CURRICULARES Simoni Paro Silva Nascimento Bebedouro/SP Filiação Valdemar Domingos Paro Vera Maria Almeida Paro 1989/1993 Curso de Graduação Faculdade de Odontologia da Fundação Educacional de Barretos-SP 1995/ 1996 Curso de Especilização em Periodontia Associação Paulista de Cirurgiões Dentistas APCD - São Carlos/SP 2008/2009 Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos/SP Dissertação de Mestrado

6 DEDICATÓRIA À Santíssima Trindade Pai, Filho e Espírito Santo, que revelou-se ainda quando eu era muito jovem e que tem sido o amigo íntimo e confidente, meu conselheiro admirável e meu rochedo. O Deus em quem eu confio, espero e sirvo. Aos meus pais Vera Maria e Valdemar Domingos, que me ensinaram com seus próprios exemplos a trabalhar e lutar muito. Ao meu esposo Flávio, que me apoiou incondicionalmente e a quem eu amo cada dia mais. Aos meus filhos João Lucas (7) e Francisco José (2), que me recebem com sorrisos, acalmam minha alma e agitam minha vida. Aos meus irmãos Flávio, Vinícius e Vivian, que enfrentam comigo as batalhas e se alegram com as vitórias. Aos meus familiares e amigos, que ao longo da minha vida, foram presenças constantes e amorosas. Aos meus pacientes, que me impulsionam a estudar sempre Dissertação de Mestrado

7 AGRADECIMENTOS Ao Reitor do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos Prof. Dr. Álvaro Fernandes Gomes e ao Pró-Reitor de Pós-Graduação e Pesquisa Prof. Dr. Romildo Martins Sampaio. Ao Prof. Dr. Benedito Egbert Corrêa de Toledo Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas e a Profa. Dra. Patrícia Helena Rodrigues de Souza Vice- Coordenadora do Curso Pós-Graduação em Ciências Odontológicas pela idealização e dedicação nos trâmites para a concretização do curso de mestrado do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos. Ambos me ensinaram que a dedicação ao trabalho e ao estudo deve sempre andar juntos. À minha orientadora, Profa. Dra. Letícia Helena Theodoro pelo exemplo de dedicação ao conhecimento científico e ao ensino do mesmo. Ela me aceitou sem me conhecer e não desistiu de mim depois de conviver comigo. Fica o meu respeito, admiração e o sentimento de profunda gratidão. À minha co-orientadora, Dra. Juliana Rico Pires pelos ensinamentos, apoio, compreensão e orientação constante. A todos os professores do curso de mestrado Prof. Dr. Alex Tadeu Martins, Profa. Dra. Ana Emília Pontes Farias, Prof. Dr. Celso Eduardo Sakakura, Profa. Dra. Elizangela Partata Zuza, Prof. Dr. Fernando Salimon Ribeiro, Profa. Dra. Juliana Rico Pires, Profa. Dra. Letícia Helena Theodoro, Profa. Dra. Lisete Diniz Ribas Casagrande, Prof. Dr. Osvaldo Eduardo Aielo, Profa. Dra. Patrícia Amoroso de Andrade, Profa. Dra. Patricia Helena Rodrigues de Souza, Prof. Dr. Raphael Carlos Comelli Lia, Prof. Dr. Rogério Margonar que colaboraram para o meu crescimento em momentos distintos e importantes. A vocês minha mais profunda gratidão. Para sempre. Ao Prof. Dr. Valdir Gouveia Garcia pelo empréstimo valioso do aparelho de laser sem o qual esta pesquisa não seria possível. Dissertação de Mestrado

8 À Profa. Dra. Ana Emília Pontes Farias pela atenção dedicada á análise estatística desse trabalho. A todos os professores do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos particularmente aos de periodontia e ao Prof. Dr. Hélio Tanimoto, importantíssimos na minha formação desde o ínicio. À Profa. Dra. Denise Madalena Palomari Spolidório pelo acesso ao laboratório de microbiologia da Faculdade de Odontologia de Araraquara. À Glaucia (colaboradora deste estudo), Ana Luiza, Eliane, Priscila, Thais e Paulo, bem como todos os outros colegas do curso de pós- graduação que trabalharam, estudaram e pesquisaram comigo. Obrigada pelos momentos compartilhados, amizade e ajuda no decorrer do curso. A vocês o meu carinho. Às secretárias Natalia colaboradora deste estudo, Soninha do mestrado e as secretárias da clínica do Curso de Odotologia de Barretos que me apoiaram mesmo em horas inapropriadas. Meu muitíssimo obrigado. À Dona Augusta (vó Guta), Lele, Rosangela e Cintia fiéis companheiras que pilotaram minha casa quando eu sumia. Sou-lhes eternamente grata. Dissertação de Mestrado

9 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS... 9 RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA PROPOSIÇÃO METODOLOGIA RESULTADO DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXO Anexo 1 Referências da Revisão da literatura Anexo 2 Aprovação do Comitê de Ética para realização do estudo Anexo 3 Termo de consentimento... 73

10 LISTA DE ABREVIATURAS µg - Microgramas, equivalente a um milhão de vezes menor que o grama. µg/ml Microgramas por mililitro. ATP Adenosina Trifosfato. Densidade energética quantidade de energia aplicada em uma área. É expressa em Joules por centímetro quadrado (J/cm 2 ). DNA Ácido dexoxiribonucléico. Hertz (Freqüência) Número de oscilações completas de uma onda por segundo e expresso em Hertz ou pulsos por segundo. IPV Índice de placa visível. ISG Índice de sangramento gengival. Joule Uma unidade de energia, abreviada como J. Laser Acrônimo de Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (Luz Amplificada pela Emissão Estimulada de Radiação). Laser GaAlAs Laser de -Gálio-Alumínio-Arsênio. Laser CO 2 Laser de Dióxido de Carbono. Laser Er: YAG Laser de Erbium: Ytrium- Aluminum- Garnet. Laser He-Ne Laser de Hélio- Neônio. Laser Nd:YAG Laser de Neodimium: YAG. LLLT Laser de baixa intensidade. Expressa Low Level Laser Therapy. MB Azul de Metileno. mg Miligramas, equivalente à milésima parte do grama. ml Mililitros, equivalente à milésima parte do litro. mw Milionésima parte do Watt. NIC Nível de Inserção Clínica. nm Nanômetro. µm Micrometro. Tempo de exposição Período total que o tecido é exposto à energia Laser. TBO Azul de Toluidina O. PDT Terapia Fotodinânica. PS Profundidade à sondagem. RAR Raspagem e alizamento radicular. RG Recessão gengival. SS Sangramento à sondagem. W = Watt Unidade de potência. Um Watt é igual a um Joule por segundo. Dissertação de Mestrado 9

11 RESUMO Silva SP. Terapia fotodinâmica associada ao tratamento periodontal não cirúrgico. Estudo clínico e microbiológico em humanos. [Dissertação de Mestrado]. Barretos: Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas da UNIFEB; A terapia fotodinâmica (PDT) consiste da utilização de uma fonte de luz que pode ser um laser de baixa potência, em combinação com substâncias fotossensibilizadoras. A PDT tem recentemente sido utilizada para tratamento periodontal in vivo. O objetivo deste estudo foi avaliar clinicamente e microbiológicamente a ação adjunta da PDT no tratamento periodontal não cirúrgico. Trinta e três pacientes com periodontite crônica participaram do estudo. Todos os dentes foram tratados com raspagem e alisamento radicular. Usando um modelo de boca dividida, três sítios de cada paciente foram randomicamente selecionados e alocados para os seguintes grupos de tratamento: grupo RAR (somente raspagem e alisamento radicular); TBO (RAR e irrigação com azul de toluidina O) e PDT - TBO e irradiação com laser de baixa intensidade (GaAlAs, 660 nm; 4.5 J; 150 s; 30 mw). Os seguintes parâmetros foram avaliados: índice de placa visível (IPV), índice gengival (IG), sangramento à sondagem (SS), profundidade à sondagem (PS), nível de inserção clínica (NIC) e recessão gengival (RG) no início, 60, 90 e 180 dias após os tratamentos. Nestes mesmos tempos experimentais, a análise microbiológica foi realizada em amostras do fluido crevicular dos sítios selecionados por meio da tecnica da reação de polimerase em cadeia (PCR) e as seguintes bactérias foram estudadas: Porphyromonas gingivalis (P.g.), Tannerella forsythensis (T.f.), Aggregactibacter actinomycetemcomitans A.a, Prevotella nigrescens (P.g.) e Prevotella intemedia (P.i.). Aos 60, 90 e 180 dias houve melhoras em todos os parâmetros clínicos analisados (p<0,001) mas não foi observada diferença estatísticamente significante entre os grupos nos parâmetros de IPV, IG, SS, PS, NIC e RG. (p>0,05) Analisando a porcentagem de variação dos periodontopatógenos Dissertação de Mestrado 10

12 estudados (delta) obtida com os diferentes tipos de tratamento, pode-se observar que aos 90 dias a terapia PDT reduziu de forma significante, a prevalência de A.a, P.i e T.f se comparado ao grupo RAR e ainda reduziu de forma significante A.a, P.n e T.f se comparado ao TBO. Aos 180 dias houve significantemente maior redução de todas as bactérias com o tratamento PDT se comparado ao tratamento RAR e maior redução de Aa e Pg no grupo PDT quando comparado ao TBO. Concluiu-se que um episódio da Terapia Fotodinâmica associada ao procedimento de raspagem e aplainamento radicular reduziu a microbiota até 180 dias de acompanhamento, podendo ser uma alternativa para o tratamento da periodontite crônica, porém sem benefícios clínicos adicionais. Palavras-chave: terapia fotodinâmica, periodontite, tratamento periodontal. Dissertação de Mestrado 11

13 ABSTRACT Silva SP. Photodynamic therapy associated to non-surgery periodontal treatment. Photodynamic therapy is the association of a photosensitizer with a light radiation or a laser. The Photodynamic Therapy (PDT) has recently been used for periodontal therapy in vivo. The aim of this study was to evaluate the clinical and microbiological effects of the adjunctive use of a single episode of PDT to nonsurgical periodontal treatment. Thirty-three patients with untreated chronic periodontitis were included. All teeth received periodontal treatment comprising scaling and root planing. Three pockets from 5 to 9 mm in non-adjacent sides, were studied. In a split-mouth design, each site was randomly allocated to a treatment group: 1) SRP scaling and root planing with manual instruments; 2) TBO SRP + Toluidne Blue 100 µg/ml irrigation; 3) PDT SRP+ Toluidine Blue 100 µg/ml irrigation + low level laser irradiation (GaAlAs, 660 nm; 4.5 J; 150 s; 30 mw). Plaque index (PI), gingival index (GI), bleeding on probing (BOP), probing depth (PD), gingival recession (GR), and clinical attachment level (CAL) were evaluated at baseline, 60, 90 and 180 days after treatment and subgingival plaque samples (evaluated by polymerase chain reaction) of Porphyromonas gingivalis (P.g.), Tannerella forsythensis (T.f.), Aggregactibacter actinomycetemcomitans A.a, Prevotella nigrescens (P.g.) e Prevotella intemedia (P.i.) were measured also. Statistical analysis was conducted (p<0.05). At 60, 90 and 180 days after treatment, clinical values decreased in all treated groups (p<0.001) but there were no significant differences among the groups with regard to IP, GI, BOP, PS, NIC and GR (p>0.05). PDT showed significant reduction of prevalence of A.a, P.i and T.f at 90 days when compared to SRP treatment and SRP reduced the prevalence of A.a, P.n and T.f when compared to TBO. At 180 days PDT reduced significantly the prevalence of all bacteria when compared to SRP and reduced more A.a and P.g, when compared to TBO. It was concluded that a single PDT episode associated to scaling and root planning reduced prevalence of bacteria until 180 days post-operatively, therefore it can be an Dissertação de Mestrado 12

14 alternative for chronic periodontitis treatment, however with no additional clinical benefites. Keywords: photodynamic therapy, periodontitis, periodontal treatment. Dissertação de Mestrado 13

15 1. INTRODUÇÃO O fator etiológico primário da doença periodontal destrutiva é o acúmulo de microrganismos em um hospedeiro susceptível (Page et al., 1999). A doença é caracterizada pela inflamação nos tecidos de suporte do dente levando a migração apical do epitélio juncional ao longo da superfície radicular e a destruição progressiva do ligamento periodontal e osso alveolar. Espécies como Aggregactibacter actinomycetemcomitans (A.a), Porphyromonas gingivalis (P.g), Prevotella intermedia (P.i), Tannerella forsythia (T.f), Campylobacter rectus (C.r), Peptostreptococcus micros (P.m), Eikenella corrodens (E.c), Fusobacterium nucleatum (F.n), Eubacterium sp, Streptococcus intermedius (S.i) e Treponema sp tem sido associadas à doença periodontal. Outras espécies bacterianas, leveduras e vírus ainda não têm seu papel etiológico e sua relevância clínica definida (Socransky et al., 2006). O tratamento periodontal inclui necessariamente a eliminação ou a diminuição desses microrganismos bem como a remoção de depósitos calcificados da superfície da raiz através da raspagem e aplainamento radicular combinado com medidas de higiene oral. Clinicamente, há evidências de que a raspagem e o aplainamento radicular propiciam os melhores resultados no tratamento da doença periodontal. Entretanto a efetividade desta terapia pode ser influenciada negativamente quando reservatórios bacterianos permanecem na superfície radicular após o tratamento e podem afetar o processo de reparação. Além disso, uma parcela da população pode ser acometida por formas agressivas de doença periodontal de difícil controle e isto pode ser explicado por uma série de fatores relacionados ao paciente (local ou sistemicamente), que afetam diretamente os resultados do tratamento (Badersten et al., 1981, Badersten et al., 1984, Badersten et al., 1984, Badersten et al., 1987). Procedimentos não cirúrgicos coadjuvantes como antibioticoterapia e uso de dispositivos subgengivais de liberação lenta de antibióticos têm sido avaliados, porém o ganho adicional, tanto no nível de inserção clínica, quanto na Dissertação de Mestrado 14

16 redução da profundidade de sondagem é pequeno quando comparado a terapia de raspagem e alisamento radicular isoladamente. Além disso, há dificuldade de se manter uma concentração terapêutica adequada destes medicamentos no interior da bolsa periodontal bem como a possibilidade do desenvolvimento de resistência bacteriana frente a estes procedimentos. A administração sistêmica de antibióticos pode causar efeitos adversos como: perturbações gastrointestinais, alergias (penicilinas), captação em ossos e dentes (tetraciclina), dores de cabeça, vertigem, gosto metálico ou intolerância alcoólica (metronidazol) (Meisel & Kocher 2005). Diante destes fatos há a necessidade de se estudar alternativas antibacterianas apropriadas tanto no tratamento, quanto na prevenção da doença periodontal. Recentemente como terapia coadjuvante pode ser citada a Terapia Fotodinâmica (PDT), procedimento que leva a morte de microrganismos usando uma fonte de luz que pode ser um laser (light amplification by stimulated emission of radiation) para ativar um agente fotossensibilizador na presença de oxigênio (Konopa et al., 2007). Tem se estabelecido que o mecanismo pelo qual a PDT promove a morte de bactérias periodontopatogênicas por fotossensibilização letal deva envolver alteração na membrana citoplasmática e danos no DNA mediado pela liberação de um oxigênio singlet ou da liberação de radicais livres. Estas reações poderiam causar um efeito citotóxico nos microrganismos (Bhathi et al., 1998). Recentemente tem-se observado muitos estudos tanto in vitro (Wilson et al., 1995; Chan & Lai 2003; Matevski et al., 2003; Bhathi et al., 1997; Soukos et al., 1996 e Prates et al., 2007) como in vivo em animais (Komerick et al., 2003; Sigusch et al., 2005; Almeida et al., 2007; Almeida et al., 2008; Almeida et al., 2008; Qin et al., 2008; Luan et al., 2009; Fernandes et al., 2009) que analisaram a ação da PDT em periodontia.. Porém poucos estudos clínicos controlados em humanos foram realizados com o objetivo de avaliar a Terapia Fotodinâmica como tratamento coadjuvante ao tratamento periodontal convencional (Andersen et al., 2007; Chondros et al., 2008; Christodoulides et al., 2008; Braun et al., 2008; Al Zarani et al., 2009). Dissertação de Mestrado 15

17 2. REVISÃO DE LITERATURA Os primeiros estudos sobre a ativação de um fossensibilizador por uma luz, data do inicio do século 20 e ganhou reconhecimento como modalidade efetiva de tratamento tanto em oncologia como em certas doenças inflamatórias viróticas e bacterianas na dermatologia (Verma et al., 2007). Para a produção dos efeitos citotóxicos, a PDT necessita que três componentes básicos estejam presentes simultaneamente: luz laser, oxigênio e um fotossensibilizador (Konopa et al.,2007). A excitação do fotossensibilizador se dá pela absorção de luz (que pode ser um laser) em um comprimento de onda apropriado e na presença de oxigênio converte o fotossensibilizador em um estado ativado, formando um oxigênio citotóxico ( singlet ) que leva a morte celular (Konopa et al., 2007). Os lasers de baixa intensidade atuam com ondas médias dentro do comprimento de onda do laser de Helio - Neônio (632,8 nm) ou dos lasers de diodo semicondutor (670 a 960 nm). Estes lasers são de baixo custo, portáteis e não são capazes de promover redução bacteriana quando utilizados isoladamente, por não apresentarem efeitos térmicos e sim efeitos fotoquímicos. As vantagens na utilização deste laser isoladamente em odontologia é a de promover biomodulação no tecido a ser reparado, aumentando a respiração mitocondrial e a síntese de ATP (Yu et al.,1997), favorecendo o processo de reparo e induzindo a proliferação celular, produção de ácido nucléico, aumento da divisão celular e síntese de colágeno (Mester et al., 1985). Os agentes fotossensibilizadores são moléculas que possuem a propriedade de absorver energia luminosa e utilizar esta energia para promover reações químicas nas células e tecidos submetidos à Terapia Fotodinâmica. Estas moléculas são encontradas naturalmente em muitos microrganismos (P.g., P.i.,), porém muitas espécies bacterianas não apresentam estes componentes e nestes casos, elas podem se tornar sensíveis a luz se forem coradas com agentes exógenos, os fotossensibilizadores. Vários fotossensibilizadores têm sido testados clinicamente como o azul de toluidina O, o cristal de violeta, fitalocianina Dissertação de Mestrado 16

18 dissulfonada de alumínio, hematoporfirinas, tionina, protoporfirina e azul de metileno (Almeida et al., 2008). As atividades de virulência de bactérias gram negativas são também reduzidas pela PDT. Entre os agentes fotossensibilizadores o Azul de Toluidina e o Azul de Metileno têm apresentado efeitos fototóxicos a bacilos gram negativos na presença de irradiação com luz vermelha (Bhathi et al., 1997; Komerick et al., 2003; Usacheva et al.,2001). A aplicação clínica desta terapia em periodontia consiste na irrigação subgengival da droga fotossensibilizadora que absorve o comprimento de onda da energia emitida, no caso do laser em baixa intensidade, seguida da irradiação da bolsa periodontal, com parâmetros efetivos para promover a redução bacteriana. ESTUDOS IN VITRO Estudos in vitro têm reportado a morte de um grande número de microrganismos com o uso da PDT incluindo espécies da cavidade oral. Um dos primeiros estudos que avaliaram redução de bactérias da cavidade oral após tratamento com PDT foi realizado por Wilson et al. (1995). Neste foi utilizado o laser de diodo de Gálio Alumínio Arsênio (GaAlAs) e o de Helio - Neônio (HeNe) com fontes de luz. O laser diodo (660 nm) utilizado apresentava potência de 11 mw, a luz era emitida por um feixe de 9 mm de diâmetro, no modo pulsado, freqüência de 20 KHz e o agente fotossensibilizador empregado foi fitalocianina dissulfonada de alumínio (AIPcS 2 ). O laser de HeNe (632,8 nm; 73 mw) foi emitido por um feixe de 13 mm associado com o uso do azul de toluidina O (TBO). Para análise microbiológica foram coletadas amostras de placa supragengival de dez voluntários. Após a irradiação com os dois lasers houve redução substancial na quantidade total de bactérias, assim como no número de streptococos e actinomyces. Na ausência de luz os fotossensibilizadores por si só tiveram um pequeno efeito na viabilidade das bactérias em amostras de placa. A combinação de HeNe/TBO mostrou-se mais eficaz que a associação Dissertação de Mestrado 17

19 GaAlAs/AIPcS 2. Os autores concluíram que se esta fotossensibilização se confirmasse in vivo, a PDT poderia ser um tratamento útil em lesões de cárie previamente à realização das restaurações. Com relação a bactérias periodontopatogênicas, Bhathi et al. (1998) analisaram a associação do laser HeNe (632,8 nm) e o azul de toluidina O em diversas concentrações (12,5 a 50 mg/ml) na fotossensibilização de Porphyromonas gingivalis e verificaram que o aumento da concentração do TBO diminuía a morte celular das bactérias e que o ph da droga influenciava os resultados, sendo o ph 7,3 o mais efetivo. Chan e Lai (2003) avaliaram a viabilidade de cinco espécies bacterianas (P.g; F.n; P.i; A.a e S.s) na presença da PDT. Os lasers utilizados foram o HeNe (632,8 nm) e o laser de diodo de GaAlAs (665 nm e 830 nm) tendo como fotossensibilizador o azul de metileno na concentração de 0,01%. Os resultados mostraram que o azul de metileno usado isoladamente não reduziu significativamente a quantidade de bactérias, quando comparado ao uso concomitante ao laser de HeNe. O uso do laser diodo nos dois comprimentos de onda, por sua vez reduziu significantemente o número de bactérias. A terapia foi tempo-dependente sendo a exposição de 60 segundos a que promoveu morte de 99 a 100% das bactérias pigmentadas P.g; e S.s. Quanto às espécies A.a e F.n a redução foi de 95 a 96%. Estes autores consideraram a terapia fotodinâmica viável in vitro, quando parâmetros de uso adequados são utilizados e consideraram que existem variáveis que podem influenciar a ação da PDT in vivo, como a presença de fluido gengival, sangue, estrutura do biofilme, espessura do tecido gengival, além da presença ou não de melanina nos tecidos periodontais. Com o objetivo de determinar parâmetros para o uso da PDT, Matevski et al. (2003) utilizaram o laser de HeNe e luz alógena para ativar o fotossensibilizador azul de toluidina O (TBO) em uma concentração de 1 mg/ml. As bactérias estudadas foram P.g, P.i, A.a, F.n, T.f. Os autores mostraram que houve redução na viabilidade celular bacteriana com ambos os tipos de irradiação, porém a luz alógena mostrou-se menos eficiente. Salientaram ainda, que há uma correlação linear entre a dose de irradiação e a morte celular; e Dissertação de Mestrado 18

20 que o aumento da dose pode diminuir a sobrevivência da bactéria. Neste trabalho a PDT mostrou ação bactericida mesmo na presença de sangue, quando os parâmetros de irradiação usados foram 10 J/cm 2 e 100 mw/cm 2 associado a 12,5 mg/ml de TBO, indicando assim possível eficácia desta terapia in vivo. Antes de se desenvolver os ensaios clínicos para se avaliar a efetividade da Terapia Fotodinâmica é importante determinar quanto os tecidos periodontais podem ser afetados pela dose da irradiação e a concentração do fotossensibilizador. Com o objetivo de investigar a ação da PDT sobre as células do epitélio oral e fibroblastos, Soukos et al. (1996) em um estudo in vitro, utilizaram o azul de toluidina na concentração de 2 e 5 mg/ml por cinco minutos e exposição ao laser HeNe com 7,3 mw por 2 minutos (0,876 J/cm 2 ). Os resultados demonstraram que não houve redução na viabilidade das células estudadas (queratinócitos e fibroblastos). Ao analisar a viabilidade do Streptococcus sanguis(s.s) os resultados demonstraram morte destas bactérias quando exposta a irradiação em parâmetros muito menores (75 segundos; 0,547 J) na presença de TBO em uma concentração de 2,5 mg/ml. Os resultados deste estudo foram encorajadores, pois apesar das altas doses de TBO e laser utilizados, se comparadas as necessárias para eliminar as bactérias, não foi observado danos tanto nos queratinócitos, quanto nos fibroblastos sugerindo desta forma, que esta modalidade de tratamento é segura no que diz respeito a resposta tecidual. Considerando a forte evidência de que a A.a está intimamente relacionada com a periodontite agressiva localizada, Prates et al. (2007) investigaram a capacidade da PDT em fotossensibilizar esse microrganismo e o grau de degradação do fotossensibilizador. O laser foi o diodo de GaAlAs (660 nm) associado ao verde de malaquita na concentração de 0,01%. Este fotossensibilizador mostrou forte absorção pela membrana celular, tanto de espécies bacterianas gram positivas como gram negativas. Os resultados mostraram uma redução de 99,9% de UFC do Aa quando a dose de energia foi de 9 J/cm² e de 97,2% de redução quando a dose de energia foi 5,4 J/cm². Os autores enfatizaram que a relação entre o comprimento de onda e o espectro de absorção Dissertação de Mestrado 19

21 do fotossensibilizador é essencial para que os efeitos fotofísicos e fotoquímicos da Terapia Fotodinâmica sejam alcançados. ESTUDOS IN VIVO Apesar da importância dos estudos in vitro, é sabido que o crescimento bacteriano em um biofilme subgengival é diferente daquele em uma cultura pura de uma única espécie, em tubo de ensaio ou em placa de Agar, além disso, as bactérias residentes em um biofilme são mais resistentes aos antibióticos do que aquelas cultivadas como cultura pura (Komerick et al., 2003). Komerick et al. (2003) realizaram um estudo em ratos com o objetivo de determinar se a PDT seria útil na eliminação de bactérias na cavidade oral e se resultaria em menor perda óssea alveolar na periodontite. Os molares superiores de ratos foram inoculados com P. g e receberam azul do toluidina O nas concentrações de 0,01 e 0,1 mg/ml em combinação com doses de irradiação de 6, 12, 24 e 48 J (cujos tempos correspondentes eram 1, 2, 4 e 8 minutos). O efeito do azul de toluidina e do laser foi avaliado isoladamente. Quando o azul de toluidina O foi irradiado com o laser de diodo (630 nm) houve uma significante redução no número de Pg viáveis, além disso, quando a concentração deste fotossensibilizador era de 1 mg/ml nenhuma bactéria viável foi encontrada. A perda óssea em animais tratados com PDT foi estatisticamente menor que no grupo controle (grupo que não recebeu nenhum tratamento). Na análise histológica nenhum dano foi observado nas estruturas periodontais de molares submetidos a PDT, além disso, este estudo confirmou que a morte de periodontopatógenos pela PDT é influenciada por fatores ambientais como presença de saliva, fluido crevicular, sangue e ph do meio. Sigusch et al. (2005) em um trabalho com 14 cães beagle testaram a PDT utilizando um laser diodo (662 nm) com potência de 2,5 W, fibra ótica de com diâmetro de saída do feixe de 4 mm e densidade de energia de 12,7 J/cm² por sítio (3,3 segundos). Os fotossensibilizadores usados foram o cloro e6 e BLC 1010 na concentração de 10 µg/ml e os animais foram infectados com P.g e Dissertação de Mestrado 20

22 F.n. A Terapia Fotodinâmica resultou em uma significante redução nos sinais clínicos de inflamação como edema e sangramento a sondagem quando comparado ao grupo controle (grupo sem tratamento ou que recebia somente o laser). Houve significante redução em sítios infectados com Pg quando o cloro e6 foi fotossensibilizado, enquanto o mesmo não foi observado para o BLC O mesmo ocorreu com o F.n sugerindo que o sucesso da PDT depende do fotossensibilizador. Um dado interessante levantado por estes autores é que como os sítios com sangramento à sondagem estão fortemente associados com a presença do Pg, a diminuição da reação inflamatória poderia estar associada na supressão destas espécies. Outro estudo realizado em ratos por Almeida et al. (2007) avaliou histologicamente a ação da Terapia Fotodinâmica sobre a evolução da periodontite induzida experimentalmente, através de ligadura. O laser utilizado foi o de diodo de GaAlAs com 685 nm (50 mw, 120 segundos, 4,5 J/cm²) associado a 100 µg/ml de azul de metileno por um minuto. Os tratamentos testados foram realizados sem a remoção da ligadura e sem a realização prévia de remoção mecânica do biofilme. Na avaliação histológica o grupo PDT apresentou menor extensão do infiltrado inflamatório crônico no tecido gengival. Radiograficamente este grupo também apresentou uma preservação significante de tecido ósseo, concluindo-se que o uso isolado desta terapia reduz a destruição óssea. Os mesmos autores, em 2008, realizaram um estudo histomorfométrico com objetivo de avaliar a influência da Terapia Fotodinâmica na perda óssea em áreas de furca em ratos com doença periodontal induzida. Cento e vinte ratos recebiam ligaduras nos primeiros molares e eram divididos em quatro grupos: grupo controle que não recebia nenhum tratamento; grupo MB recebia somente irrigação tópica com 1 ml de azul de metileno (100 µg/ml); grupo LLLT que recebia somente irradiação com laser de GaAlAs (685 nm), 0,05 W de potência por 120 segundos, intensidade de potência de 0,037 W/cm 2 e 5,94 J e o grupo PDT que recebia irrigação com azul de metileno (100 µg/ml) e irradiação com o mesmo laser nos mesmos parâmetros. Os ratos eram sacrificados aos sete, quinze e trinta dias pós-operatório. O grupo PDT demonstrou menor perda óssea aos sete dias quando comparado aos demais Dissertação de Mestrado 21

23 grupos; aos quinze dias o grupo PDT e o grupo MB demonstraram menor perda óssea que o grupo controle e que o grupo LLLT. Os autores concluíram que a Terapia Fotodinâmica isoladamente pode ser uma alternativa efetiva no controle da perda óssea em áreas de furca na periodontite. Na tentativa de avaliar o efeito da PDT no tratamento da doença periodontal modificada sistemicamente, Almeida et al. (2008), avaliaram histologicamente e histometricamente a ação da PDT como tratamento adjunto na periodontite induzida em ratos normais e diabéticos. Todos os ratos receberam raspagem e alisamento radicular e foram divididos em quatro grupos: Raspagem alisamento radicular mais irrigação com solução salina (RAR); Irrigação com azul de toluidina (100 µg/ml, 1 minuto) (TBO); Irradiação com laser diodo de GaAlAs (660 nm, 24 J) (LLLT) e Terapia Fotodinâmica (PDT). Todos os animais tratados com PDT mostraram menor perda óssea em todos os períodos do experimento, quando comparados aos outros grupos e os autores concluíram que a Terapia Fotodinâmica foi um tratamento adjunto benéfico na doença periodontal induzida em animais normais ou sistemicamente modificados. Qin et al. (2008) realizaram um estudo em ratos para avaliar a efetividade da Terapia Fotodinâmica na destruição de bactérias periodontopatogênicas in vivo e comparar a mesma com o tratamento convencional de raspagem e alisamento radicular além de verificar se a PDT não resultaria em danos aos tecidos do hospedeiro. Dezesseis ratos receberam ligaduras na região subgengival dos primeiros molares para induzir o acúmulo de placa e inflamação periodontal durante seis semanas. A ligadura era então removida, os ratos eram divididos aleatoriamente (8 em cada grupo) e recebiam ou Terapia Fotodinâmica (PDT) ou tratamento convencional de raspagem e alisamento radicular (RAR). O sítio infeccionado de um lado da boca recebia um dos dois tipos de tratamento (PDT ou RAR) enquanto o sítio do lado oposto não recebia nenhum tipo de tratamento servindo como grupo controle. O sitio do grupo PDT recebia 50 µl do fotossensibilizador azul de toluidina O (1mg/ml) por 10 minutos e irradiação com laser de diodo (635 nm; 12 J/cm 2 ; 159 mw/cm 2 ; 75 segundos) com fibra ótica de 0,8 mm de diâmetro. A eficácia terapêutica foi Dissertação de Mestrado 22

24 avaliada pela análise da redução no número total de bactérias do biofilme e pelas alterações histológicas encontradas nos tecidos periodontais. Quando comparado os tratamentos (PDT ou RAR), quanto à supressão de bactérias periodontais, ambas as modalidades de tratamento mostraram pronunciado efeito bactericida; a porcentagem de bactérias que sobreviveram era de 4% a 4,3% respectivamente, comparando com o sítio controle, não havendo diferença significante entre as duas terapias quanto à efetividade terapêutica. Ao exame histológico nenhuma alteração destrutiva grave (hemorragia ou necrose) foi observada tanto no grupo PDT quanto no grupo RAR. Além disso, o epitélio gengival apresentava-se íntegro e nenhum dano no tecido ósseo foi observado em ambos os grupos após os tratamentos. Os autores concluíram que a Terapia Fotodinâmica é efetiva no tratamento da periodontite induzida em ratos. Recentemente em outro estudo histológico realizado em 24 ratos, Luan et al. (2009) analisaram o efeito da associação do TBO (1 mg/ml e 2,5 mg/ml por 5 minutos) com laser de diodo com 635 nm de comprimento de onda (60 J/cm²; 337 s) sobre os tecidos periodontais e dentários. Os grupos controles eram submetidos unicamente a irradiação laser com 140 J/cm² ou unicamente com irrigação com azul de toluidina O na concentração de 2,5 mg/ml ou não recebiam nenhum tratamento. Nenhuma alteração clínica ou histológica de inflamação ou necrose foi encontrada na gengiva, dentina, polpa ou osso alveolar de nenhum rato em nenhum grupo do estudo. Esses resultados são animadores, pois apesar das altas doses de TBO (2.5 mg) e laser (140 J/cm²), quando comparadas às necessárias para eliminar bactérias in vitro, não foi observado efeitos adversos nos tecidos adjacentes sugerindo que esta modalidade de tratamento é segura. Uma vez que corticóides são comumente usados para tratar pacientes com diferentes doenças sistêmicas, estes podem ser considerados fatores de risco para a doença periodontal quando seu uso é prolongado. Diante destes fatos em 2009, Fernandes et al. (2009), compararam a Terapia Fotodinâmica como tratamento adjunto a raspagem e alisamento radicular em ratos com periodontite induzida e que recebiam dexametazona (imunossuprimidos). Os animais eram divididos em dois grupos: ratos que não recebiam dexametazona Dissertação de Mestrado 23

25 (ND) e ratos que recebiam dexametazona (D). Em ambos os grupos a doença periodontal foi induzida com ligaduras nos primeiros molares inferiores e depois de 7 dias a mesma foi removida e todos os animais receberam raspagem e alisamento radicular e foram novamente divididos de acordo com os seguintes tratamentos: irrigação com solução salina (SRP); irrigação com azul de toluidina O (TBO); Terapia Fotodinâmica (PDT - irrigação com azul de toluidina O e irradiação com laser). O laser utilizado foi o GaAlAs (660 nm) com diâmetro da ponteira de 0,07cm 2, utilizado de modo pontual na vestibular e lingual dos primeiros molares inferiores em contato com o tecido. Os parâmetros de irradiação foram potência de 0,03 W por 133 segundos, intensidade de potência de 0,428 W/cm 2, energia de 4 J/ponto (57,14 J/cm 2 /pontual) totalizando 24 J de energia na área. Em ambos os grupos (D e ND) exames radiográficos e histométricos mostraram que houve uma perda óssea significantemente menor em animais tratados com PDT quando comparados ao grupo SRP e TBO. Na análise radiográfica intergrupo houve maior perda óssea em animais do grupo ND no tratado com SRP do que no grupo D tratado com PDT aos 7 e 30 dias. Na análise histológica o grupo ND aos 7, 15 e 30 dias que recebia SRP mostrou grande numero de neutrófilos em degeneração, tecido ósseo com delgado trabeculado ósseo e áreas de reabsorção. Aos 7, 15 e 30 dias a maioria dos espécimes do grupo D que receberam SRP apresentou tecido conjuntivo desorganizado com pequeno número de fibroblasto. Houve áreas de reabsorção no tecido ósseo e no cemento, além de trabeculado ósseo fino com infiltrado inflamatório intenso. No grupo PDT aos 7, 15 e 30 dias na maioria das espécimens (D e ND) foi encontrado ligamento periodontal intacto com fibras colágenas organizadas paralelamente e ausência de infiltrado inflamatório. O tecido ósseo mostrou-se organizado com trabeculado espesso e sem sinais de reabsorção. A superfície do cemento não mostrou áreas de reabsorção. Os autores concluíram que a PDT foi efetiva como terapia adjunta ao tratamento mecânico convencional na redução da perda óssea em periodontite induzida experimentalmente tanto em ratos normais como nos sistemicamente inibidos com dexametazona. Dissertação de Mestrado 24

26 ESTUDOS EM HUMANOS Mais recentemente alguns estudos clínicos em humanos têm sido publicados avaliando a efetividade da PDT como coadjuvante ao tratamento periodontal não cirúrgico e há controvérsia quanto aos benefícios clínicos desta terapia. Andersen et al. (2007) com o objetivo de avaliar o uso da PDT isolada ou associada a raspagem e alisamento radicular em pacientes com periodontite crônica, comparam as terapias em um estudo com trinta e três pacientes. Cinco pacientes foram tratados somente com PDT, os vinte e oito restantes foram aleatoriamente tratados somente com raspagem e alisamento radicular (RAR) ou RAR + PDT. O fotossensibilizador utilizado foi o azul de metileno (0,005%) e o laser foi o de diodo (670 nm) com potência máxima de 150 mw e fibra ótica. O tempo de irradiação por sítio era de 60 segundos conferindo uma densidade média de energia de J/cm². Com relação ao sangramento à sondagem houve melhora em todos os grupos mostrando uma vantagem para o grupo que só recebeu PDT, porém os autores salientaram que o número de pacientes era pequeno para que conclusões fossem tiradas. Quanto à profundidade de sondagem os resultados foram semelhantes para o grupo que só recebeu PDT e o grupo que só recebeu RAR. Quando houve associação da RAR com PDT houve uma melhora de aproximadamente 50% se comparada à raspagem alisamento radicular isolada. Quanto ao nível de inserção o grupo que recebeu RAR isolada mostrou um ganho de 0,36 ± 0,35 mm enquanto que o grupo que recebeu RAR mais PDT mostrou ganho de 0,86±0,61mm. A adição da PDT a raspagem promoveu um ganho três vezes maior no nível de inserção, porém tem que se considerar o curto período do experimento (12 semanas). De acordo com estes autores, a Terapia Fotodinâmica é uma abordagem não invasiva efetiva no tratamento da periodontite crônica e pode ser usada em associação a métodos tradicionais como raspagem e alisamento radicular e ainda ser visto como uma alternativa promissora à antibioticoterapia. Dissertação de Mestrado 25

27 Chondros et al. (2008) em um estudo clínico controlado avaliaram a ação da PDT em pacientes em regime regular de manutenção e não obtiveram os mesmos resultados do estudo anterior.vinte e quatro pacientes foram tratados com raspagem e alisamento radicular (grupo controle) e RAR + Terapia Fotodinâmica (Grupo teste). Avaliações microbiológicas do A.a; P.g; P.i; T.f; Treponema denticola (T.d); P.m; F.n; C.r; Eubacterium nodatum (E.n); E.c e Capnocytophaga espécies (C.s) foram realizadas pela técnica de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR). O fotossensibilizador utilizado foi o azul de toluidina O (10 mg/ml) que era então irradiado pelo laser de diodo (670nm) com intensidade de potência de 75 mw/cm² durante 60 segundos por sítio. Aos três e seis meses após o tratamento não houve diferença estatística entre os dois grupos em termos de profundidade de sondagem, nível de inserção clínica e índice de placa, porém a redução nos escores de sangramento a sondagem foi estatisticamente maior no grupo teste (RAR + PDT). Na análise microbiológica, após três e seis meses, houve redução significativa do Fn e En no grupo teste. Os autores concluíram que a aplicação de um episódio único da PDT associada à raspagem falhou em demonstrar ganhos adicionais em termos de redução na profundidade de sondagem e ganho de inserção clínica mas que houve redução significante nos escores de sangramento a sondagem. Os autores ao discutirem os resultados salientam que estes resultados estão de acordo com os resultados de uma meta-análise de estudos pré clínicos e clínicos que indicam que as terapias com laser de baixa potência (baseada também no efeito fotodinâmico) pode influenciar positivamente o processo de reparação tecidual reduzindo o tamanho da ferida e o tempo de cicatrização pela síntese de colágeno. Em outro estudo clínico controlado, Cristodoulides et al. (2008) avaliaram o uso da PDT no tratamento periodontal não cirúrgico. Neste estudo 24 pacientes com periodontite crônica foram aleatoriamente divididos em dois grupos: raspagem e alisamento radicular (grupo controle) e raspagem e alisamento radicular mais um episódio único de Terapia Fotodinâmica (grupo teste). Os microorganismos estudados foram os mesmo do estudo anterior e os períodos de Dissertação de Mestrado 26

28 avaliação foram três e seis meses após o tratamento. O TBO era depositado nas bolsas por um minuto e irradiado com laser de diodo (670 nm) e potência de 75 mw por um minuto. Os autores deste estudo obtiveram resultados semelhantes ao estudo anteriormente citado (aplicação de um episódio único da PDT mais RAR falhou em demonstrar ganhos adicionais em termos de índice de placa, profundidade à sondagem e nível clínico de inserção, porém houve redução nos escores de sangramento à sondagem) chegando às mesmas conclusões. Deve-se considerar que o desenho experimental de ambos os estudos foram semelhantes com a diferença de que no primeiro os pacientes já estavam em regime de manutenção, outra diferença era que a raspagem e alisamento radicular do estudo anterior eram realizados somente com pontas ultrasônicas enquanto neste utilizava-se também instrumentos manuais Braum et al. (2008) realizaram um estudo clínico randomizado avaliando o efeito antimicrobiano da Terapia Fotodinâmica na periodontite crônica. Vinte pacientes foram tratados com raspagem e alisamento radicular e então em um modelo de boca dividida dois quadrantes (escolhidos aleatoriamente) receberam a Terapia Fotodinâmica adjunta (apdt). O laser utilizado foi o diodo (660 nm) com potência de 100 mw e a irradiação era realizada ao redor do dente em seis sítios por dente (10 segundos/sítio). O fotossensibilizador era a phenothiazina clorida, aplicada por 3 minutos no interior da bolsa antes da irradiação. Os parâmetros clínicos avaliados no início do tratamento e três meses após foram: nível de inserção clínica relativo, profundidade de sondagem e recessão gengival bem como índice do fluido gengival e sangramento a sondagem. Os resultados mostraram uma redução significativa no índice de sangramento gengival, fluido crevicular, profundidade à sondagem e nível de inserção clínica relativo em ambos os grupos com grande impacto nos sítios tratados com apdt. Quanto à recessão gengival não houve diferença entre os grupos. Os autores concluíram que em pacientes com periodontite crônica os resultados clínicos obtidos com o tratamento mecânico convencional podem ser melhorados com a associação da Terapia Fotodinâmica. Dissertação de Mestrado 27

29 Recentemente Mohammad et al (2009) desenvolveram um estudo clínico controlado randomizado avaliando o uso adjunto da PDT ao tratamento periodontal de raspagem e alisamento radicular em pacientes diabéticos. Foram selecionados 43 pacientes diabéticos tipo II com doença periodontal crônica generalizada e divididos aleatóriamente em três grupos: (SRP) raspagem e alisamento radicular; (SRP) e doxiciclina e (SRP) e PDT. Índice de placa e de sangramento à sondagem, profundidade de sondagem, nível de inserção clínica, recessão gengival e nível de hemoglobina glicada (HbA1c) foram avaliados no início e três meses após o tratamento periodontal. O fotossensibilizador utilizado foi o azul de metileno a 0,01 % e a irradiação foi com um laser de diodo (670 nm), porem os parâmetros de aplicação do mesmo não foram especificados pelos autores (sendo seguida a instrução do fabricante do laser). Os resultados deste estudo não mostraram diferenças estatisticamentes significantes nos parâmetros clínicos periodontais entre os grupos após 12 semanas. Foi observada redução na média do nível de HbA1c em todos os grupos, porém só foi obsevada diferença significante no grupo SRP associada a doxiciclina. Os autores concluíram que a PDT não resultou em benefícios adicionais ao tratamento periodontal não cirúrgico em pacientes diabéticos. Há um considerável interesse no uso de agentes antimicrobiano tópicos e sistêmicos para o tratamento da periodontite, porém há uma dificuldade de se manter níveis terapêuticos adequados dos agentes tópicos nos sítios periodontais devido ao fluido crevicular, enquanto que os antibióticos administrados sistemicamente podem propiciar uma microbiota resistente. A terapia fotodinâmica não apresenta estas limitações, uma vez que o fotossensibilizador necessita ficar retido poucos minutos ou segundos dependendo das características e dos parâmetros do laser que será utilizado (Komerick et al., 2003). Inicialmente os estudos in vitro demonstraram que a associação de fotossensibilizadores absorvedores de comprimentos de onda específicos é capaz de promover redução significativa de bactérias bucais (Wilson et al., 1995; Chan et al., 2003; Matevski et al., 2003; Bhathi et al., 1997; Soukos et al., 1996 e Prates Dissertação de Mestrado 28

30 et al., 2007). Por outro lado também tem sido demonstrado em estudos in vivo que a fotossensibilização letal de periodontopatógenos em um biofilme é possível (Komerick et al., 2003; Sigusch et al., 2005; Almeida et al., 2007; Almeida et al., 2008; Almeida et al., 2008; Qin et al., 2008; Luan et al., 2009; Fernandes et al., 2009) sem promover danos tóxicos aos tecidos normais (Soukos et al.,1996). Desta forma a Terapia Fotodinâmica pode ser uma alternativa ao uso de antibióticos e anti-sépticos como coadjuvante aos métodos mecânicos de controle de placa supra e subgengival. Comparado com o tratamento convencional a PDT pode levar a fotoinativação de bactérias patogênicas e reduzir a inflamação sem causar danos aos tecidos periodontais do hospedeiro. Além destes fatos, as dificuldades encontradas com o tratamento convencional em sítios periodontais de difícil acesso, como regiões de furca ou invaginações e concavidades de raízes, não interferem na efetividade da PDT, o que tornaria esta modalidade de tratamento não cirúrgico promissor para futuras pesquisas clínicas (Almeida et al. 2008). Os estudos experimentais em animais demonstraram que a PDT é capaz de promover redução da perda óssea e da inflamação dos tecidos periodontalmente acometidos tanto em condições normais (Konopa et al. 2003; Matevski et al. 2003) como alteradas sistemicamente (Almeida et al., 2008; Fernandes et al., 2008) e quando utilizada isoladamente (Almeida et al., 2007; Almeida et al., 2008) ou como coadjuvante ao tratamento não cirúrgico convencional (Almeida et al., 2008; Qin et al., 2008; Luan et al., 2009;Fernandes et al., 2009). O efeito benéfico do uso adjunto da PDT a terapia periodontal não cirúrgica provavelmente deva estar relacionado ao efeito fotodestrutivo em diferentes espécies periodontopatogênicas (atividade antibacteriana local) mediada por uma reação tipo I (iniciada por hidroxilas ou radicais livres) ou por reação tipo II (iniciada por oxigênio singlet), que são liberadas ou que se apresentam nos tecidos periodontais, após o debridamento mecânico da superfície radicular (Meisel et al., 2005). Além disso, no caso de condições sistemicamente modificadas outras possíveis explicações são: o aumento da angiogênese, que Dissertação de Mestrado 29

31 permite maior oxigenação da área: ação biomoduladora do laser de baixa potência que acelera a reparação óssea e efeito antiinflamatório que favorece a quimiotaxia celular e vasodilatação local (Fernandes et al., 2009). As contradições nos resultados dos estudos humanos com os estudos em animais que avaliam o efeito da Terapia Fotodinâmica podem ser explicadas pelas diferentes metodologias empregadas em cada estudo como: parâmetros de irradiação, concentração da droga, período de manutenção da droga no interior do tecido, tempo de resposta biológica, ph do meio (interface dente/tecido), presença de exsudato, fluido gengival, modo e freqüência de aplicação da droga (Wilson et al., 2004). Os estudos clínicos têm demonstrado que a associação da PDT a terapia mecânica convencional pode promover uma melhora nos níveis de inflamação gengival, porém sem benefícios significantes nos outros parâmetros clínicos periodontais (Braum et al., 2008). Andersen et al. (2007) demonstraram clinicamente que a PDT é tão efetiva quanto a RAR quando utilizada isoladamente no tratamento periodontal, porém a associação de ambos procedimentos foi mais efetiva no ganho de inserção clinica. Por outro lado Braum et al. (2008) ponderam que o uso isolado da Terapia Fotodinâmica não pode ser considerado uma terapia mecânica verdadeira por não remover os depósitos calcificados, isto poderia servir como fator retentivo de bactérias viáveis e contribuir para a reinfecção da lesão periodontal favorecendo a progressão da doença periodontal. Chondros et al. (2008) demonstraram que em pacientes de manutenção a PDT falhou em demonstrar vantagens clínicas sobre a terapia de raspagem e alisamento radicular, porém promoveu uma melhora na redução de bactérias e na inflamação dos tecidos periodontais. A utilização da Terapia Fotodinâmica como terapia antimicrobiana coadjuvante ao tratamento periodontal apresenta algumas vantagens como: não apresentar efeitos colaterais, ser especifica a célula alvo e iniciar sua atividade somente quando exposta a luz. Pode ainda ser considerada de amplo espectro de ação, pois pode agir sobre bactérias, fungos, vírus e protozoários com o mínimo Dissertação de Mestrado 30

32 de danos ao tecido do hospedeiro, além de mínima probabilidade de promover mutagenicidade, ser de fácil aplicação e baixo custo. Na análise dos estudos publicados sobre a utilização da PDT no tratamento periodontal, a maioria dos estudos in vitro demonstrou efetividade da PDT sobre a redução de bactérias periodontopatogênicas, enquanto que os estudos em animais demonstraram que o tratamento periodontal com a PDT promove diminuição da perda óssea em áreas submetidas à periodontite experimental. Por outro lado os resultados clínicos recentes não têm demonstrado muitas vantagens no ganho de inserção periodontal, apesar de diminuir a inflamação do tecido periodontal. Os resultados conflitantes entre os estudos experimentais e clínicos parecem ser devido a não padronização dos parâmetros de irradiação, utilização de diferentes fotossensibilizadores com diversas concentrações e diferentes métodos de aplicação da droga. Além destes fatos, observaram-se poucos estudos clínicos controlados comparando o uso adjunto ou isolado da Terapia Fotodinâmica no tratamento da doença periodontal a longo prazo. Portanto, há a necessidade da realização de novos estudos com o objetivo de definir estes parâmetros e frequência de tratamento, bem como avaliar com maior propriedade os efeitos clínicos em pacientes portadores de doença periodontal comprometidos ou não sistemicamente. Dissertação de Mestrado 31

33 3. PROPOSIÇÃO O propósito deste estudo foi avaliar clinica e microbiologicamente a ação da Terapia Fotodinâmica (PDT) associada à terapia de raspagem e aplainamento radicular (RAR) no tratamento da periodontite crônica em humanos. Dissertação de Mestrado 32

34 4. METODOLOGIA O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa (CEP, protocolo 081/2007) do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos (Anexo 4). Cálculo da amostra O cálculo da amostra foi realizado pelo teste t pareado a priori considerando as médias dependentes do nível de inserção clínica, considerando-se um poder de 80% e α (alfa) de 0,05. Desta forma foi estipulada uma amostra de 34 pacientes. Após 90 dias de acompanhamento, o poder do estudo foi calculado considerando o nível de inserção clínica como referência (tamanho da amostra = 33 pacientes, α de 0,05, teste t para duas amostras dependentes). O tamanho do efeito foi calculado com base nos resultados deste estudo, considerando os valores de RAR e PDT aos 90 dias de acompanhamento. Sendo assim, o poder do estudo foi de 81%. Seleção da amostra Aproximadamente 300 pacientes encaminhados à Disciplina de Periodontia do Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos (UNIFEB), pelo serviço de triagem desta faculdade (entre Março 2008 e Fevereiro 2009), foram examinados para participar do presente estudo. Os critérios de inclusão no estudo foram os seguintes: - Apresentar boas condições de saúde geral, sem qualquer alteração sistêmica evidente ao exame clínico, ou detectado pela anamnese que pudesse influenciar nos resultados do tratamento periodontal; - História negativa de estado gestacional e/ou uso de contraceptivos ou qualquer outro tipo de hormônio nos 3 meses antecessores ao estudo ou durante o mesmo; Dissertação de Mestrado 33

35 -.História negativa de antibioticoterapia, medicação antiinflamatória ou imunossupressora, seja na forma sistêmica ou local, e/ou uso de qualquer anti-séptico ou irrigador bucal como parte dos hábitos de higiene bucal nos últimos 6 meses ou durante o mesmo; - História negativa de tabagismo; - História negativa de tratamento periodontal nos últimos 12 meses. Foram selecionados 38 pacientes com idade 25 anos que eram instruídos quanto ao tratamento periodontal, assinavam o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE- Anexo 5) e eram incluídos no estudo se apresentassem: - No mínimo, 12 dentes na boca. - Diagnóstico de periodontite crônica generalizada, de moderada a avançada (AAP- 1999). - Ausência de quadros periodontais agudos no momento do exame (abcessos periodontais e gengivite e/ou periodontite necrosante aguda). -Dentes anteriores e pré-molares com ausência de lesão endodôntica, cáries, restaurações extensas, prótese ou qualquer disfunção oclusal. - 3 sítios (interproximais e em sextantes distintos) com profundidade à sondagem de 5 a 9 mm e sangramento á sondagem. Durante o estudo, 5 pacientes foram excluídos (três homens e uma mulher não seguiram o regime de consultas semanais; uma mulher apresentou perda adicional de inserção maior que 2 milímetros nos exames subseqüentes sendo submetida a retratamento) e a amostra final foi composta por 33 pacientes (Tabela 1). Foram incluídos no estudo 3 sítios do mesmo paciente (interproximais e em sextantes distintos) com profundidade à sondagem de 5 a 9 mm e presença de sangramento à sondagem, que receberam diferentes tratamentos. Dissertação de Mestrado 34

36 Tabela 1: Características da amostra. Variáveis Valores n 33 Idade (anos; média ± DP) 43,12 ± 8,2 (25-63 anos) Gênero Masculino (n) 12 Gênero feminino (n) 21 Número de dentes 99 Sítios por paciente 3 Sítios por dente 1 n= número de pacientes do estudo; DP= desvio-padrão. Calibração do examinador Para este exame foram utlizadas uma sonda periodontal milimetrada (PCN-15, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) e um espelho bucal, devidamente esterilizado. No período pré-experimental, foram realizados os procedimentos de calibragem do examinador, cego para os tratamentos efetuados nos respectivos sítios. Para tanto, cento e vinte sítios com profundidade à sondagem 5 mm foram randomicamente selecionados em 6 pacientes (20 sítios por paciente), estes sítios foram avaliados quanto a profundidade à sondagem em duas ocasiões distintas (intervalo de 7 dias) e os dados foram submetidos ao teste t student (p 0.05). A calibração foi aprovada uma vez que não houve diferença estatisticamente significante entre os exames (p > 0.05). Dissertação de Mestrado 35

37 Parâmetros clínicos História médica e odontologica completa foram coletadas na anamnese de todos os pacientes. Previamente aos exames clínicos confeccionouse modelos de gesso, através de moldagens de alginato, para confecção de placas de polipropileno com 1,0 mm de espessura (PVC) prensada em plastificador à vácuo (Plastivac, Bio-art Equipamentos Odontológicos, São Paulo, SP). Foram confeccionadas canaletas nestas placas, com o auxilio de uma tesoura para padronizar a posição da sonda periodontal (Fig.1). Figura 1- Sonda periodontal milimetrada em posição. No exame clínico foram avaliados os seguintes parâmetros clínicos: índice de placa visível (IPV- presente ou ausente) e índice de sangramento gengival (ISG- presente ou ausente), de acordo com Ainamo e Bay, Na seqüência, foram realizados os exames de Profundidade à Sondagem (PS), Sangramento à Sondagem (SS presente ou ausente), Nível de Inserção Clínica (NIC) e Recessão gengival (RG) (Armitage 2004). Todos estes parâmetros clínicos foram realizados com sonda periodontal milimetrada (PCN- 15, Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) e anotados. Todos os exames clínicos foram realizados por um uníco examinador calibrado e cego ao estudo no inicio, 60, 90 e Dissertação de Mestrado 36

38 180 dias após os tratamento. Previamente a realização dos exames clinicos foi realizada coleta de fluido crevicular gengival para exame microbiológico em todos os períodos. Esse estudo foi desenvolvido como um ensaio clínico randomizado controlado, cego, e no modelo de boca dividida. Todos os pacientes receberam tratamento periodontal completo na Clínica de Periodontia das Faculdades Unificadas de Barretos entre 2008 e O desenho experimental deu-se de acordo com o seguinte fluxograma (Fig 2): * Grupo Raspagem Supra e Subgengival (grupo RAR) ** Grupo Raspagem Supra e Subgengival + Irrigação com Azul de Toluidina O (1 ml / 100µg/ml) (grupo TBO) *** Grupo Raspagem Supra e Subgengival + Terapa Fotodinâmica (grupo PDT) Figura 2- Desenho Experimental. Dissertação de Mestrado 37

39 Procedimentos clínicos Um único operador realizou todos os procedimentos terapêuticos. Todos os pacientes receberam instruções sobre o desenvolvimento da doença periodontal, formas de tratamento e os meios de prevenção da mesma, através de orientações de higiene bucal (uso de escovas multicerdas macias, fio dental, escovas interdentais e escovas uni e bitufo) de acordo com a necessidade de cada um. Os procedimentos clínicos de todos os grupos foram realizados sob anestesia pela técnica de bloqueio regional. Inicialmente, foram raspados os três sítios experimentais e subseqüentemente todos os demais dentes da boca com curetas de Gracey, Mini- Gracey (5/6, 7/8, 11/12, 13/14) e limas Hirshfield (3/7, 5/11). A instrumentação era considerada concluída quando o operador a julgasse adequadamente efetuada. Os sítios selecionados foram sorteados com um dado e randomicamente alocados para os grupos: RAR (somente raspagem supra e subgengival); TBO (RAR + Irrigação com 1ml / 100µl de Azul de Toluidina O) e PDT (RAR+ TBO + Irradiação com laser de diodo de baixa potência). Após a RAR, aguardavam-se aproximadamente cinco minutos para a realização da TBO e PDT. Nos grupos TBO e PDT os sítios foram irrigados com 1ml de 100µg de Azul de Toluidina O (gel) (Farmácia Homeopatica Magistral, Marília, SP, Brasil) com uma seringa de insulina e agulha sem bisel (13mm x 0.45mm) (Becton Dicknson Ind. Ltda., Curitiba, PR, Brasil). Após 1 minuto de irrigação com azul de toluidina O os sítios do grupo PDT foram irradiados com um laser de diodo de GaAlAs (BioWave LLLT, Kondortech Equipamentos Odontológicos Ltda, São Carlos, SP, Brasil) com potência de 30 mw, feixe colimado (0,07cm 2 ) e comprimento de onda de 660 nm, durante 150 segundos, totalizando uma energia de 4J e densidade de energia de 64,28 J/cm 2. A ponta da fibra ótica do laser foi posicionada paralelamente ao longo eixo do dente em contato com a margem gengival (sem penetrar na bolsa) (Fig.3). Todos os pacientes bem como o operador fizeram uso de óculos de proteção específico, durante todo o período de irradiação. Dissertação de Mestrado 38

40 Figura 3- Ponta de saída do feixe laser posicionada. O controle supragengival foi realizado em todos os grupos, semanalmente durante os 90 dias pós-tratamento ativo e quinzenalmente ou mensalmente até o final do experimento (120, 150 e 180 dias), de acordo com as necessidades de cada paciente. Os instrumentos utilizados para este procedimento eram os mesmos citados anteriormente além de taça de borracha e pasta abrasiva. Instruções de higiene bucal eram reforçadas quando necessário. Coleta microbiológica Para a realização do exame microbiológico nos sítios experimentais efetuou-se a remoção do biofilme supragengival, seguida de irrigação leve, secagem (spray ar/água) e isolamento relativo (rolos de algodão ou gaze estéril). Cones de papel absorventes estéreis (# 30, Tanari, Manacapuru, AM, Brasil) foram introduzidos no sulco gengival, em direção apical até que uma leve resistência fosse sentida, permanecendo no local por 30 segundos (Fig 4). Dissertação de Mestrado 39

41 Figura 4- Coleta de fluido crevicular. Após sua remoção, os cones de papel absorventes foram colocados em tubos eppendorfs contendo 500µL de solução salina tamponada (PBS, ph 7.0) e congelados a 20 C negativos para posterior análise microbiológica (Lopes, 2008). Novamente, os dentes foram lavados e secos, aguardou-se um intervalo de 30 segundos e repetiu-se a coleta microbiológica no mesmo sítio. Cones com a presença de sangue eram descartados e o processo de coleta refeito. As coletas foram repetidas nos sítios selecionados após 60, 90 e 180 dias do procedimento inicial de RAR, TBO e PDT. Análise Microbiológica A análise microbiológica foi processada utilizando a técnica da reação de polimerase em cadeia (PCR) descrita por Saiki et al. (1985; 1988). Esta técnica baseia-se em reações enzimáticas cíclicas de desnaturação pelo calor, hibridização dos oligonucleotídeos e síntese enzimática de DNA, resultando na amplificação exponencial da sequência de DNA desejado, permitindo a identificação de sequências de genes específicos, tais como genes de espécies bacterianas (Ashimoto et al., 1996). Dissertação de Mestrado 40

42 Inicialmente a presença de bactérias foi confirmada através de uma reação de polimerase em cadeia (PCR), realizada em equipamento próprio utilizando um oligonucleotídeo inespecífico (Wilson, 1990): PC3mod = 5 GGACTAHAGGGTATCTAAT 3 POmod= 5 AGAGTTTGATCMTGG 3 Neste trabalho foi pesquisada a presença das seguintes bactérias: Porphyromonas gingivalis (P.g), Tannerella forsythensis (T.f), Aggregactibacter actinomycetemcomitans (A.a), Prevotella nigrescens (P.n) e Prevotella intermedia (P.i). As seqüências dos oligonucleotídeos (primer) específicos podem ser observadas na Tabela 2. Tabela 2- Seqüência de primers utilizado na análise por PCR Microrganismo Seqüência do primer Referência Prevotella intermedia 5 -TTT GTT GGG GAG TAA AGC GGG TAC ACA TCT CTG TAT CCT GCG T 3 Ashimoto al. (1996) et Tannerella forsythensis 5 -GCG TAT GTA ACC TGC CCG CA 3 5 -TGC TTC AGT GTC AGT TAT ACC T 3 Ashimoto al. (1996) et Porphyromonas gingivalis 5 - AAT CGT ASAC GGG CGA CAC AC GGG TTG CTC CTT CAT CAC AC 3 Benkirane et al. (1995) Aggregatibacter actinomycetemcomitans 5 - AAA CCC ATC TCT GAG TTC TTC TTC ATG CCA ACT TGA CGT TAA AT 3 Ashimoto al. (1996) et Prevotella nigrescens 5 - TTA TGT TAC CCG TTA TGG AAG ATG GCG AAA TAG GAA TGA AAG TTA 3 Guillot Mouton (1997) & Os oligonucleotídeos foram dissolvidos em uma solução de T.E. (10Mm Tris HCl ph 7,6: 1Mm EDTA ph 8,0) num volume calculado para garantir a concentração de 25µM. Dissertação de Mestrado 41

43 Reação do PCR Os tubos de Eppendorf com as amostras, contendo 500µL de PBS com as pontas de papel, foram descongelados à temperatura ambiente, submetidos ao agitador de tubos por um minuto, e na sequência, as pontas foram removidas e descartadas com auxílio de uma pinça clínica esterilizada, comprimindo-os entre a tampa e o tubo. Os Eppendorfs foram submetidos à fervura por dez minutos seguida de centrifugação a rpm - 10 minutos, para extração do DNA bacteriano, finalizando a preparação da amostra (SAIKI et al., 1985). O sobrenadante foi colocado em um novo tubo contendo 100µL de TE e a extração do DNA bacteriano foi realizada com fenol/ clorofórmio/ álcool isoamílico (25:24:1), seguido da precipitação com sal/etanol. Para a reação de PCR foram utilizados tubos de Eppendorf específicos (MicroAmpTM Reaction 100,0µL), onde foram previamente preparados 45µL de uma mistura de reagentes ( Master Mix ) contendo 31µL de água deionizada bi-destilada, 25µL de solução tampão (Invitrogen Life Technologies, São Paulo/ SP, Brasil), 2,7µL de cloreto de magnésio (Invitrogen Life Technologies, São Paulo/ SP, Brasil), 0,4µL de DNTp (DNA Polymerization Mix Invitrogen Life Technologies, São Paulo/ SP, Brasil), 4,0µL do primeiro oligonucleotídeo de uma bactéria específica (25µM de concentração), 4,0µL do segundo oligonucleotídeo da mesma bactéria (25µM de concentração) e 0,4µL de Taq DNA Polymerase (Life Technologies, São Paulo/SP, Brasil). Os tubos com as amostras foram agitados em vortex por 10 (dez) segundos para homogeinização do meio e, em seguida, alíquotas de 5,0µL da amostra foram adicionadas à mistura de reagentes e submetidas ao aparelho termociclador (Amplificador Gene Amp PCR System 2400 Perkin Elmer Minster Oh USA), seguindo a seguinte programação: desnaturação a 95ºC por 2 (dois) minutos, desnaturação a 95ºC por 30 (trinta) segundos, fase de anelamento (annealing) dos oligonucleotídeos a 65ºC por 1 (um) minuto, sendo a reação finalizada a 72ºC por 2 (dois) minutos. Esta seqüência foi seguida por 36 (trinta e seis) ciclos. Dissertação de Mestrado 42

44 Eletroforese A presença de DNA amplificado foi verificada em gel de agarose a 1% em eletroforese. Os géis de agarose a 1% foram preparados com agarose ultra pura (Gibco BRL Life Technology, São Paulo/ SP, Brasil) em solução tamponante TEB 1x (tampão tris-borato-edta ph 8,5). Para a corrida eletroforética, 22µL da solução após reação de PCR foram acrescidos de 2,5µL de uma solução corante de azul de bromofenol e água. Após homogeneização, a solução foi distribuída em canaletas do gel acondicionado em cuba para corrida eletroforética horizontal (Cuba Horizon Life Technology, São Paulo/ SP, Brasil), conectada a fonte de eletroforese (Eletrophoresis Power Supply Model 250 Gibco BRL- Life Technology, São Paulo/ SP, Brasil) e submerso em solução tampão TBE 1x (tampão Tris-Borato- EDTA). As corridas eletroforéticas foram submetidas a uma corrente contínua de 72 volts por 2 (duas) horas. Após o término de cada corrida, as bandas presentes no gel foram observadas imediatamente com auxílio de um transluminador de luz ultravioleta (Ultra-Lum Lab Trade do Brasil Ltda. São Paulo/ SP, Brasil). Documentação da Eletroforese A documentação fotográfica foi obtida por uma máquina Kodak Digital Science (Kodak Digital Science, DC 40, Eastman Kodak Company, Rochester/ NY, USA), diretamente sobre o transiluminador de luz ultravioleta (Fig. 5). Dissertação de Mestrado 43

45 Figura 5 - Resultado das reações de PCR com oligonucleotídeo Aggregatibacter actinomycetemcomitans, demonstrando reação positiva para a solução com DNA de A. actinomycetemcomitans a 1/1000 (1), para uma amostra (9). Análise estatística Os dados clínicos e microbiológicos foram submetidos à análise estatística pelo software BioEstat 5.0 (BioEstat 5.0, BioEstat Ssoftware, Belém, PA, Brazil). As análises intra e intergrupo foram realizados para todas as variáveis nos diferentes períodos experimentais (exame inicial, 60, 90 e 180 dias). Variáveis quantitativas (PS, NIC, RG) foram submetidas ao teste de normalidade (teste Shapiro- Wilk) e resultaram em uma distribuição não normal sendo então submetido ao teste Friedman seguido do teste Bonferroni. Dados categóricos IPV, IG, SS e prevalência de bactérias foram submetidos ao teste Q de Cochran seguidos pela comparação múltipla pelo teste McNemar. Considerando o valor de p significante quando p 0,05. A porcentagem de redução (Delta) do período inicial aos períodos de avaliação (60, 90 e 180 dias) foram calculados em todos os tratamentos e os dados foram submetidos ao teste t pareado, considerando p<0,05. Dissertação de Mestrado 44