Instituto de Ciências Biomédicas Universidade de São Paulo

Transcrição

1 Instituto de Ciências Biomédicas Universidade de São Paulo Desenvolvimento da plataforma EGene para anotação funcional e integração com banco de dados: aplicação e validação em transcritos de Eimeria spp. de galinha doméstica

2 Anotação de sequências Anotação de sequências: processo pelo qual sequências de DNA ou aminoácidos são analisadas para atribuir-se características funcionais, contextualizando-as do ponto de vista biológico (Stein, 2001) A atual velocidade com que novas sequências são geradas inviabiliza processos manuais de anotação

3 EGene EGene: pré-processamento aparamento de pontas, etc. de seqüências, filtragem de qualidade, Disponível em:

4 EGene 2 Uma vasta gama de componente de anotação foram incorporados ao EGene2: Busca e tradução de ORFs Busca de repetições seriadas: TRF, String, mreps Busca de trnas: trnascan-se Predição de genes: Genscan, GlimmerM, GlimmerHMM, Twinscan, Phat, ESTscan, SNAP Busca de motivos InterproScan conservados: HMMer Busca por similaridade: BLAST Mapeamento de ESTs: Sim4, Exonerate x Pfam, RPS-BLAST,

5 EGene 2 Uma vasta gama de componente de anotação foram incorporados ao EGene2: Busca por domínios transmembranares: TMHMM, Phobius Identificação de peptídeo sinal: SignalP, Phobius Identificação de âncora GPI: DGPI Mapeamento e quantificação de termos GO Geração de arquivos de anotação: feature table, GFF3 Geração de página web: HTML/PHP

6 EGene 2 CoEd configurador gráfico

7 Relações de ortologia e anotação de proteínas Ortologia é uma relação de homologia entre sequências de ancestralidade comum, cuja divergência ocorreu por um evento de especiação A paralogia é um caso de homologia no qual a divergência ocorreu por um evento de duplicação Proteínas com relações de ortologia, ou de paralogia recente (inparálogos), tendem a conservar suas respectivas funções Esta propriedade nos permite atribuir funções a proteínas não caracterizadas, através de sua classificação em grupos de ortologia e posterior anotação transitiva

8 COG Cluster of Orthologous Groups* Banco de dados de proteínas de bactérias e arqueias, agrupadas por ortologia e classificadas funcionalmente 66 genomas completos proteínas agrupadas grupos ortólogos 25 classificações funcionais *Tatusov et al. (1997). A genomic perspective on protein families. Science 278(5338):

9 COG

10 KOG Eukaryotic Orthologous Groups* Banco de dados de proteínas eucarióticas agrupadas por ortologia e classificadas funcionalmente. Utiliza a mesma metodologia do COG 7 genomas completos Arabidopsis thaliana Homo sapiens Drosophila melanogaster Caenorhabditis elegans Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Encephalitozoon cuniculi proteínas agrupadas grupos ortólogos 25 classificações funcionais *Tatusov et al. (2003). The COG database: an updated version includes eukaryotes. BMC Bioinformatics 4, 41.

11 KOG

12 eggnog evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups* Banco de dados com as mesmas características do COG/KOG, incrementado com 48 eucariotos, 35 arqueias e 477 bactérias, e novos grupos ortólogos para proteínas não classificadas nos grupos préexistentes 630 organismos 55 eucariotos 529 bactérias 46 arqueias proteínas agrupadas proteínas anotadas grupos ortólogos 25 classificações funcionais *Muller et al. (2010). eggnog v2.0: extending the evolutionary genealogy of genes with enhanced non-supervised orthologous groups, species and functional annotations. Nucleic Acids Res 38, D

13 eggnog

14 KEGG conjunto de bases de dados de proteínas, hierarquias, ontologias, ortologias e vias metabólicas Aoki-Kinoshita & Kanehisa (2007.) Gene annotation and pathway mapping in KEGG. Methods Mol Biol 396,

15 Filo Apicomplexa Classe Coccidia Ordem Eimeriida Cryptosporidiidae - Cryptosporidium Eimeriidae - Eimeria, Isospora, Caryospora, Cyclospora Sarcocystidae - Toxoplasma, Hammondia, Neospora, Sarcocystis, Besnoitia, Frenkelia Ordem Eucoccidiida Adeleina - Hepatozoon Lankesterillidae - Lankesterella Classe Gregarinia Classe Haemosporida Haemoproteus Hepatocystis Plasmodium Classe Piroplasmida Babesiidae - Babesia Theileriidae - Theileria

16 Eimeria sp. Gênero causador da coccidiose aviária Sua ocorrência em galinhas doméstica leva a prejuízos que variam de 800 milhões a 3 bilhões de dólares por ano Sete espécies infectam a galinha doméstica: E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. praecox e E. mitis E. tenella é considerada é o modelo de estudo do gênero E. acervulina e E. maxima também são altamente relevantes na produção de frangos de corte

17 Genoma de Eimeria tenella Complexidade: ~50-55 milhões de pares de bases Conteúdo GC: ~ 53% Cariótipo: 14 cromossomos, variando de 1 a 6 milhões de pb Número estimado de genes: ~ Genoma segmentado: regiões ricas e pobres em repetições seriadas e genes Ling et al. (2007). Sequencing and analysis of chromosome 1 of Eimeria tenella reveals a unique segmental organization. Genome Res 17,

18 Dados de sequenciamento de Eimeria Universidade de Washington em St. Louis / Merck US / IAH-UK / Universidade Nacional da Malásia - ~ ESTs (esporozoítos e merozoítos de 2a geração) de E. tenella Universidade Nacional da Malásia sequenciamento completo dos cromossomos 1 e 2; shotgun aleatório do genoma de E. maxima IAH/Instituto Sanger, UK shotgun aleatório do genoma de E. tenella Universidade de São Paulo, Brasil ORESTES de cada uma das seguintes espécies: E. tenella, E. acervulina e E. maxima

19 Análise integrada de transcritos de E. tenella Origem, tipo de biblioteca e quantidade de reads utilizados na reconstrução final dos cdnas de E. tenella Tipo de biblioteca Sequências brutas Sequências pré-processadas Repositório Instituto Sanger EST Sanger e NCBI Universidade da Malásia EST Universidade de Washington EST WUSTL USDA EST USDA USP ORESTES USP Total Fonte - NCBI -

20 Banco de dados de transcritos de Eimeria Protocolo: Todas as leituras de cdnas foram montadas com CAP3 E. tenella leituras de ORESTES foram montadas em conjunto com ESTs convencionais (WashU, Sanger, USDA e Malásia) Espécies E. tenella E. maxima E. acervulina Leituras Sequências montadas Contigs

21 Resultados Classificação em KOGs de proteínas de Eimeria tenella: Distribuição de classes funcionais

22 Resultados Classificação de proteínas de Eimeria tenella utilizando o eggnog: Distribuição de classes funcionais

23 Resultados Classificação de proteínas de Eimeria tenella utilizando o eggnog: Distribuição de classes funcionais

24 Resultados Proteínas mapeadas em vias metabólicas: Resultado E. acervulina E. maxima E. tenella # de transcritos # de proteínas (>50 aa) (25,5%) 761 (24,6%) 1,838 (21,1%) KO KEGG Pathways BLAST x nr positivo (e-value < 10-6) Total de proteínas de Eimeria spp. classificadas em KOs: proteínas mapeadas em vias metabólicas : (69,31%)

25 Resultados Quantificação das vias metabólicas mapeadas para E. tenella Distribuição de classes funcionais

26 Resultados Mapeamento de proteínas de Eimeria tenella em vias metabólicas: Tabela com proteínas:

27 Resultados Mapeamento de proteínas de Eimeria tenella em vias metabólicas: Tabela com proteínas:

28 Resultados Mapeamento de proteínas de Eimeria tenella em vias metabólicas: Tabela com proteínas:

29 Resultados Mapeamento de proteínas de Eimeria tenella em vias metabólicas: Tabela com proteínas:

30 Resultados Mapeamento de proteínas de Eimeria tenella em vias metabólicas: Tabela com proteínas:

31 Resultados Mapeamento de proteínas de Eimeria tenella em vias metabólicas: Tabela com proteínas:

32 Resultados Mapeamento de proteínas de Eimeria tenella em vias metabólicas: Tabela com proteínas:

33 Resultados Integração do EGene com o Gbrowse (report_gbrowse.pl) Otimizado para visualização de transcritos Representa os seguintes elementos: CDS mrna 3 e 5 UTR regiões repetitivas conteúdo GC

34 Resultados Integração do EGene com o Gbrowse (report_gbrowse.pl)

35 Resultados Anotação transitiva por associação com o KOG Transmitir a uma proteína a classificação funcional de seus ortólogos, caso ela não possua uma grupo ortólogo X B KOG0001 A sem classificação grupo ortólogo X B KOG0001 A KOG0001

36 Resultados Anotação transitiva por associação com o KOG (exemplo) O grupo ortólogo possui três proteínas, uma de cada eimeria Eace_0350 KOG1154 Eten_2431 KOG1154 Emax_0723 sem classificação KOG1154 serine/threonine/tyrosine protein kinase

37 Resultados Anotação transitiva por associação com a base KOG (exemplo)

38 Resultados Anotação transitiva por associação com a base KOG (exemplo) Eace_0350 Eten_2431

39 The Eimeria Transcript Database

40 The Eimeria Transcript Database BLAST

41 The Eimeria Transcript Database BLAST

42 The Eimeria Transcript Database Anotações Lista de produtos anotados

43 The Eimeria Transcript Database Anotações Lista de produtos anotados

44 The Eimeria Transcript Database Anotações Páginas de anotação

45 The Eimeria Transcript Database Anotações Páginas de anotação

46 The Eimeria Transcript Database Anotações Páginas de anotação

47 The Eimeria Transcript Database Anotações Páginas de anotação

48 The Eimeria Transcript Database Anotações Mapeamento de termos de GO

49 The Eimeria Transcript Database Anotações Mapeamento de termos de GO (árvore expansível)

50 The Eimeria Transcript Database Anotações Mapeamento de termos de GO (tabela de ontologias)

51 The Eimeria Transcript Database Anotações Classificação em grupos ortólogos do KOG

52 The Eimeria Transcript Database Anotações Classificação em grupos ortólogos do eggnog

53 The Eimeria Transcript Database Anotações Mapeamento em vias metabólicas do KEGG

54 The Eimeria Transcript Database Anotações Base de dados relacional

55 The Eimeria Transcript Database Anotações Base de dados relacional

56 The Eimeria Transcript Database Anotações Base de dados relacional

57 The Eimeria Transcript Database Downloads

58 Artigo

59 Equipe de pesquisa Ø Sequenciamento de ORESTES de Eimeria Prof. Alda M.B.N. Madeira ICB-USP Jeniffer Novaes Alessandra Popov Ø Desenvolvimento de programas Prof. Alan M. Durham IME-USP Luiz Thibério L. D. Rangel Milene Ferro Ricardo Yamamoto Abe Leonardo Varuzza André Yoshiaki Kashiwabara Fernando Tadashi Paulo Henrique Ahagon

60 Apoio financeiro Bioinformatics and the Eimeria transcriptome

61 Obrigado pela atenção AG-ICB-USP