UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA. Daniele Rodrigues

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA Daniele Rodrigues DETECÇÃO DE Theileria equi POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM AMOSTRAS DE SANGUE DE EQUINOS NO RIO GRANDE DO SUL Santa Maria, RS 2018

2 1 Daniele Rodrigues DETECÇÃO DE Theileria equi POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM AMOSTRAS DE SANGUE DE EQUINOS NO RIO GRANDE DO SUL Dissertação apresentada ao Curso de Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Área de concentração em Patologia e Patologia Clínica Veterinária, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária. Orientadora: Profª Drª Cinthia Melazzo de Andrade Santa Maria, RS 2018

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4 3 Daniele Rodrigues DETECÇÃO DE Theileria equi POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM AMOSTRAS DE SANGUE DE EQUINOS NO RIO GRANDE DO SUL Dissertação apresentada ao Curso do Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Área de concentração em Patologia e Patologia Clínica Veterinária, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária. Aprovado em 23 de janeiro de 2018: Drª. Cinthia Melazzo de Andrade (UFSM) (Presidente/Orientador) Drª. Rovaina Doyle (SEAPI) Drª. Luciana Dalla Rosa (UNICRUZ) Santa Maria, RS 2018

5 4 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho ao meu filho Inácio, que neste inteirim se formou, nasceu, me ensinou, me transformou, me encantou e já completou um ano; à Elisa, minha filha amada, criança índigo-cristal, meu alento, sempre com uma frase reconfortante e estimulante, minha amiga, minha fiel companheira! Dedico também à todas as mulheres que ao iniciarem uma nova empreitada na vida, se vêem grávidas, cheias de incertezas, inseguranças, alegrias, tristezas e medos. Lembrem-se: uma vida, jamais será atrapalho! Sigam em frente com seus projetos, com coragem, pois tudo dá certo no final.

6 5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, por minha vida, por tudo o que tenho, por ser tão abençoada. Aos seres de luz, aos amigos espirituais, aos orixás, às divindades, santos e anjos, enfim, a toda essa força e energia boa que me guia e me proteje. Muito obrigada! A UFSM, mãe de gratos e ingratos filhos, terra fértil do conhecimento. Pública, gratuita e de qualidade, onde tenho orgulho de residir minha formação e meu trabalho. À minha orientadora Cinthia pela oportunidade, paciência e pelo exemplo de alto astral e positividade. À professora Sônia Lopes pela acolhida fraterna no LACVet e pela torcida. À Drª. Marcia Machado pelo empurrão ao mestrado. Agradeço ao meu pai Dinarte pela cultura que sempre nos proveu, pela leitura que estimulou, pelos ensinamentos! A minha mãezinha Olmesinda, que é meu exemplo de garra, de fé, força e de coragem pra vida. Aos irmãos Ines e Rogério, pelo amor, apoio e por estarem próximos, muito mais, do que fisicamente, mas moral e emocionalmente, à Lúcia por me mostrar que a distancia não é sinônima de desalento e falta de carinho e a todos irmãos que perto ou longe, convergindo ou discordando, mas de alguma maneira contribuíram em meu percurso. Agradeço ao André Gustavo, por me ensinar que mais importante é o Grêmio (hehehe) e nada é mais intenso do que compartilhar, apoiar, querer e prover o crescimento do outro. Afinal, este é o sentido da vida: evoluir, nada mais biológico que isto! Obrigada por ser sol e estímulo em minha vida, em meu crescimento! Agradeço à minha amiga-irmã Niura, por todo o colo nos dias escuros! À Carol, meu braço direito, pelo carinhoso cuidado do meu lar, de mim, Elisa e Inácio. À Carmem pelo zelo e atenção fraterna. À tia Zélia e Sr. Lúcio por me fazerem de filha e me dispensarem todo esse amor como se tivéssemos laços de sangue. À Graça minha colega e amiga, pelas conversas, pela companhia com aroma de chá quentinho e por iluminar com tanta experiência o BioOx! À Letícia por ser a amiga presente nos momentos difíceis do PCR e por acalmar meu coração! Kênia pelas orações e sintonia. Aos colegas queridos Vinícius, Anderson, Pati e Rose, pela torcida, pela contribuição e incentivo. À secretária do PPGMV por toda cooperação, atenção e informações, a Maria é ótima! Obrigada Juliana Cargnelutti pela incansável dedicação e boa vontade para ensinar e apoiar todos os que buscam nela, melhorias no seu trabalho. À equipe do

7 6 LACVet cheia de energia e bom humor, em especial à Camarada Camila. Aos colegas do grupo de pesquisa da professora Cínthia, principalmente: à Ana Martiele pelo companheirismo e disposição em tudo o que faz, à Cássia e Andressa Bueno minhas maravilhosas tutoras pela paciência e auxílio na escrita do trabalho. Agradeço ao professor Élgion e suas alunas Tai e Cami, por compartilharem novos saberes, suas técnicas e a estrutura do laboratório! Ao colega de Biologia e professor André pelas aulas de biologia molecular e dicas na extração, ao prof. Dani pelas megas aulas, pelo temor e pelo prazer de entender tão profundamente o DNA (hehehe). Muito obrigada!

8 7 RESUMO DETECÇÃO DE Theileria equi POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM AMOSTRA DE SANGUE DE EQUINOS NO RIO GRANDE DO SUL AUTOR: Daniele Rodrigues ORIENTADORA: Cinthia Melazzo de Andrade Theileria equi é um protozoário da classe Piroplasmasida do filo Apicomplexa, que necessita de carrapato vetor para transmissão da Piroplasmose, enfermidade, que pode ser assintomática ou se apresentar de forma grave, causando severa anemia, queda no desempenho e óbito em equinos. Visto que um dos pilares da economia do Rio Grande do Sul (RS) é a atividade equina, o objetivo deste trabalho foi determinar por reação em cadeia da polimerase (PCR), ao implantar método de diagnóstico molecular, a ocorrência de Theileria equi em amostras de sangue de equinos encaminhadas para hemograma, no laboratório de análises clínicas do Hospital Veterinário Universitário de Santa Maria. Foram analisados o DNA de 144 amostras de sangue total de equinos. Para a extração utilizou-se o método fenolclorofórmio e a amplificação foi realizada com primers específicos para o agente, conforme literatura. As amostras de 53 equinos foram positivas para Theileria equi. O uso da PCR para diagnóstico da piroplasmose equina mostrou-se uma técnica com alta especificidade e sensibilidade podendo ser oferecida como método diagnóstico no laboratório de análises clínicas do hospital veterinário da UFSM. Palavras-chave: piroplasmose, teileriose, cavalos, nestedpcr.

9 8 ABSTRACT Detection of Theileria equi by polymerase chain reaction in blood sample of horses in Rio Grande do Sul AUTHOR: Daniele Rodrigues ADVISOR: Cinthia Melazzo de Andrade Theileria equi is a protozoan of the class Piroplasmasida of the phylum Apicomplexa, which needs a vector tick for transmission of Piroplasmosis, which can be asymptomatic or present in a severe form, causing severe anemia, decreased performance and death in horses. Since one of the pillars of the Rio Grande do Sul (RS) economy is equine activity, the objective of this work was to determine by polymerase chain reaction (PCR) the occurrence of Theileria equi in equine blood samples sent to the cell blood count (CBC), to the laboratory of clinical analyzes of the University Veterinary Hospital of Santa Maria. DNA from 144 whole blood samples from horses was analyzed. The phenol-chloroform method was used for the extraction and amplification was performed with specific primers for the agent, according to the literature. Samples of 53 horses were positive for Theileria equi. The use of PCR for the diagnosis of equine piroplasmosis has shown to be a technique with high specificity and sensitivity that can be offered as a diagnostic method in the laboratory of clinical analyzes of the UFSM veterinary hospital. Key words: piroplasmose, teileriose, horses, nestedpcr

10 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Ciclo Theileria equi, demostrando sua infecção inicial nos linfócitos e formação da Cruz de Malta nos eritrócitos Figura 2 - Foto de microscopia óptica em objetiva de 100x. À esquerda (BA) Babesia caballi e à direita (TE) inclusões em forma de Cruz de Malta característica de Theileria equi Figura 3- Gel de agarose mostrando produtos da amplificação para Babesia caballi

11 10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS celisa - ELISA competitivo DNA - Ácido Desoxirribonucléico EDTA - Ácido diaminotetraacético ELISA - Ensaio imunoenzimático Indireto EMA - Equi Merozoite Antigen h - hora HVU hospital veterinário universitário IFAT - Teste Imunofluorescência Indireto IgG imunoglobulinas G IgM imunoglobulinas M L - litro LACVet Laboratório de análises clínicas veterinária M - Molar mg - miligramas min - Minutos ml - mililitro mm - milímetros mm - milimolar mrna - RNA mensageiro NaCl Cloreto de sódio OIE - Organização Internacional de Saúde Animal PCR Reação em cadeia da polimerase RNAse - Ribonuclease rpm - Rotações por minuto RS Rio Grande do Sul SDS - Dodecilsulfato de sódio TE - Tampão de eluição TFC - Teste de Fixação do Complemento Tris-HCl hydroxymethyl aminomethane hydrochloride U - Unidade v Volume С Graus Celsius μl microlitro μg micrograma μm micrometro

12 11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA MANUSCRITO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS AMOSTRAS DE SANGUE: HEMOGRAMA ISOLAMENTO DO DNA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO CÔMITE DE ÉTICA REFERENCIAS CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS... 41

13 12 1 INTRODUÇÃO Theileria equi e Babesia caballi são os agentes causadores da piroplasmose equina, doença que atualmente é classificada como Teileiriose ou Babesiose dependendo do agente infectante. São parasitas intraeritrocitários que necessitam de vetores para sua transmissão, os sinais clínicos característicos da enfermidade ocorrem devido à intensa destruição dos eritrócitos do hospedeiro (FARIAS, 2001; UILENBERG, 2006; O DWYER, 2010). Sendo uma das principais doenças parasitárias de equinos, esta hemoparasitose causa perdas diretas e indiretas relacionadas à saúde geral dos animais. Está distribuída amplamente nas regiões tropicais e subtropicais das Américas, Ásia, África e Sudeste da Europa (FRIEDHOFF et al., 1990; UILENBERG, 2006). A Organização Internacional de Saúde Animal (OIE) classifica o Brasil como país endêmico e a piroplasmose uma infecção de nível B, com característica transmissível e de importância na saúde pública e sócio-econômica, significativa no comércio internacional de animais (Office Inernational des Epizooties). Barreiras sanitárias restringem a entrada de animais nos países isentos da infecção, exigindo o teste sorológico (ELISA) negativo, antes de liberar sua entrada (FRIEDHOFF et al., 1990). A sintomatologia é variável e inespecífica, o que dificulta o diagnóstico clínico da doença. Inicialmente ocorrem picos febris, normalmente excedendo 40 C quando o agente encontra-se na corrente sanguínea, podendo ocorrer secreção nasal mucoide, fraqueza, depressão, dispneia e aumento da frequência respiratória e cardíaca (NICOLAIEWSKY et al., 2001; ZOOBA et al., 2008). A anemia característica da piroplasmose é decorrente da ruptura das hemácias e liberação da hemoglobina com acúmulo de bilirrubina nos tecidos e hemoglobinúria (RONCATI, 2006). Ainda, podem ser observados mucosas ictéricas, petéquias e incoordenação motora. Infecções crônicas podem resultar em sinais variados, geralmente, envolvendo febre intermitente, apatia, fraqueza, falta de resistência ao exercício, esplenomegalia e perda de peso (ZOOBA et al., 2008). Em éguas, a infecção por Theileria equi causa abortos e a ocorrência em neonatos é influenciada pela parasitemia (ALLSOPP et al., 2007). O tratamento nem sempre eficaz, pode fazer com que os animais tornem-se portadores assintomáticos dos agentes, por anos ou até mesmo por toda

14 13 a vida. Além disso, em condições de baixa imunidade ou de estresse, até mesmo provocado por alterações climáticas ou a prática de exercícios físicos, podem desencadear reagudizações da doença causando problemas diretos e indiretos na criação de equinos (RONCATI, 2006). 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Laveran (1901) denominou por Piroplasma equi o parasita descrito primeiramente por Guglielmi em Nuttal e Strickland (1910, 1912) posteriormente diferenciaram morfologicamente Babesia caballi da Theileria equi, descrevendo uma nova espécie envolvida na epidemiologia da piroplasmose equina (LEAL et al., 2011). Atualmente, os agentes são classificados taxonomicamente como pertencentes ao Reino Eukaryota, Filo Apicomplexa, Classe Piroplasmasida, Ordem Piroplasmorida, Famílias Babesidae e Theileridae, Generos Babesia e Theileria, Espécies Babesia caballi e Theileria equi (MONTEIRO, 2010). A taxonomia da T. equi foi questionada por Schein (1988) que comprovou que seu ciclo (Figura 1) ocorria primeiramente dentro de linfócitos. Nestas células, a T. equi se desenvolve liberando grande número de merozoítos após destruição da célula hospedeira, penetrando então em eritrócitos. Sua reprodução ocorre por fissão binária originando organismos piriformes, em forma de tétrade, o que caracteriza sua estrutura observada microscopicamente, conhecida como Cruz de Malta (MEHLHORN; SCHEIN, 1998). A continuidade do ciclo ocorre quando carrapatos, ao realizarem repasto sanguíneo nos equinos infectados, ingerem os organismos, que se reproduzem sexuadamente no intestino do hospedeiro invertebrado. (NIZOLI, 2005; RONCATI, 2006). Ainda, foi observada ausência de transmissão transovariana nos carrapatos vetores. Estes fatores levaram à reclassificação do parasita Babesia equi como pertencente à Família Theileridae e espécie Theileria equi (MEHLHORN; SCHEIN, 1998). Os protozoários podem atuar isolados ou concomitantemente, causando uma infecção mista. No entanto as manifestações clínicas são diferentes, sendo que B. caballi produz enfermidade mais branda em relação aos sintomas causados por T. equi (AMBAWAT et al. 1999).

15 14 Figura 1 - Ciclo Theileria equi, demostrando sua infecção inicial nos linfócitos e formação da Cruz de Malta nos eritrócitos. Fonte: Adaptado de ROTHSCHILD e KNOWLES, A ocorrência da Piroplasmose está diretamente relacionada à distribuição geográfica do vetor. Áreas tropicais e subtropicais em sua maior parte são endêmicas para a doença devido à presença dos carrapatos transmissores. Austrália e Estados Unidos erradicaram o vetor mantendo a infecção e a transmissão controladas, mesmo com a presença dos hemoparasitas. Países como Canadá e Japão, estão livres da doença, mas não do vetor e para controle de uma propagação, são impostas restrições para importações de animais (DE WAAL, 1992). Na Itália, estudos demostraram que T. equi tem grande disseminação, inclusive em áreas montanhosas (GRANDI et al., 2011) onde o vetor do gênero Rhipicephalus também é encontrado. Já no continente Asiático, estudos com equídeos da Jordânia revelaram maior prevalência de hemoparasitoses entre as mulas, seguidas de cavalos e de burros. Theileria equi foi mais predominante em cavalos e mulas, enquanto os burros foram hospedeiros mais frequentes de B. caballi, sendo a maior parte dos casos aparentemente assintomáticos, o que é comum para áreas endêmicas (QABLAN et al., 2013).

16 15 Na Argentina, a babesiose equina é endêmica nas regiões nordeste e noroeste, onde foram descritos casos clínicos causados por B. caballi (AGUIRRE et al., 2004). Este país, além do Chile e Uruguai, mantem um controle restrito de sanidade, impedindo a entrada de animais soropositivos para as duas espécies. No Brasil, a grande maioria dos animais convive com o parasito desde os primeiros dias de vida, sendo esta, provavelmente, a principal doença infectocontagiosa dos equídeos (BOTTEON et al., 2002). Um estudo retrospectivo das doenças que acometem equinos no Rio Grande do Sul (MARCOLONGO-PEREIRA et al., 2014), mostrou que 8,29% das enfermidades são de origem parasitária, em nível mundial, 90% da população equina está sucetível à T. equi, mesmo que a infecção em alguns países não ocorra de forma endêmica (FRIEDHOFF, 1990). Em relação aos vetores transmissores de ambos os agentes da Piroplasmose citam-se artrópodes como o Dermacentor nitens, Rhipicephalus (Boophilus) microplus e Amblyomma cajennense estando disseminados pela América do Sul. Sendo o A. cajannense restrito na região amazônica (ESTRADA-PEÑA et al.,2014) e D. nitens comum nos equinos da região do central do Brasil (MONTEIRO, 2010). Nas pastagens do Rio Grande do Sul há uma prevalência do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus parasitando bovinos e ocasionalmente equinos, reconhecido como transmissor da Theileria equi, ocorrendo uma maior prevalência deste agente entre os equinos portadores de piroplasmose na região. A incidência de infestação por R. (B.) microplus nos equinos está diretamente relacionada ao compartilhamento de pastagens entre as espécies equina e bovina (TORRES et al., 2012). A prevalência da infecção por T. equi é maior em equinos a campo, no entanto a forma aguda da doença tem ocorrência mais frequente em animais confinados devido à baixa de imunidade que é relatada nesse tipo de regime (FEIJÓ et al. 2013). Em propriedades no estado de São Paulo que utilizaram pastagens compartilhadas (bovinos/equinos), observou-se a infestação do carrapato R. (B.) microplus em pelo menos 10% dos equinos, sugerindo que o cavalo seja um hospedeiro secundário para este artrópode (LABRUNA et al. 2001). Assim o R. (B.) microplus é considerado um ectoparasita alternativo para equinos e a infestação por este carrapato ocorre apenas quando existe pastagem compartilhada com bovinos (GUIMARÃES et al., 1998).

17 16 Os carrapatos vetores da Babesia caballi e Theileria equi, pertencem ao Filo Arthropoda, Classe Arachnida, Subclasse Acari, Ordem Parasitiformes, subordem Metastigmata e à família Ixodidae (MONTEIRO, 2010). Na América do Sul há ocorrência de veterores transmissores de ambos os agentes, como o Dermacentor nitens, Rhipicephalus (Boophilus) microplus e Amblyomma cajennense. Estes carrapatos estão associados aos altos níveis de Piroplasmose no rebanho equinos. O carrapato da espécie D. nitens está relacionado principalmente à transmissão da Babesia caballi e o R. (B). microplus e A. cajennense à Theileria equi e os ciclos ocorrem de maneira diferente (RONCATI, 2006; OLIVEIRA e BORGES, 2007). No ciclo e transmissão da T. equi, ocorre inoculação dos esporozoítos nos hospedeiros, presentes na saliva do carrapato. Logo após os parasitos invadem linfócitos, desenvolvendo-se em macro e micro esquizontes que dão origem aos merozoítos, estes são liberados na circulação e então invadem as hemácias. Dividem-se por fissão binária originando os trofozoítos, organismos piriformes, destruindo os eritrócitos parasitados e invadindo novas células, causando anemia e hemólise, sintomas característicos da fase aguda da doença. A ingestão dos merozoítos pelo carrapato dá continuidade ao ciclo por reprodução sexuada no intestino do artrópode e esporogonia nas glândulas salivares, sem transmissão transovariana limitando a uma geração, o ciclo da T. equi. Por esse motivo, o equino portador é o responsável pela manutenção endêmica da doença (FRIEDHOFF et al. 1990). Theileria equi possui transmissão trasestadial, sendo o carrapato passível de transmitir de larva para ninfa e de ninfa para a fase adulta, já Babesia caballi, faz a transmissão por via transovariana, ou seja, o carrapato permanece como reservatório da infecção no ambiente. B. caballi é uma babesia típica, pois tem seu ciclo iniciado quando o carrapato, ao se alimentar, inocula os esporozoítos que penetram diretamente nas hemácias do hospedeiro, passam a trofozoítos, dividindose assexuadamente por divisão binária (merogonia) em merozoítos piriformes de 2 a 5 micrômetros de comprimento. A hemácia se rompe e os merozoítos são liberados penetrando em novas hemácias e reiniciando a multiplicação. Uma pequena porcentagem dos merozoítos não se divide e se transforma em gametócitos esféricos que, ao serem ingeridos pelo carrapato vetor, iniciarão o ciclo sexuado, invadindo as células epiteliais do intestino tomando a forma de clava. Após ocorre penetração e divisão nos tubos de Malpighi, consequente infecção nas glândulas

18 17 salivares onde se multiplicam e podem ser transmitidos ao vertebrado através da picada do carrapato (O DWYER, 2010). Com relação ao hospedeiro mamífero, a transmissão do protozoário pode ocorrer de égua para o potro sem necessidade de agudização da doença (DE WAAL, 1992). Nizoli (2005) e Maia (2006) relataram transmissão intra-uterina de teileriose de éguas assintomáticas para potros que após nascimento apresentaram exames laboratoriais alterados com presença do hemoparasita evidenciando a origem transplacentária da infecção. A observação de casos clínicos em neoatos comprova a transmissão transplacentária da piroplasmose equina (GUIMARÃES et al., 1998). Ainda RONCATI (2006) comprovou a transmissão transplacentária da T. equi através de exames de PCR em amostras sanguíneas de potros colhidas imediatamente após o nascimento. Os sinais clínicos da Piroplasmose equina são variáveis e inespecíficos. Na fase inicial os sinais característicos são depressão, inapetência, secreção nasal mucoide, dispneia, aumento da frequência respiratória, da frequência cardíaca e febre, normalmente excedendo 40 C, em decorrência do aparecimento do parasito na corrente sanguínea, (NICOLAIEWSKY et al., 2001; ZOOBA et al., 2008). A lise de eritrócitos leva à anemia, havendo liberação de hemoglobina e hemoglobinúria, além de acúmulo de bilirrubina nos tecidos (RONCATI, 2006). Outros sinais observados são mucosas congestas, constipação, hemorragias petequiais ou equimoses e incoordenação (DE WAAL, 1992). Os dois agentes são bastante distintos e determinam manifestações clínicas diferentes, T. equi é considerada a mais patogênica das duas espécies, enquanto a B. caballi causa febre mais persistente e anemia. Já na fase crônica, em que a parasitemia é baixa, o maior problema é a anemia discreta com diminuição do desempenho e da capacidade reprodutiva do animal (DE WALL, 1992). Havendo diminuição do status imunológico dos animais a doença pode se tornar aguda novamente observando-se incremento na anemia (AMBAWAT et al., 1999). Durante a fase crônica não há alteração significativa entre o hematócrito de equinos não infectados e de portadores de T. equi. Equinos com a doença crônica são considerados reservatório para a transmissão de T. equi (SCHEIN, 1988). A fase aguda, que ocorre após 10 a 30 dias nos casos de Babesia caballi e 12 a 19 dias nos casos de Theileiria equi é marcada por febre intermitente associada à presença do parasito na corrente sanguínea (DE WALL, 1992). A anemia intensa e

19 18 hemólise intra-vascular, ocorre devido à destruição dos eritrócitos com liberação de hemoglobina e depósito da bilirrubina nos tecidos, o que produz a icterícia. A hemoglobinúria ocorre pela hemoglobina eliminada na urina. Poderá ocorrer obstrução de capilares devido deposição de hemácias e detritos celulares ocasionando edemas, se houver edema em órgãos viscerais, a associação destes fatores produz metabólitos tóxicos e anóxia podendo levar ao óbito do animal (RONCATI, 2006). Quando a infecção por B. caballi leva à óbito, é devido principalmente pela formação de microtrombos e não devido a alta parasitemia, já o animal parasitado por T. equi que estiver imunodeprimido pode apresentar uma parasitemia alta com até 80% das células vermelhas parasitadas, podendo ocorrer o óbito por anemia aguda (KERBER et al., 1999). Fatores estressantes, como atividades desportivas, cansaço ou até mesmo fatores climáticos podem desencadear manifestações clínicas em animais portadores e que até então não manifestavam a doença (BOTTEON et al. 2005). A Organização Internacional em Saúde Animal determina que o método oficial para que se obtenha a permissão de transporte internacional de equinos para os países isentos da doença, seja o teste celisa (ELISA competitivo), teste por método indireto baseado na interação antígeno-anticorpo. Tem elevada sensibilidade e especificidade, portanto é um teste que pode detectar quantidades pequenas de antígenos ou anticorpos dependendo do tipo de teste desejado. Um dos fatores importantes na realização do teste é o grau de pureza do antígeno ou do anticorpo na fase sólida, pois quaisquer alterações no material heterólogo podem resultar em falsos negativos ou falsos positivos (FERREIRA, 1996). A alta sensibilidade faz com que este seja um ensaio amplamente empregado na detecção de antígenos e anticorpos bem como na quantificação de anticorpos produzidos em diversas doenças bacterianas, fúngicas e virais (BIER et al., 1989). No entanto, alguns estudos baseados na reação cruzada com antígenos de outros agentes, mostram que apesar da alta sensibilidade, este exame não é muito específico (BÖSE, 1995). Segundo LEAL (2011) o ELISA detecta IgG, imunoglobulina cujo a resposta ao antígeno é mais específica e duradoura, portanto em casos no qual o animal seja portador subclínico, o título de anticorpos do tipo IgG contra piroplasmose permanece elevado por um longo período da vida do equino. O teste é utilizado como ferramenta para a detecção de doença aguda e latente, principalmente com a

20 19 utilização de antígenos recombinantes, entretanto, a despesa para a produção destes antígenos aumenta o custo do teste de piroplasmose equina. Outro método indireto de diagnóstico, é o teste de fixação de complemento, ainda utilizado para permissão de entrada de equinos em alguns países. Foi desenvolvido por Hirato e sua equipe em 1945, e desde 1969 vinha sendo utilizado pelo departamento Americano de Agricultura como teste oficial na importação de equinos (FRIEDHOFF et al. 1990). As técnicas sorológicas possuem algumas limitações, porque podem apresentar reações positivas em animais que apresentem cura clínica e parasitológica devido à persistência de anticorpos anti- T. equi e B. caballi por longos periodos ou falsos negativos, no início da infecção, pois os anticorpos são detectáveis em média 14 dias após a infecção inicial (KNOWLES, 1996). Ainda há a ocorrência de reações cruzadas, devido à semelhança antigênica entre as espécies de hemoparasitas causadores da piroplasmose (BALDANI et al., 2008). Cunha e colaboradores (1996) observaram um baixo percentual de positividade no exame direto (1,5%) em relação a sorologia (57,89%) utilizando a técnica de imunofluorescência indireta em animais do Jóquei Clube de Pelotas (RS) indicando a deficiência do exame direto em detectar baixas parasitemias, comuns durante a fase crônica da enfermidade. A dificuldade em diagnosticar parasitemias subclínicas ocorre na maioria dos países, em Trinidade cavalos de corrida, mesmo livres de carrapatos, são submetidos a exames para a hemoparasitose (HAILAT et. al. 1997). Os métodos de diagnósticos diretos consistem na visualização do parasito no esfregaço sanguíneo e na detecção do DNA do parasito por método molecular. O sangue total, com EDTA é utilizado para confeccionar a lâmina de esfregaço sanguíneo, que pode ser corada com Gimsa ou método Panótico Rápido para visualização em microscópio ótico com objetiva de imersão ou não para a pesquisa de hemocitozoários. Dentro dos eritrócitos, Theileria equi pode se apresentar com formas arredondadas, ameboides ou mais comumente, piriformes (Figura 2). Os micromerozoítos liberados na circulação invadem as hemáceas e possuem formato redondo ou alongado de 2-3 mm de comprimento, dificilmente visíveis devido ao seu tamanho diminuto (KERBER et al., 1999). Esta é uma técnica rápida, de fácil realização e possui alta especificidade, sendo possível diferenciar morfologicamente as espécies envolvidas (ALHASSAN et al., 2005; BALDANI et al., 2010). No entanto,

21 20 segundo Salim e colaboradores (2008), os esfregaços sanguíneos seríam insuficientes para a detecção e identificação durante infecções mistas e quando o equino apresenta baixa parasitemia. A principal desvantagem dessa técnica é a baixa sensibilidade nas fases crônicas e subclínicas da enfermidade, devido a baixa parasitemia neste período da doença (BALDANI et al., 2004; ALHASSAN et al., 2005; OGUNREMI et al., 2008; BHOORA et al., 2009). Outra desvantagem desta técnica é que os agentes são facilmente confundidos com artefatos da técnica (NANTES; ZAPPA, 2008). Figura 2 - Foto de microscopia óptica em objetiva de 100x. À esquerda (BA) Babesia caballi e à direita (TE) inclusões em forma de Cruz de Malta característica de Theileria equi BA TE Fonte: Arquivo do laboratório Nos últimos anos, com o advento da reação em cadeia da polimerase (PCR), o diagnostico molecular tornou-se amplamente difundido. É uma técnica que permite obtenção de muitas cópias de sequência alvo do DNA, utilizando uma enzima termo estável, a Taq DNA, que adiciona desoxirribonucleotídeos a partir de um pequeno segmento de DNA, ou primer (sequências iniciais conhecidas) para a amplificação sobre um molde. A reação é repetida ciclicamente em diferentes temperaturas estabelecidas para as fases constituintes do processo, desnaturação, anelamento e extensão. Na primeira fase, o calor, entre C, é utilizado para parar todas as reações enzimáticas e desnaturar o DNA de dupla fita em uma fita simples. No

22 21 pareamento, a temperatura é diminuída para que os oligonucleotídeos liguem-se aos sítios apropriados no DNA molde. Nesta segunda etapa os oligonucleotídeos iniciadores se ligam corretamente nas posições 3 de cada filamento molde. Na terceira e última fase, a enzima polimerase sintetiza o segmento de DNA. A temperatura utilizada na fase de extensão é de 72 C e são utilizados cerca de trinta segundos para essa reação. O processo volta a se repetir várias vezes, até que o DNA seja copiado bilhões de vezes, em 2 a 3 horas. É uma técnica tão sensível que pode ser feita a partir do DNA de uma única célula (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2000). PCRs no seu formato padrão, nested, multiplex e tempo real foram desenvolvidas ou adaptadas para o diagnostico de Theileria equi e Babesia caballi com primers baseados nas sequências dos genes (BATTSETSEG et al., 2002; NICOLAIEWSKY et al., 2001; FARAH et al., 2003). A utilização da PCR possui boa especificidade e sensibilidade que pode variar de 78% (FARAH et Al., 2003) a 95,7% (BATTSETSEG et al., 2002). Trabalhos realizados por Bashiruddin e colaboradores (1999) detectaram a infecção por Theileria equi em cavalos, porém em todos os casos os níveis de parasitemia eram suficientes para detecção por esfregaço sanguíneo, o que não consistem em grande significância para os casos crônicos. Nicolaiewsky (2001) e colaboradores, realizaram o nestedpcr baseando-se em um primer específico para o gene do antígeno do merozoito, ema-1, o qual tem uma grande sensibilidade. Este teste demonstrou ser mais efetivo na detecção de casos subclínicos. Já no trabalho realizado por Rampersad e coloboradores (2003), utilizando a técnica de nestedpcr, com primer específico para T. equi foi capaz de detectar 3,6 vezes mais infecções do que no esfregaço sanguíneo e 2.2 vezes mais que com PCR primário somente. Tendo em vista que o Rio Grande do Sul é considerado um estado agrário, com propulsão forte de sua economia na criação de cavalos, principalmente para o manejo de bovinos, que o mercado equino movimentou cerca de 518 milhões no ano de 2015, gerando cerca de 3,2 milhões de empregos diretos e indiretos no Brasil (LIMA; FILHO, 2016) e, sendo a piroplasmose equina uma das principais restrições à criação e comércio de cavalos, levando a perdas econômicas diretas e indiretas (FRIEDHOFF et. al. 1990), melhorias no diagnóstico das doenças que acometem os equinos devem ser feitas.

23 22 O objetivo do nosso trabalho foi aliar método de diagnóstico molecular ao controle sanitário destes animais. A fim de que os exames para o agente da teileriose equina tenham resultados mais precisos que o método oferecido atualmente no laboratório de análises clinícas veterinária do hospital veterinário de Santa Maria. Visando assim, aumentar a sensibilidade de detecção do agente causador da teileriose equina, tornando possível dimensionar a ocorrência de infecções subclínicas ou assintomáticas na população equina da região e proporcionar um diagnóstico eficaz e acessível para monitorar a saúde destes animais, evitando custos a médio e longo prazo. 3 MANUSCRITO Os resultados deste trabalho encontram-se na forma de manuscrito nas normas da Revista Ciência Rural para submissão.

24 23 Detecção de Theileria equi por reação em cadeia da polimerase em amostras de sangue de equinos no Rio Grande do Sul Daniele Rodrigues 1*, Ana Martiele Engelmann 1, Juliana Felipetto Cargnelutti 2, Danieli Brolo Martins 3, Letícia dos Santos Petry 4, Guilherme Lopes Dornelles 1 Maria da Graça Aragones 1, Márcia Silveira Netto Machado 5, Sônia Terezinha dos Anjos Lopes 1, Cinthia Melazzo de Andrade 1 RESUMO: Theileria equi é um protozoário da classe Piroplasmasida do filo Apicomplexa, que necessita de carrapato vetor para transmissão da Piroplasmose, enfermidade, que pode ser assintomática ou se apresentar de forma grave, causando severa anemia, queda no desempenho e óbito em equinos. Visto que um dos pilares da economia do Rio Grande do Sul (RS) é a atividade equina, o objetivo deste trabalho foi determinar por reação em cadeia da polimerase (PCR), a ocorrência de Theileria equi em amostras de sangue de equinos encaminhadas para hemograma, ao laboratório de análises clínicas do Hospital Veterinário Universitário de Santa Maria. Foram analisados o DNA de 144 amostras de sangue total de equinos. Para a extração utilizou-se o método fenolclorofórmio e a amplificação foi realizada com primers específicos para o agente, conforme literatura. As amostras de 53 equinos foram positivas para Theileria equi. O uso da PCR para diagnóstico da piroplasmose equina mostrou-se uma técnica com alta especificidade e sensibilidade podendo ser oferecida como método diagnóstico no laboratório de análises clínicas do hospital veterinário da UFSM. Palavras-chave: piroplasmose, teileriose, cavalos, nestedpcr. 1 Laboratório de Análises Clínicas Veterinária, Hospital Veterinário Universitário-UFSM 2 Laboratório de Virologia, Universidade Federal de Santa Maria 3 Laboratório Clínico Veterinário, Escola de Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Goiás 4 Laboratório de Parasitologia. Universidade Federal de Santa Maria 5 Médica Veterinária

25 24 ABSTRACT: Theileria equi is a protozoan of the class Piroplasmasida of the phylum Apicomplexa, which needs a vector tick for transmission of Piroplasmosis, which can be asymptomatic or present in a severe form, causing severe anemia, decreased performance and death in horses. Since one of the pillars of the Rio Grande do Sul (RS) economy is equine activity, the objective of this work was to determine by polymerase chain reaction (PCR) the occurrence of Theileria equi in equine blood samples sent to the cell blood count (CBC), to the laboratory of clinical analyzes of the University Veterinary Hospital of Santa Maria. DNA from 144 whole blood samples from horses was analyzed. The phenol-chloroform method was used for the extraction and amplification was performed with specific primers for the agent, according to the literature. Samples of 53 horses were positive for Theileria equi. The use of PCR for the diagnosis of equine piroplasmosis has shown to be a technique with high specificity and sensitivity that can be offered as a diagnostic method in the laboratory of clinical analyzes of the UFSM veterinary hospital. Key words: piroplasmose, teileriose, horses, nestedpcr INTRODUÇÃO Theileria equi é um hemoparasita causador da piroplasmose equina, que atualmente é classificada como Teileriose devido ao agente infectante. É parasito intraeritrocitário que depende de um vetor para sua transmissão (FRIEDHOFF et al. 1990, UILENBERG, 2006, O DWYER, 2010). Na América do Sul há presença dos vetores transmissores tais como os carrapatos Dermacentor nitens, Rhipicephalus (Boophilus) microplus e Amblyomma cajennense. A presença destes artrópodes está associada a uma elevada ocorrência de hemoparasitoses no rebanho equino (RONCATI, 2006; OLIVEIRA & BORGES, 2007). Nas pastagens do Rio Grande do Sul há uma maior prevalência de Rhipicephalus (B.) microplus parasitando bovinos e ocasionalmente equinos. A infestação por R. (B). microplus em equinos eleva-se quando estes compartilham pastagens com bovinos (TORRES et al. 2012).

26 25 Theileria equi determina manifestações clínicas variáveis e inespecíficas, com parasitemia expressiva, podendo infectar 7% dos eritrócitos (DE WALL, 1992). Em animais imunossuprimidos ou sem imunidade prévia ao agente, a parasitemia pode chegar a 80%, levando esses animais a óbito por anemia aguda (RONCATI, 2006). A lise de eritrócitos, em decorrência da multiplicação dos parasitos no interior destas células, causa anemia, com liberação de hemoglobina e acúmulo de bilirrubina nos tecidos, além de hemoglobinúria (RONCATI, 2006). Os sinais clínicos ocorrem devido à hemólise intra e extravascular (FARIAS, 2001; UILENBERG, 2006, O DWYER, 2010). As alterações laboratoriais mais comuns são redução do número de eritrócitos, de plaquetas e da concentração de hemoglobina. Infecções agudas são também caracterizadas por neutropenia, linfopenia, diminuição do fibrinogênio plasmático e aumento da concentração de bilirrubina (ZOOBA et al., 2008). Durante a fase crônica não há alteração significativa entre o hematócrito de equinos não infectados e de portadores de T. equi (TORRES et al. 2012). O método padrão de diagnóstico da teileriose é a detecção de parasitos em esfregaço sanguíneo corado com Giemsa ou Wright (BALDANI et al., 2004; OGUNREMI et al., 2008; NANTES; ZAPPA, 2008). Outros métodos consistem na mensuração de anticorpos através da imunofluorescência indireta, fixação do complemento e ensaios imunoenzimáticos (THOMASSIAN, 2005). O diagnóstico molecular para piroplasmose é amplamente difundido, sendo que a reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional, nested, multiplex e em tempo real já foi padronizada para o diagnóstico de T. equi (NICOLAIEWSKY et al. 2001, BATTSETSEG et al., 2002, FARAH et al., 2003). A PCR para esse agente possui elevada especificidade e sensibilidade que pode variar de 78% (FARAH et al., 2003) a 95,7% (BATTSETSEG et al., 2002). A técnica é eficiente para identificar animais com infecção subclínica e facilitar o comércio e o trânsito dos mesmos, bem como para averiguar a eficácia dos tratamentos utilizados (LIU et al., 2016). A técnica do esfregaço sanguíneo é limitada,

27 26 uma vez que depende da carga parasitária do animal e dos picos de parasitemia, geralmente relacionados aos episódios febris do animal infectado (BÖSE, 1995). Estudos em diferentes regiões do Brasil demonstraram que a prevalência da doença varia de 49,2% até 100% (NIZOLI, 2005), e que está diretamente relacionada com o tipo de criação, sendo 16,67% para criação extensiva, 16,13% para semiconfinados e 4,78% para confinados (BOTTEON et al., 2002). No Rio Grande do Sul há campos com pastagens compartilhadas entre bovinos e equinos e presença do carrapato R. (B.) microplus, reconhecido como o vetor transmissor da T. equi, fato que explica a maior prevalência deste agente nos equinos utilizados para manejo de gado (NIZOLI, 2005; TORRES et al. 2012). Tendo em vista a economia do estado, baseada na criação de gado, na utilização de cavalos no manejo compartilhado de pastagens e visando uma ferramenta para diagnóstico em sanidade animal, o objetivo deste trabalho foi determinar a ocorrência do agente Theileria equi na população de equinos do RS, através do método PCR. MATERIAL E MÉTODOS AMOSTRAS DE SANGUE: Amostras sanguíneas de 144 equinos, armazenadas em frascos contendo EDTA e encaminhadas ao LACVet - laboratório de análises clínicas do hospital veterinário da UFSM, para hemograma, no período de março de 2016 a março de 2017, foram utilizadas no estudo amostras provenientes de equinos de diferentes idades e raças e de ambos os sexos. Apenas uma amostra foi encaminhada ao laboratório com pedido de pesquisa para hemoparasitos, sendo que os demais não apresentavam sinais clínicos ou suspeita de piroplasmose. As

28 27 amostras de sangue total foram aliquotadas em 500 μl e congeladas (-20ºC) para posterior análise. HEMOGRAMA As contagens de eritrócitos, leucócitos e concentrações de hemoglobina foram determinadas através de contador celular eletrônico (BC 2800 VetAuto Hematology Analyzer ). Os esfregaços sanguíneos foram corados com Panótico Rápido e utilizados na contagem diferencial de leucócitos, avaliação morfológica de eritrócitos e leucócitos bem como a presença de hemoparasitas, analisados em microscópio óptico com objetiva de 100x. Por fim, o volume corposcular médio e a concentração de hemoglobina corpuscular média foram determinados pelo cálculo matemático descrito por Lassen & Weiser (2007). ISOLAMENTO DO DNA Para extração do DNA, utilizou-se a técnica fenol-clorofórmio descrita no trabalho de BASHIRUDDIN (1999) com algumas modificações. Inicialmente 500 μl de sangue (amostra-teste) foram submetidas à digestão com 500 µl de Tris-HCl-10mM, EDTA-1mM, NaCl-100mM (TEN), 15 µl de Lauril Sulfato de Sódio (SDS) 10% e 5 µl de Proteinase K, a 60ºC por 3 h. Para a separação da fase solúvel da orgânica, adicionaram-se 500 µl de fenol e após 10 min de homogenizaçãoo, centrifugou-se a rpm por 10 min. O sobrenadante foi coletado e submetido à precipitação de DNA adicionando 1x o volume de clorofórmio:álcoolisoamílico 24:1, e homogeneizando-se por 10 minutos. Em seguida foi realizada centrifugação ( rpm, 10 min) para coleta dos sobrenadantes, que foram homogeneizados com 30 µl de NaCl 2 5M e 1 ml de etanol absoluto, sendo mantidos a -20ºC

29 28 por 12 a 18h, com o objetivo de realizar a precipitação do DNA. Após este período, as amostras foram centrifugadas a rpm por 10 min para remoção do sobrenadante e obtenção do pellet de DNA. Para remoção de resíduos, foram adicionados 500 µl de etanol 70% aos pellets, que foram incubados em temperatura ambiente por 10min, seguido de centrifugação por 15 min. Este procedimento foi repetido por mais uma vez. Em seguida os sobrenadantes foram descartados, e os pellets de DNA permaneceram em temperatura ambiente até completa secagem para posterior ressuspensão em 50µl de água ultra-pura. Após, as amostras foram submetidas ao PCR ou congeladas para análise posterior. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE Para a detecção de T. equi foi utilizada a técnica de nested-pcr conforme descrito por RAMPERSAD e colaboradores (2003). Para isso, foi realizada uma amplificação inicial utilizando os iniciadores Beq1 (forward 5-3 : ttcgttgactgcgcttggcg, e reverse 5-3 : ctaagaagcggaaatgaaa) sendo que 1µL do produto desta reação serviu como amostra de DNA para uma segunda reação onde foram utilizados os primers Beq (forward 5-3 : catcgttgcggcttggttgg e reverse 5-3 : ccaagtctcacaccctattt). O tamanho esperado dos produtos amplificados foram 709pb e 665pb respectivamente. As condições de ciclagem para todos os oligonucleotídeos iniciadores foram 30 repetições de 94ºC por 15 seg, 57ºC por 30 seg, 72ºC por 60 seg, seguidos por uma extensão final a 72ºC por 5 min. O produto da reação final foi submetido a eletroforese (80V, 30 min) em gel de agarose a 1,5%, corado com GelRed, e visualizado em transiluminador UV. Como controle positivo foi utilizada uma amostra de sangue obtida de um cavalo apresentando sinais clínicos compatíveis com a infecção por T. equi. da cidade de Goiânia estado de Goiás, cujo relato de caso ainda não foi publicado. A

30 29 sequência de nucleotídeos do controle positivo está disponível no GeneBank sob código de acesso MG RESULTADOS A ocorrência total de Theileria equi nas amostras avaliadas foi de 36,80%. Nos hemogramas das amostras positivas para teileriose, ocorreram alterações como anemias nomocíticas normocrômicas, leucocitose e aumento do fibrinogênio, mas a maioria dos exames não apresentaram alterações hematológicas (Tabela 1). Não foi possível correlacionar as alterações hematológicas com a presença do agente. A PCR monstrou ser uma técnica sensível para amostras de cavalos sem suspeita de piroplasmose, ou seja, amostras provenientes de animais portadores. Não foram observados parasitos nas lâminas confeccionadas para realização do hemograma. DISCUSSÃO O avanço das técnicas em biologia molecular representa atualmente importante ferramenta para o diagnóstico de diversas enfermidades. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para teileriose equina é uma técnica com alta especificidade e sensibilidade (LEAL et al., 2011). Os resultados da PCR deste estudo demonstraram que Theileria equi é um agente de presença relativa nas amostras avaliadas, demostrando que há animais portadores na população equina do Rio Grande do Sul. Fato que não é detectável em exame hematológico de rotina, que em sua maioria não apresentou alterações comparados aos padrões para a espécie. Não foi visualizada a presença do hemoparasita no esfregaço sanguíneo, pois a

31 30 detecção de T. equi neste teste depende da fase da doença, da parasitemia e do treinamento do avaliador (KERBER, 2008). A PCR tem sido utilizada na identificação de infecções causadas por T. equi. Esse método de diagnóstico utiliza duas etapas de amplificação (nested-pcr) e o gene EMA-1 da T. equi como molde. Esse teste pode detectar parasitemias iguais a 0,000006% por possuir alta sensibilidade. Pode-se conseguir um diagnóstico diferencial para T. equi e outros agentes através do uso do multiplex-pcr em uma só reação (NIZOLI, 2005). A sensibilidade da PCR tem sido maior do que os métodos de detecção microscópica (ALHASSAM et al., 2005). A PCR é sensível o suficiente para detectar o DNA do parasito em 2,5 µl de sangue com parasitemia de 0,000001% (SALIM et. al., 2008). Nas lâminas de esfregaço sanguíneo, de todas as amostras encaminhadas para o laboratório, não foram visualizados parasitos. Durante a fase latente da doença, o parasito geralmente não é visualizado nos esfregaços de sangue periférico, pois a parasitemia se torna inferior a 0,01% o que torna a sensibilidade dessa técnica muito baixa aumentando assim o número de falsos negativos (NIZOLI, 2005). O fato de não encontrar T. equi no esfregaço sanguíneo, já era esperada, uma vez que a necessidade de uma elevada parasitemia durante o pico febril, para que os agentes sejam visualizados em sangue total está bem descrita na literatura (BASHIRUDDIN et al., 1999, NICOLAIEWSKY et al., 2001, POSADA-GUZMÁN et al., 2015). Ainda, a teileria é classificada como um pequeno piroplasma e esta característica pode influenciar na análise do esfregaço sanguíneo, pois, devido ao seu tamanho diminuto, este parasito pode ter sua detecção prejudicada na microscopia óptica dependendo, ainda, do treinamento do avaliador ou, até mesmo, ser confundido com artefatos de coloração ou da lâmina e outras inclusões intraeritrocitárias (MONTEIRO, 2010).

32 31 O nested-pcr é um recurso diagnóstico sensível e específico tanto na fase inicial da enfermidade, no decorrer da infecção, quanto em animais portadores (KIZILARSLAN et al., 2015). A eficiência da técnica do nested-pcr é comparada ao PCR em tempo real, apenas (KIM, 2007). RAMPERSAD e colaboradores (2003), utilizando a técnica de nested-pcr, com primer específico para T. equi, foram capaz de detectar 3,6 vezes mais infecções do que no esfregaço sanguíneo e 2,2 vezes mais que com PCR primário somente. Comparando testes de PCR com ELISA temos uma aparente maior eficiência do ELISA visto que podem ocorrer resultados falsamente positivos devido à persistência de anticorpos em cavalos que já apresentaram a doença. Ainda, para o mesmo teste, a detecção de infecção recente pode resultar em soronegativos dependendo do nível de anticorpos (LEAL et al., 2011). FONSECA 2012, em um trabalho com análise de esfregaço de sangue periférico e esplênico comparado com análise de PCR, obteve resultados positivos no ensaio molecular para 13 de 15 amostras avaliadas, enquanto que o resultado do esfregaço mostrou apenas uma amostra positiva. No presente estudo foi utilizada a técnica da PCR para detecção do parasito em amostras de sangue equinos encaminhadas ao LACVet - HVU para hemograma, sem suspeita de piroplasmose. Visto que este método detecta sequências de genes específicos do parasito, observou-se uma ocorrencia de 36,80% nas amostras avaliadas. A ocorrência de T. equi pode estar relacionada à transmissão horizontal entre os animais, uma vez que em estudo conduzido no Rio Grande do Sul, observou-se que em propriedades nas quais equinos não convivem diretamente com bovinos foi constatada a sorologia positiva para teileriose equina em 40% dos animais, já naquela que no convívio direto esse percentual foi muito mais alto (90%) (TORRES et al., 2012). A presença de vetores nos animais não pôde ser avaliada, pois as amostras sanguíneas foram obtidas diretamente da rotina do laboratório de análises clínicas da UFSM. No entanto, a frequência de amostras positivas (36,8%) indica a eficiência do método da PCR

33 32 para o diagnóstico da infecção, mesmo em baixas parasitemias, já que os animais não apresentavam suspeita ou sinais clínicos de hemoparasitose, com exceção de um equino que foi encaminhado ao HVU-UFSM com suspeita de piroplasmose, ainda, foram negativos quanto a presença de parasitos na técnica de esfregaço sanguíneo. Ainda, o fato da T. equi ser detectada em número elevado de amostras pode ser justificado devido à ausência de tratamento eficaz, o animal permanece, assim, como portador do parasito. (FRIEDHOFF et al., 1990). Assim, acredita-se que a maioria dos animais avaliados sejam portadores do parasito, podendo atuar como disseminadores da doença (MELHORN & SCHEIN, 1988), prejudicando a saúde destes animais, bem como o trânsito e comércio para áreas livres da doença. CONCLUSÃO O estudo da PCR mostrou ser eficiente no diagnóstico da piroplasmose equina quando não há suspeita da doença ou quando o animal está atuando como portador, visto que não ocorreram alterações laboratoriais significativas da piroplasmose bem como os esfregaços sanguíneos confeccionados para o hemograma não apresentaram hemoparasitas. A técnica de PCR realizada no presente estudo é eficiente e pode ser utilizada como método diagnóstico para Theileria equi utilizando-se primers apropriados, para exames de rotina e exames de suspeita da piroplasmose. CÔMITE DE ÉTICA Este trabalho foi aprovado pela Comissão de ética no uso de animais da Universidade Federal de Santa Maria sob o número

34 33 REFERENCIAS ALHASSAN, A. et al. Comparison of polymerase chain reaction methods for the detection of Theileria equi infection using whole blood compared with pre-extracted DNA samples as PCR templates. Tropical Animal Health Production, v.39, n.39, p , Disponível em: < Acesso em: 9 maio de AMBAWAT, H. K. et al. Erythrocyte associated haemato-biochemical changes in Babesia equi infection experimental lyproduced in donkeys. Veterinary Parasitology. v.85, n. 85, p , Disponível em: < Acesso em: 31 outubro de BASHIRUDDIN J. B., CAMMÀ C., REBÊLO E. Molecular detection of Babesia equi and Babesia caballi in horse blood by PCR amplification of part of the 16S rrna gene. Veterinary Parasitology. v.84, n. 84, p.75-83, Disponível em: < Acesso em: 21 março de BALDANI, C. D. et al. Um ensaio imunoenzimático para a detecção de anticorpos IgG contra Babesia equi em equinos. Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n. 5, p , Disponível < em: Acesso em: 31 outubro de BATTSETSEG, B. et al. Detection of natural infection of Boophilus microplus with Babesia equi and Babesia caballi in Brazilian horses using nested polymerase chain reaction. Veterinary Parasitology, v.107, n.4, p , Disponível em:

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40 39 FIGURA 1 Produtos da amplificação em gel de agarose 1,5%. A B C D A: DNA ladder. B: controle positivo com 665pb. C: controle negativo. D:amostras

41 40 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS O cavalo é uma figura importante no contexto histórico, empresta sua energia, força no cotidiano dos trabalhos e esportes das cidades e do campo. Razão pela qual sua saúde e bem estar devem ser preservados. Nesse sentido, melhorias no diagnóstico de doenças que acometam os equinos devem ser feitas, a fim de evitar perdas desnecessárias e gastos com tratamentos ineficazes. Visto que a pesquisa de hemoparasitas em esfregaço sanguíneo, método de diagnóstico disponível no Laboratório de Análises Clínicas do HVU-UFSM não é eficaz na detecção dos agentes causadores da piroplasmose, optou-se por implantar uma técnica molecular, mais sensível, com uma eficácia já comprovada em estudos científicos, mas que até o momento não era utilizada no labortário. Neste estudo foi possível concluir que de fato a sensibilidade de dectação para Theileria equi aumentou de forma significativa, pois amostras que seriam dadas como negativas para a teileriose, utilizando o método de rotina do LACVET/UFSM, foram a partir de sua análise por PCR, positivadas. As amostras foram oriundas de equinos de diversas regiões do estado e 36,8% destas apresentaram Theileria equi, sugerindo que o Rio Grande do Sul é um estado endêmico para a doença, embora mais amostras precisem ser analisadas para afirmar este fato. Os resultados referentes à pesquisa para Babesia caballi necessitam de ajustes para publicação, pois apenas três amostras foram suspeitas de PCR postivo mostrando um arrasto no gel de agarose (Figura 3), no entanto a falta de uma banda nítida e bem definida sugere uma insepecificidade do primer utilizado para este agente. Allsopp e colaboradores(2007) relataram falta de especificiadade da sonda para B. caballi como ferramenta de diagnóstico da piroplasmose. Assim como diferentes estudos também relataram a baixa ocorrência da infecção por B. caballi (FRIEDHOFF, 1990, BASHIRUDDIN, 1999, GRANDI, 2011). Trabalho realizado por Alhassan (2007) em avaliação de PCR multiplex relata a necessidade de uma parasitemia 100X maior para detecção de B. caballi do que T. equi. Também, no histórico que acompanha as amostras, raramente eram citadas alterações clínicas que denotassem alguma patologia, demonstrando que os animais de uma forma geral eram portadores assintomáticos. Esses são considerados os

42 41 Figura 3- Gel de agarose mostrando produtos da amplificação para Babesia caballi. FONTE: Autores animais mais importantes na epidemiologia da doença, uma vez que transmitem o agente aos vetores indiscriminadamente, pois não são tratados. Os resultados desse estudo são importantes, pois, além de incrementar a capacidade de diagnóstico do LACVET/UFSM para teileriose equina, também, coloca os criadoeres em alerta para a circulação do agente no estado, e para as prováveis perdas silenciosas resultantes da doença não diagnosticada. 5 REFERÊNCIAS AGUIRRE, D.H. et. al. Babesiosis clinica em equinos de Cerrilos, Salta, Argentina. Revista de investigaciones agropecuarias. V.33 n.3, p , ALHASSAN, A. et. al. Comparison of polymerase chain reaction methods for the detection of Theileria equi infection using whole blood compared with preextracted DNA samples as PCR templates. Tropical Animal Health Production, v.39, n.39, p , ALLSOPP M.T.E.P., LEWIS B.D., PENZHORN B.L. Molecular evidence for of Theileria equi from carrier mares to their apparently healthy foals. Veterinary Parasitology. V.148, n.148, p , 2007.