PESQUISA DE Rangelia vitalii ATRAVÉS DA PCR EM SANGUE DE CÃES DA REGIÃO DE GUARAPUAVA PR..

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1 PESQUISA DE Rangelia vitalii ATRAVÉS DA PCR EM SANGUE DE CÃES DA REGIÃO DE GUARAPUAVA PR.. Priscila Ikeda (Aprimoranda em Medicina Veterinária - UNICENTRO), Anna Cláudia Baumel Mongruel (PAIC-FA), Keyla Carstens Marques De Sousa (Doutoranda FACV-UNESP-Jaboticabal), Margarete Kimie Falbo (Docente UNICENTRO), Adriano de Oliveira Torres Carrasco (Docente UNICENTRO), Meire Christina Seki, meireseki@hotmail.com Universidade Estadual do Centro-Oeste/Departamento de Medicina Veterinária/Guarapuava, PR. Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias/ Departamento de Patologia/ Jaboticabal, SP. GRANDE ÁREA: Ciências Agrárias SUB-ÁREA: Medicina Veterinária Palavras-chave: Anemia, Hemoparasita; Piroplasmose; Rangeliose; Trombocitopenia. Resumo: A rangeliose é uma doença hemolítica causada por um protozoário hemoparasita (Rangelia vitalii), transmitida por carrapato, que afeta os cães. Ela acomete geralmente animais de regiões rurais de alguns estados do Brasil. Clinicamente, os animais apresentam sinais de hemólise extravascular, como palidez das mucosas, seguidas de icterícia, esplenomegalia e hepatomegalia. Os achados laboratoriais incluem anemia e trombocitopenia. O diagnóstico conclusivo se dá pela detecção molecular do hemoparasita, em amostras de sangue dos animais doentes. Neste trabalho verificou-se a presença do gene 18S do parasita no sangue de cães por meio da PCR. Foram encontradas seis amostras positivas para o gene, sendo que posteriormente, quatro destas amostras foram encaminhadas para sequenciamento, confirmando a presença do DNA de R.vitalii em três amostras avaliadas. Introdução A Rangelia vitalii é um piroplasma que parasita hemácias e causa doença hemolítica e hemorrágica de cães da região Sul do Brasil (FIGHERA et al., 2010). É conhecida como nambyuvú (orelha que sangra), peste do sangue, mal do sangue, febre amarela canina ou rangeliose canina (CARINI e MACIEL, 1914). São protozoários pertencentes ao filo Apicomplexa, classe Sporozoasida, sendo filogeneticamente próxima à Babesia sp (LEMOS et al., 2012). Os carrapatos Rhipicephalus sanguineus e Amblyomma aureolatum são seus principais vetores (FIGHERA, 2007), O ciclo de vida da R. vitalli consiste em um estágio erirtocitário de desenvolvimento e uma fase fora do eritrócitos, ocorrendo no citoplasma de

2 neutrófilos, monócitos e células endoteliais (SOARES et al., 2011). Estudos demonstram que a hemólise extravascular que o parasita causa é importante, levando a palidez das mucosas, seguidas de icterícia, esplenomegalia e hepatomegalia (FIGHERA, 2007). Usualmente, afeta cães jovens das zonas rurais e periurbanas nas épocas mais quentes do ano quando a quantidade de carrapatos no ambiente é grande, mas também pode ser observada ao longo do ano inclusive em cães adultos (LORETTI e BARROS, 2005). A doença clínica é caracterizada na fase aguda por apatia, anorexia/inapetência e icterícia de leve a acentuada, quadros de diarréia com sangue, vômito e consequente desidratação (FIGHERA et al., 2010). Hemorragias podem ocorrer, principalmente na forma de petéquias e sufusões na pele e mucosa oral e sangramento intenso em orelhas e plano nasal (FIGHERA et al., 2010). O diagnóstico presuntivo dessa enfermidade é feito com base no histórico, quadro clínico, hemograma e resposta favorável à terapia uma vez que o parasita é ocasionalmente encontrado na circulação. As características de um hemograma de um animal positivo, encontrado em 76,9% dos casos estudados por FIGHERA et al., (2010) foi do tipo macrocítica e hipocrômica, leucocitose com neutrofilia, monocitose e linfocitose, trombocitopenia e esferocitose sugerindo que a patogênese da hemólise é imuno mediada. O diagnóstico definitivo da protozoose tem sido feito apenas por meio do exame microscópico de esfregaços de tecidos confeccionados durante a necropsia ou em cortes histológicos (FIGHERA, 2007). Técnicas de biologia molecular através da detecção do gene 18s também já foram utilizadas para a detecção do agente (SOARES et al., 2011; LEMOS et al., 2012). O presente trabalho tem como objetivo avaliar a presença de rangeliose nas amostras de sangue total da soroteca de sangue do laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias Material e métodos Foram utilizadas 79 amostras de sangue de cães, provenientes da Coleção de Amostras do Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias de Medicina Veterinária da Universidade Estadual do Centro Oeste (UNICENTRO). Estas amostras foram selecionadas de acordo com os achados laboratoriais de hemograma, tais como anemia, trombocitopenia ou ambas. A extração de DNA do sangue total foi realizada com o kit comercial QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen ) de acordo com as recomendações do fabricante. O DNA extraído foi identificado e conservado a -20º C para a realização da PCR. ODNA extraído foi submetido a técnica da reação em cadeia pela polimerase (PCR), através da amplificação do gene 18S rrna, por meio dos oligonucleotídeos BTF1 (5 -GGCTCATTACAACAGTTATAG-3 ), BTR1(5 -CCCAAAGACTTTGATTTCT CTC-3 ), BTF2-(5 -CCGTGCTAATTGTAGGGCTAATAC-3 ) e BTR2-(5 -GGACTACG ACGGTATCTGATCG-3`) conforme Jefferies et al. (2007). Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,5% corado com Brometo de Etídeo (0,5 µl/ml) em tampão de corrida TEB ph 8,0 (44,58 M Tris-base; 0,44 M ácido bórico; 12,49 mm EDTA). A

3 eletroforese foi realizada a 90V/50mA durante 90 minutos. Para a determinação dos produtos amplificados foi utilizado um marcador de peso molecular de 100 pares de base. Os resultados foram visualizados e posteriormente analisados por meio de um transiluminador de luz ultravioleta (2020E) acoplado a um programa computacional de análise de imagens (Eagle-Eye II- Stratagene ). Após leitura dos resultados, os fragmentos de DNA das amostras positivas foram sequenciados. O resultado do sequenciamento foi visualizado primeiramente por meio do software FinchTV e posteriormente, submetidos aos softwares ClustalW2 e GeneBank. Resultados e Discussão As amostras selecionadas para este estudo eram de cães com anemia e trombocitiopenia pois estes são os principais achados laboratoriais de animais com rangeliose. Em cães naturalmente infectados, a anemia é um achado comum sendo a anemia imunomediada extravascular a mais frequente (FIGHERA et al., 2010, FRANÇA et al., 2010). Trombocitopenia leve a moderada também pode estar presente na rangeliose canina (FIGHERA et al., 2007, PAIM et al., 2012). Do total das 79 amostras de cães avaliadas, 6 (7,6%) apresentaram o fragmento do gene 18s rrna pela PCR. Resultados estes semelhantes aos obtidos por Lemos et al. (2012), no qual apenas 6,8% das amostras foram positivas pela PCR, contudo nesse trabalho não houve seleção de amostras de animais (histórico de anemia, trombocitopenia ou associação dos dois). O gene 18s rrna é característico dos piroplasmas, sendo este grupo dividido em Babesia sp, Theileria sp, Cytauxzoon sp e Rangelia sp (LEMOS et al., 2012). Estudos filogenéticos indicam uma grande similaridade entre o gênero Babesia e Rangelia contudo a R. vitalli pode ser diferenciada das outras piroplasmoses de cães através do sequenciamento do fragmento do produto amplificado pela PCR (SOARES et al., 2011). Neste trabalho, das seis amostras positivas, quadro foram sequenciadas e três sequências foram semelhantes a obtida por Soares et al. (2011) (GeneBank acesso HQ150006) confirmando assim o diagnóstico de R. vitalii. A outra amostra positiva foi semelhante a Babesia canis. Um dos cães cujo diagnóstico molecular foi conclusivo para rangeliose apresentava como sinal clínico sangramento na orelha, ou nambyuvú (CARINI e MACIEL, 2010), nome popular da doença, bem como anemia e trombocitopenia. Outro animal apresentava apatia e anemia e o terceiro apatia e trombocitopenia. A apatia bem como icterícia, esplenomegalia e hepatomegalia são os sinais clínicos descritos com maior frequência nos animais infectados naturalmente (FRANÇA et al., 2014). Todos os animais receberam o tratamento clínico para a doença. Conclusões A partir deste estudo, confirmou-se a presença das piroplasmoses na população de cães avaliados, demonstrando a importância das técnicas moleculares como diagnóstico conclusivo das hemoparasitoses. Através da PCR foi possível

4 confirmar a presença de R. vitalli em cães da região de Guarapuava bem como a ocorrência de Babesia canis. Agradecimentos Ao laboratório de Imunoparasitologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP-Jaboticabal, em especial ao prof. Dr. Marcos Rogério André e a Profa. Dra. Rosangela Zacarias Machado, por disponibilizar toda sua infraestrutura para a realização da parte de Biologia Molecular deste trabalho. Referências CarinI, A; Maciel, J. About the disease of dogs called Nambyuvú and its parasite (Rangelia vitalii). An Paul Med Circ., 1914, 3, Figheira, R.A. Rangeliose. Acta. Scientiae Veterinariae, 2007, 35, Fighera, R.A; Souza, T.M.; Kommers, G.G.; Irigoyen, L.F.; Barros, C.S.L.; Patogênese e achados clínicos, hematológicos e anatomopatológicos da infecção por Rangelia vitalii em 35 cães. Pesq. Vet. Bras., 2010, 30, França, R.T.; Da Silva, A.S.; Paim, F.C.; Costa, M.M.; Soares, J.F.; Mazzanti, C.M.; Lopes, S.T.A. Rangelia vitalli in dogs in Southern Brazil. Comp. Clin. Pathol. 2010, 19, França, R.T.; Da Silva, A.S.; Loretti, A.P.; Mazzanti, C.M.; Lopes, S.T. Canine rangeliosis due to Rangelia vitalii: from first report in Brazil in 1910 to current day - a review. Ticks Tick Borne Dis. 2014, 5, Jefferies, R.; Ryan, U. M.; Irwin, P.J. PCR-RFLP for the detection and differentiation of the canine piroplasm species and its use with filter paper-based technologies. Vet. Par., 2007, 144, Lemos T. D.; Cerqueira A. M. F.; Toma H. K.; Silva A. V.; Corrêa R. G. B.; Paludo G. R.; Massard C. L.; Almosny N. R. P. Detection and molecular characterization of piroplasms species from naturally infected dogs in southeast Brazil. Rev. Bras. Parasitol. Vet., 2012, 21, Paim, C.B.; Paim, F.C.; Da Silva, A.S.; França, R.T.; Costa, M.M.; Leal, C. A.; Soares, J.F.; Labruna, M.B.; Schetinger, M.R.; Mazzanti, A; Mazzanti, C.M.; Monteiro S.G.; Lopes, S.T. Thrombocytopenia and platelet activity in dogs experimentally infected with Rangelia vitalii. Vet Parasitol. 2012, 185, Soares, J.F. et al. Detection and molecular characterization of a canine piroplasm from Brazil. Vet Parasitol, 2011, 180,

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