INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DO PCL-TRIOL EM MEMBRANAS DE PLDLA/PCL-TRIOL

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1 INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DO PCL-TRIOL EM MEMBRANAS DE PLDLA/PCL-TRIOL Márcia A. T. Duarte 1, Larissa P. Coppini 2, Carolina Luchesi 3, Eliana Ap. de R. Duek 1,2* 1* Depto. de Engenharia de Materiais UNICAMP- Caixa Postal 6122, Campinas/SP 2 Laboratório de Biomateriais PUCSP 3 Instituto de Biologia UNICAMP INFLUENCE OF ADDITION OF PCL-T IN PLDLA/PCL-TRIOL MEMBRANES Abstract: With the purpose of developing polymeric materials for applications in the medical area, the production, characterization and cell adhesion of the copolymer poly(l-co-dl lactic acid ), PLDLA, associated with poly(caprolactone)-triol, PCL-T, were studied. The PLDLA/PCL-T membranes were prepared by casting the following compositions: 100/0, 90/10, 70/30 (w/w). The results obtained by SEM and AFM showed that the PCL-T led to the production of a PLDLA porous matrix. DMA results showed the reduction of the Tg of the PLDLA in function of concentration of PCL-T. Membranes 90/10 and 70/30 allowed a better cell adhesion compared to the 100/0 composition and to the control. The 70/30 membrane showed advantages compared to others. The PCL-T improved the characteristics of the membrane leading to stronger cell/polymer interactions. Key-words: PLDLA, PCL-T, osteoblasts, cells adhesion.. 1. Introdução O uso de materiais poliméricos bioreabsorvíveis na área biomédica, é um campo de pesquisa relativamente novo, em contínuo crescimento, e para o qual profissionais de diversas áreas aliam seus conhecimentos na busca de novos materiais com propriedades físicas, mecânicos e químicas adequadas para aplicações no corpo humano, tais como, suturas cirúrgicas, sistemas para liberação controlada de drogas, peles artificiais, veias e artérias artificiais, dispositivos craniomaxilofaciais e guias para nervos. Dentre os polímeros bioreabsorvíveis encontram-se os poli (α-hidróxi ácidos), representantes de uma classe de poliésteres alifáticos sintéticos, os quais fazem parte o poli (ácido glicólico) (PGA), poli (ácido lático) (PLA), e seu copolímero, o poli(l-co-dl-ácido lático), a poli (ε- caprolactona) (PCL), entre outros. O PLA e o PCL têm sido amplamente utilizados como dispositivos para fixação óssea 1. Estes polímeros apresentam como principal vantagem, a sua forma de degradação, uma vez que em contato com fluidos corpóreos ocorre à hidrólise de suas ligações ésteres, sendo os produtos gerados completamente absorvidos pelo organismo 2, além de serem biocompatíveis, ou seja, não provocam em reações teciduais adversas. A biocompatibilidade destes materiais está diretamente associada ao comportamento das células em contato com o material e particularmente pela adesão destas à superfície do polímero. As

2 características da superfície do material são essenciais à adesão de células como osteoblastos aos biomateriais. A adesão e a proliferação, que correspondem a primeira fase na interação célula/material, que irá influenciar na capacidade das células de se diferenciarem em contato com o implante, promovem a reconstituição inicial do tecido original 3. Os experimentos envolvendo cultura de células têm várias vantagens em comparação com aqueles implantados diretamente no organismo 4. No caso da cultura de células, as condições experimentais podem ser controladas de forma mais rigorosa, mediante a manipulação das condições de crescimento, do meio utilizado no cultivo de um tipo celular específico, entre outras. Estas células quando isoladas podem formar rapidamente uma colônia, num processo de clonagem celular, o que garante a linhagem em cultivo ser geneticamente homogênea 5. Na busca por novos materiais que atendam a solicitação do estudo in vitro para diversas aplicações biomédicas, O PLDLA tem surgido como aliado neste campo 6. A combinação dos monômeros L- lactide e D, L lactide resultam no copolímero amorfo o poli(l-ácido láctico-co-d, L ácido láctico) (PLDLA), sendo que esse tem como característica ser rapidamente degradado e não gerar fragmentos cristalinos. Apesar da copolimerização resultar em um material com menor tempo de degradação, a flexibilidade desse material pode ser conseguida com a adição de PCL-triol 7. Assim, aliam-se as propriedades do copolímero PLDLA, que tem como característica ser rígido, rapidamente degradado e não gerar fragmentos cristalinos, com PCL-triol que melhora a processabilidade e aumenta a flexibilidade da blenda resultante. Resumindo, o interesse na obtenção da blenda PLDLA/PCL-Triol é somar as características PLDLA com a do PCL-T, buscando assim, uma membrana amorfa e com características mecânicas ideais para utilização em estudos de culturas celulares de osteoblastos. 2. EXPERIMENTAL 2.1. Preparação das membranas: O poli(l-co-dl, ácido lático) (70:30) PLDLA, foi sintetizado no laboratório da PUC/ Sorocaba, com massa molar média de g.mol -1. A poli(caprolactona) Triol, PCL-T, foi fornecida pela Solvay (CAPA 3091), com massa molar média de 900 g.mol -1. Foram obtidas amostras de PLDLA/PCL-T por evaporação de solvente a temperatura ambiente, nas composições (0/100), (90/10), (70/30), (50/50) % (m/m). O PLDLA e o PCL-triol foram dissolvidos separadamente em clorofórmio (Merck, Alemanha) como solvente para formar soluções 10% (m/m), e mantidas em agitador magnético por 12 horas, até completa homogeneização. As soluções 2

3 foram misturadas e as misturas vertidas em um molde de vidro (50x50x5mm) e colocadas em uma câmara para evaporação do solvente por 24 horas. Os filmes foram secos em uma estufa a vácuo durante 24 horas e armazenados em um dessecador à vácuo. As amostras foram caracterizadas pelas técnicas descritas a seguir: Análise dinâmico-mecânica (DMA): Foram realizadas utilizando o equipamento da marca NETZSCH-Análises dinâmica-mecânico-242. As amostras foram submetidas à deformação senoidal de 240µm de amplitude a uma freqüência de1,00 Hz na faixa de -100 a 200 o C, a uma taxa de aquecimento de 5 o C.min -1, usando um sistema de tração Microscopia eletrônica de varredura (MEV): amostras das superfícies e fraturas (obtidas em nitrogênio líquido) das membranas foram metalizadas com ouro (Sputter Coater BAL-TEC SCD 050) e analisadas em um microscópio eletrônico de varredura (JEOL JXA 860) operado a 10kV Microscopia de força atômica (MFA): Foi utilizado um microscópio modelo Autoprobe CP da marca Thermomicroscopes, operando no modo de não-contato, sob condições ambientais (25 C e umidade relativa de 50 %). As imagens topográficas foram obtidas utilizando ponta UL 2.0 de silício e freqüência de ressonância de aproximadamente 83 khz. A velocidade de varredura foi de 3lps. Para obtenção do valor da rugosidade e do tamanho dos poros utilizou-se um software IP (Imagens Process) Estudo in vitro: Para este procedimento, foram utilizados ratos Wistar machos com 20 dias de idade, sacrificados por deslocamento cervical seguido de decapitação. Através de uma abertura na região cranial expôs-se a calota craniana, sendo estas retiradas e mantidas em meio de cultura DMEM (Meio Eagle Modificado por Dulbecco - Nutricell) e 0,2M de L-glutamina (Sigma), adicionado de gentamicina (25 µg/ml - Sigma). O trabalho foi realizado no Laboratório de Biomateriais, do Centro de Ciências Médicas e Biológicas da PUC-SP Cultura de Células: Em ambiente estéril, os tecidos moles adjacentes às calotas foram cuidadosamente descartados, sendo o tecido ósseo posteriormente fragmentado e submetido à digestão enzimática para extração celular em meio DMEM e 1mg/mL de colagenase tipo IA (Sigma) durante 2 horas a 37 C sob agitação. Seguindo-se a centrifugação em três etapas de 10 minutos a 1200 rpm, com subseqüente ressuspensão em meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e gentamicina. Após a centrifugação foi realizada a quantificação da viabilidade celular com emprego do corante vital azul de Tripan em câmara hemocitométrica (Neubauer) e depois os osteoblastos foram mantidos em frasco para cultivo celular de 25 cm 2 (TPP). As trocas de 3

4 meio de cultura foram realizadas a cada 48 horas com monitoramento diário dos cultivos celulares em microscópio invertido Eclipse TS 100 (Nikon) Adesão celular em membranas de PCL, PLGA e suas composições: Para a análise da adesão celular, as membranas, foram colocadas no fundo de placas de cultura com 96 poços (Corning/Costar Corporation, Cambridge, MA, USA). Além das membranas poliméricas foram utilizados respectivamente discos de teflon e a própria placa de polipropileno tradicionalmente utilizado, como controles negativo e positivo nos ensaios de adesão. Todos os poços receberam 100µl de meio de cultura DMEN com 10% de soro fetal bovino, sendo incubados durante 24 horas a 37 C em atmosfera saturada de vapor e 5% CO 2. Após a incubação o meio foi retirado e inoculado 100µl de suspensão celular (10 5 células/ml), em meio DMEN com 10% de SFB por poço, incubando-se por mais 2 horas nas mesmas condições. Após cultivo, o meio foi retirado e os poços lavados novamente com o meio e em seguida adicionado 100µl de meio cultivo contendo 50 µl de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil brometo tetrazolium (MTT) (5mg/ml) incubando-se nas mesmas condições de cultivo durante 4 horas. Após este período, foi adicionado em cada poço 200 µl de DMSO e 25 µl de tampão Glicina/Sorensen. Em seguida, alíquotas 180 µl das soluções contidas nos poços foram transferidas para uma nova placa. A absorbância nas alíquotas foi medida em um leitor de microplacas Multiskan Bichromatic Version 1.06, utilizando-se comprimento de onda de 540 nm. 3. Resultados e discussão 3.1. Análise dinâmico-mecânica (DMA) Por meio da análise dinâmico-mecânica é possível obter informações sobre transições termodinâmicas de primeira ordem, tais como a fusão e a cristalização em condições de aquecimento, bem como transições termodinâmicas de pseudo segunda ordem, como é o caso da transição vítrea e das relaxações secundárias associadas às fases cristalina e amorfa 8. A Figura 1(a) mostra a dependência do módulo de perda (E ) em função da temperatura (T) das membranas de PLDLA/PCL-T nas composições 100/0, 90/10, 70/30. As Tg s foram obtidas através dos máximos de E x T e não através das curvas de tan δ x T, pois a Tan δ não é um valor puro, ou seja, ela expressa a razão entre a energia perdida e a energia armazenada, não tendo portanto significado molecular direto 9. 4

5 Figura 1. Curvas de DMA para as membranas nas composições 100/0, 90/10 e 70/30 (a) E xt, (b) E x T Os máximos das curvas E x T, obtidos por DMA, mostram a presença de duas temperaturas de transição vítrea (Tg s), nas composições 90/10 e 70/30, característicos da presença do PLDLA e do PCL-T. A adição de PCL-T deslocou a Tg do PLDLA em relação ao PLDLA puro conforme Tabela 1. De acordo com a literatura na região de transição vítrea, o comportamento mecânico de polímeros amorfos varia de um comportamento típico de material rígido para o de um material elastomérico. A faixa de temperatura na qual este processo ocorre depende de vários fatores, tais como a composição, a flexibilidade das cadeias, a massa molar do polímero, o grau de reticulação e de cristalinidade e a presença de plastificantes 8. Isto pode ser observado na Figura 1-b, onde houve uma mudança significativa do módulo de armazenamento com adição do PCL-T. Méier e colaboradores em estudos com acetato de celulose, verificaram uma diminuição nos valores do módulo de elasticidade, em função da adição de PCL-T 7. Os autores sugerem que o PCL-T reduz a interação polímero-polímero reduzindo assim as forças intermoleculares. Tabela 1 - Temperatura de transição vítrea para as membranas PLDLA/PCL-T obtidas por evaporação de solvente, medidos por DMA a partir do módulo de perda (E ). Composição PLDLA/PCL-T Tg PLDLA ( C) Tg PCL-T ( C) 100/ / /

6 3.1. Microscopia eletrônica de varredura As micrografias obtidas por MEV das superfícies das membranas de PLDLA/PCL-T em várias composições são apresentadas na Figura 2. Observa-se que a morfologia do PLDLA é densa (Fig. 2-a), a qual tornou-se porosa com a adição de PCL-T. A adição de 10% PCL-T (Fig. 2-c) na matriz tornou a superfície do PLDLA rugosa, o que pode ser interessante na adesão celular. A adição de 30% de PCl-T(Fig. 2-e) apresenta uma superfície rugosa semelhante a composição 90/10. As análises das superfícies de fratura indicam que as blendas 100/0 são densas (Fig. 2-b) e que 10% de PCL T (Fig. 2-d), modifica completamente a morfologia apresentando uma matriz de PLDLA rodeada por esferas e poros. Figura 2 Micrografias das blendas de PLDLA/PCL-T com magnificação de 500X: (a) superfice100/0, (b) superfície de fratura 100/0, (c) superfície 90/10, (d) superfície de fratura 90/10, (e) superfície 70/30, (f) superfície de fratura 70/ Microscopia de Força atômica (MFA) Através da MFA, foi possível constatar que a adição do PCL-T muda a morfologia da membrana, como foi constatado na análise de MEV e pode ser visto através da Figura 3. Com a adição do PCL-T a membrana tornou a porosa. A porosidade é um fator importante para o crescimento das células por toda a estrutura da membrana. Luciano et al.; mostraram que a adição de plastificante a uma matriz de poli(ácido láctico) produz membranas porosas e bioreabsorvíveis 6

7 com poros interconectados de tamanhos controlados e com boas propriedades mecânicas para utilização como suporte para cultura de célula 10. De acordo com a Figura 3 é possível observar as topografias (3D) das membranas nas diferentes composição. A adição de PCl-T modifica a rugosidade da superfície. Com 10% e 30% de PCL-T a rugosidade média (RMS) respectivamente de 126 nm e 265 nm enquanto o PLDLA puro apresenta rugosidade média de 82 nm. (a) (b) (c) Figura 3- Imagens topográficas obtidas por MFA das membranas de PLDLA/PCL-T (a) 100/0 (20 nm), (b) 90/10 (100nm) e (c) 70/30(100nm) 3.2. Adesão celular Os resultados do teste ANOVA mostram uma diferença significante (p<0,05) entre as amostras na análise de adesão. O Teste Turkey, usado para comparar as amostras quanto à adesão celular nas Blendas de PLDLA/PCL-T foi significantemente diferente, quando comparada aos controles negativo (teflon) e positivo (placa de poliestireno), os quais mostraram estatisticamente diferentes entre si (p<0,05). O PLDLA foi o que demonstrou ter uma menor afinidade com as células osteoblásticas e o PLDLA/PCL-triol 90/10 e 70/30, foi o que demonstrou ter a maior afinidade com as células, ainda maior que o próprio controle positivo, que foi a própria placa de cultura (p<0,05) ( Fig.4). 7

8 As células osteoblásticas cultivadas sobre as blendas com diferentes concentrações de PCL-T e o controle positivo, apresentavam sua a morfologia característica, sendo estas alongadas, achatadas e com projeções citoplasmáticas ligando-as a outras células, resultados similares foram encontrados por Woo, (2007) 11, em seu trabalho com osteoblastos de ratos. A adesão celular e em particular, das expressões de proteínas envolvidas na adesão das células cultivadas com biomateriais é de crucial importância na manutenção da estrutura tecidual, cicatrização, resposta imune, e também a interação do tecido com os biomateriais 12. A adesão é facilitada pela hidrofilicidade, porosidade ou por substratos eletricamente carregados, nestes casos a taxa de absorção de água é maior, assim podendo aumentar da capacidade de adesão celular 13. O PLDLA possui uma adesão celular lenta, podendo ser devido a hidrofobicidade ou até devido a sua baixa rugosidade da superfície do material 14, enquanto o PCL-T apresenta três hidroxilas livres (OH-), aumentando assim, a polaridade da membrana e consequentemente permitindo uma melhor interação célula/polímero, podendo este ser um dos motivos que ajudou as blendas com PCL-T em sua composição, permitir estatisticamente uma maior adesão celular em comparação aos controles e a blenda 100/0. Além disso é possível observar na MFA, a mudança na superfície com a adição de PCL-T, aumentando a porosidade o que também pode ter influenciado na adesão celular. Figure 4 Adesão de células de osteoblastos cultivada em diferentes composições das membranes PLDLA/PCL-T 4. Conclusão Baseado nos resultados apresentados pôde-se verificar a influência do PCL-T na matriz de PLDLA, o qual modificou suas propriedades mecânicas, térmicas e morfológicas. Nas análises 8

9 realizadas in vitro, conclui-se que o PCL-T melhorou a interação célula-material. A composição 70/30 interagiu melhor com as células que as demais membranas. Estes resultados indicam que as blendas de PLDLA/PCL-T são promissoras para utilização como suporte para cultura de células, curativos para ulceração na pele e em outras aplicações que necessitem de membranas porosas e com uma boa flexibilidade, o que é conferido com a adição de PCL-T na blenda. 5. Agradecimentos À profa.dra. Mônica A. Cotta e ao Engenheiro João Hermes Clerici do Instituto de Física Aplicada da Unicamp (IFGW - DFA - LPD ), pôr cederem o equipamento para análise de MFA. 6. Referências Bibliográficas 1. S.H. Barbanti; C.A.C. Zavaglia; E.A.R. Duek. Polímeros: Ciência e Tecnologia, 2005, 15, 13, 2. K Rezwan; Q.Z. Chen; A.R. Boccaccini. Biomaterials, 2006, 27, A.R. Santos Jr; B.M.P. Ferreira; E.A.R. Duek; H. Dolder; R.S. Wada; M.L. Wada. Artificial Organs, 2004, 28, A.A. ; I.E. Claes. Biomaterials,1996,17, L.P.M. Eça. Biologia Molecular Guia Prático e Didático, Revinter, Rio de Janeiro, J.E. Bergsma; W.C. Bruijn; F.R. Rozema; R.R. Bos; G. Boering. Biomaterials, , M.M. Meier; L.A. Kanis; V. Soldi. International Journal of Pharmaceutics, 2006, 278, S.N. Cassu; M.I. Felisberti. Quim. Nova, 2005, 28, A.P.T. Pezzin. Tese de doutorado, UNICAMP, São Paulo, R.M. Luciano; C.A.C. Zavaglia; E.A.R. Duek; M.C. Alberto-Rincon. Journal Mater. Sci. in Med.; 2003, 14, K.M. Woo; J.H. Jun; V.J. Chen; J. S.; J.B.Hyun-Mo Ryoo; Gwan-Shik Kim, M.J. Somermane, Biomaterials, 2007, 28, K. Anselme. Biomaterials, 2000, 21, S.H. Barbanti; A.R. Santos Jr.; C.A.C. Zavaglia; E.A.R Duek. J. Mater. Sci. Mater. Med., 2004, 15, C.B. Lombello; A.R. Santos Jr.; S.M. Malmonge; S.H. Barbanti; M.L.Wada; E.A.R. Duek. J. Mat. Sci. Mater. Med. 1993, 4,