Vinicius Rocha Santos

Transcrição

1 Vinicius Rocha Santos Isquemia-reperfusão hepática em ratos: efeitos da administração endovenosa da solução salina hipertônica a 7,5% associada a pentoxifilina Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Programa de: Clínica Cirúrgica Orientador: Prof. Dr. Telesforo Bacchella São Paulo 2010

2 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo reprodução autorizada pelo autor Santos, Vinicius Rocha Isquemia-reperfusão hepática em ratos : efeitos da administração endovenosa da solução salina hipertônica a 7,5% associada a pentoxifilina / Vinicius Rocha Santos. -- São Paulo, Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Clínica Cirúrgica. Orientador: Telesforo Bacchella. Descritores: 1.Fígado 2.Isquemia 3.Reperfusão 4.Pentoxifilina USP/FM/DBD-292/10

3 Dedicatória Dedico todo meu esforço empenhado neste trabalho: A Deus por me capacitar, sem o qual nada disto teria valor. Ao meu falecido avô Jorge, por me inspirar, homem idôneo e cirurgião exemplar, que tantas portas me abriram mesmo sem sua presença física. Ao meu falecido pai Jorge, por acreditar quando ninguém acreditava. À minha doce mãe, pelo incentivo constante, pelo exemplo que me deu de que trabalho com dedicação é sinônimo de sucesso. À minha amada esposa Aline, querida filha Maria Fernanda e futuro filho Guilherme, minha família, que mesmo nos dias mais duros da minha profissão me fazem sorrir e acreditar que vale a pena continuar.

4 AGRADECIMENTOS

5 Ao amigo e orientador Prof. Dr. Telesforo Bacchella, exemplo na medicina e na vida pessoal, pela paciência dispensada nestes anos todos de convívio e ensino. Ao Prof. Dr. Marcel Cerqueira Cesar Machado, meu co-orientador, pela experiência, criatividade e conhecimento que o tornam uma pessoa ímpar. Ao Prof. Dr. Luis Augusto Carneiro D Albuquerque, pelo incentivo imediato e estímulo constante que permite que as pessoas ao seu redor cresçam. A Dra. Estela Regina Ramos Figueira, pelo rigor acadêmico com que me auxiliou, pela profundidade e domínio deste tema. Às amigas, Ana Maria Mendonça Coelho, Sandra Nassa Sampietre e Nilza Aparecida Molan, pela ajuda científica e técnica que jamais me foram negadas. Ao Prof. Dr. Raymundo Soares de Azevedo Neto, pela contribuição inquestionável que me forneceu para a análise estatística deste trabalho. À Profa. Dra. Katia Ramos Moreira Leite, que através de seu conhecimento nos forneceu as informações do diagnóstico anátomopatológico em todos os casos estudados. Aos meus colegas médicos-assistentes do Serviço de Transplante e Cirurgia do Fígado que não ousarei mencionar os nomes pelo risco que corro em deixar injustamente alguém de fora. Agradeço a todos imensamente, pois sem a cobertura dispensada na enfermaria, centrocirúrgico e ambulatório esta tese em hipótese alguma seria concluída. Às enfermeiras, auxiliares e funcionários do transplante e cirurgia do fígado pela convivência diária que nos dá ânimo para continuar nesta empreitada.

6 "É muito melhor arriscar coisas grandiosas, alcançar triunfo, glória, mesmo se expondo à derrota, do que formar fila com os pobres de espírito que nem gozam muito, nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, que não conhecem vitória nem derrota." (Theodore Roosevelt)

7 Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação: Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver) Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 2a ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.

8 Sumário Lista de abreviaturas Lista de símbolos Lista de siglas Resumo Summary 1 INTRODUÇÂO 01 2 OBJETIVO 10 3 MÈTODOS Aspectos éticos Animais de experimentação Indução da isquemia/reperfusão hepática Desenho experimental Administração das soluções Coleta de material para análise Análise do material coletado Enzimas hepáticas Mediadores inflamatórios Extração do azul de Evans Atividade da mieloperoxidase pulmonar Respiração mitocondrial hepática Peroxidação lipídica Histologia Análise estatística 25

9 4 RESULTADOS Análise das transaminases Análise das Interleucinas 6 e Análise da extração do azul de Evans Análise da mieloperoxidase pulmonar Análise da respiração mitocondrial Análise da dosagem de malondialdeído (TBARS) Análise histológica 47 5 DISCUSSÂO 51 6 CONCLUSÕES 65 7 ANEXOS 66 8 REFERÊNCIAS 79

10 LISTA DE ABREVIATURAS Dr. Et al. Prof. doutor e outros professor LISTA DE SÍMBOLOS / por ºC grau centígrado DO DP g H + Hz K + Kg L meq mg ml Na + NaCl Na+/K+ ng nm O 2 pg U densidade ótica desvio padrão grama hidrogênio hertz potássio kilograma litro miliequivalente miligrama mililitro sódio cloreto de sódio sódio/potássio nanograma nanômetro oxigênio picograma unidade

11 LISTA DE SIGLAS ADP ADP/O ALT AMP AST ATP C5a CK CKa DNA ERO FMUSP HPTX ICAM adenosina difosfato razão ADP por consumo de oxigênio aspartato alaninotransferase adenosina monofosfato aspartato aminotransferase adenosina trifosfato subtipo do complemento célula de Kupffer célula de Kupffer ativada ácido desoxirribonucleico espécies reativas de oxigênio Faculdade de Medicina da universidade de São Paulo solução salina hipertônica 7,5% associada à pentoxifilina molécula de adesão IL-6 interleucina 6 IL-10 interleucina 10 I/R LIM-37 MPO m-rna RCR S3 S4 isquemia-reperfusão laboratório de investigação médica 37 da FMUSP mieloperoxidase ácido ribonucleico menssageiro razão do controle respiratório estado 3 da respiração mitocondrial estado 4 da respiração mitocondrial SSF solução salina fisiológica 0,9% SSH solução salina hipertônica 7,5% GC TNFα XO grupo controle fator de necrose tumoral alfa xantina-oxidase

12 RESUMO

13 Rocha-Santos V. Isquemia-reperfusão hepática em ratos: efeitos da administração endovenosa da solução salina hipertônica associada a pentoxifilina [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; Introdução: A isquemia-reperfusão hepática é um fenômeno inerente aos procedimentos cirúrgicos sobre o fígado. Descrita pela primeira vez em 1975, apresenta efeitos maléficos tanto locais quanto sistêmicos que aumentam a morbidade e mortalidade dos pacientes. Dentre as formas de se atenuar o processo, a utilização de drogas anti-inflamatórias como a solução salina hipertônica a 7,5% (SSH) e a pentoxifilina vêm sendo testadas com este propósito. As duas substâncias foram utilizadas conjuntamente (HPTX) em modelos experimentais em choque hemorrágico. Contudo, na isquemia-reperfusão de origem hepática, estas foram administradas apenas isoladamente, o que torna o presente estudo pioneiro nesta avaliação. Objetivo: Avaliar os efeitos da solução salina hipertônica a 7,5% associada a pentoxifilina na isquemia-reperfusão hepática. Métodos: Foram utilizados 138 ratos Wistar divididos em quatro grupos de acordo com o tratamento empregado: GC - grupo controle (sem tratamento), SSF - solução salina fisiológica, SSH - solução salina hipertônica a 7,5% e HPTX solução salina hipertônica a 7,5% associada a pentoxifilina. A isquemia hepática foi realizada seletivamente sobre o pedículo comum do lobo mediano e ântero-lateral esquerdo pelo período de 60 minutos. As soluções foram administradas 15 minutos antes da reperfusão hepática. No sangue, foram analisadas as dosagens de transaminases hepáticas nos períodos de quatro e 12 horas e, interleucina-6 e interleucina-10 no período de 12 horas. No tecido pulmonar foram avaliadas as dosagens de azul de Evans e mieloperoxidase pulmonar nos períodos de quatro e 12 horas e, no tecido hepático do lobo isquêmico e nãoisquêmico foram analisadas as dosagens de malondialdeído e a avaliação da respiração mitocondrial no período de quatro horas e a histologia nos períodos de quatro, 12 e 24 horas. Resultados: Os grupos tratados com SSH isolada ou em conjunto com a pentoxifilina apresentaram níveis significantemente menores (p<0,05) nas dosagens de transaminases e interleucina-6 em comparação aos outros dois grupos (GC e SSF). Resultados semelhantes entre os grupos foram observados no tecido pulmonar através da análise do azul de Evans e mieloperoxidase pulmonar em quatro e 12 horas e no tecido hepático com relação à respiração mitocondrial. No grupo no qual se adicionou pentoxifilina, houve diminuição estatisticamente significante da peroxidação lipídica e da permeabilidade pulmonar tardia quando comparado ao grupo SSH. Conclusões: A utilização em conjunto das duas soluções reduziu: a resposta inflamatória sistêmica; as lesões histológicas e funcionais do fígado; o estresse oxidativo e a permeabilidade pulmonar. Descritores: 1.Fígado 2.Isquemia 3.Reperfusão 4.Pentoxifilina

14 SUMMARY

15 Rocha-Santos V. Liver ischemia-reperfusion in rats: The synergistic effects of hypertonic saline solution and pentoxifylline [thesis]. Faculty of Medicine, University of Sao Paulo, SP (Brazil); Introduction: The liver ischemia/reperfusion (I/R) injury caused by prolonged ischemia time triggers frequently a systemic inflammatory syndrome leading to remote organ damage. Previous studies have shown that resuscitation with hypertonic saline and pentoxifylline (HPTX) attenuates hemorrhagic shockinduced injury when compared with Ringer s lactate. However, it remains unclear if the HPTX protective effect occurs on liver I/R-induced injury, and if this effect overcomes the benefits of HTS used alone. Objective: Evaluated the effects of the combination of hypertonic saline solution (HTS) and pentoxifylline (PTX) on liver I/R injury in rats. Method: One hundred thirty eigth male Wistar rats underwent to one hour of partial liver ischemia performed by clamping the pedicle from the medium and left lateral lobes. Rats were divided into 4 groups: ischemia control group (C), normal saline (0.9% NaCl, 34ml/Kg) treated group (NS), hypertonic saline (7.5%NaCl, 0.4ml/Kg) treated group (HTS), and 7.5% NaCl (0.4ml/Kg) + PTX (25mg/Kg) treated group (HPTX). Samples were collected 4, 12 and 24 hours after reperfusion for determinations of serum AST, ALT, IL-6, and IL-10 levels, liver histology, liver mitochondrial oxidation and phosphorylation, and lipid peroxidation and pulmonary vascular permeability and myeloperoxidase (MPO). Results: The results showed a significant decrease in AST and ALT serum levels in HTS and HPTX groups compared to C and NS groups. Also a significant decrease in mitochondrial dysfunction was observed in HTS and HPTX groups compared to C and NS groups. The oxidative stress was significant decreased in HPTX group compared to C, NS and HTS groups in both ischemic and non-ischemic liver lobes. Elevation in serum IL-6 was significantly lower in HTS and HPTX groups compared to C and NS groups, but there was no difference in IL-10 levels. Pulmonary vascular permeability was significantly lower in groups HTS and HPTX compared with NS group, and even lower in HPTX group compared to HTS group (P <.05). Conclusion: These data suggest that addition of pentoxifylline to hypertonic saline solution decreases the inflammatory response of the liver ischemia/reperfusion injury, decreasing the liver damage as well the pulmonary injury. Descriptors: 1.Liver 2.Ischemia 3.Reperfusion 4.Pentoxifylline

16 1. INTRODUÇÃO

17 Introdução 2 A síndrome de isquemia-reperfusão (I/R) é um fenômeno frequente na prática clínico-cirúrgica que ocorre quando há interrupção temporária do fluxo sanguíneo para um órgão seguido de sua reperfusão. Pode ser ocasionada acidentalmente, como nos choques hemorrágicos, ou intencionalmente, neste caso, direcionada para um determinado órgão-alvo. Com relação ao fígado, o pinçamento do pedículo hepático, conhecido como manobra de Pringle, nas hepatectomias, e os períodos de isquemia quente e fria, no transplante hepático, são exemplos de situações onde ocorre o fenômeno de I/R 1. O evento apresenta repercussões tanto locais como sistêmicas que podem comprometer negativamente a evolução clínica do paciente no pós-operatório 2. A importância dos efeitos da I/R hepática está no fato de, no intraoperatório, em muitas ocasiões, o fígado ser submetido a longos períodos de isquemia, como nas grandes ressecções por tumores, nas manobras para correção de hemostasia em politraumatizados e nas captações de enxertos hepáticos. A isquemia-reperfusão hepática como entidade foi descrita pela primeira vez por Toledo-Pereyra et al. 3 em Desde então, inúmeros autores avaliaram as consequêcias da I/R sobre o fígado, tanto na fase de isquemia, com interrupção abrupta do aporte de nutrientes e, principalmente de oxigênio, quanto no período de reperfusão, fase em que há intenso

18 Introdução 3 processo inflamatório associado à liberação de espécies reativas de oxigênio (ERO) 4,5. A isquemia acomete a célula em todos os níveis, desde o núcleo, passando pelas mitocôndrias, membranas celulares e retículos endoplasmáticos. Durante a fase de isquemia, a adenosina trifosfato (ATP) é degradada à adenosina monofosfato (AMP), adenosina, inosina e, por fim, hipoxantina, sendo estas duas últimas acumuladas no citoplasma da célula após passar pela membrana mitocondrial. A redução dos níveis de ATP intracelular altera o funcionamento da bomba de sódio-potássio (Na+/K+) aumentando, neste caso, o influxo de sódio (Na+) e, conseqüentemente de água para o interior do hepatócito, causando, por fim, edema celular 6,7. O acúmulo de cálcio e alterações na homeostase de hidrogênio (H+) e de Na+ ativam enzimas hidrolíticas que intensificam a lesão hepatocelular Na etapa inicial da reperfusão, com a oferta de oxigênio, a xantinaoxidase (XO) oxida a hipoxantina acumulada pela degradação do ATP durante a fase de isquemia e, acaba liberando as ERO, que, por sua vez, lesam diretamente a célula através da participação ativa do complemento 11,12. Na fase inicial da reperfusão inicia-se o processo de ativação das células de Kupffer 5. A segunda fase da reperfusão, chamada de tardia, é caracterizada pela intensa ativação das células de Kupffer culminando com a liberação de moléculas pró-inflamatórias como as interleucinas e outras citocinas que acabam promovendo e amplificando a lesão hepatocelular 13. A apoptose do hepatócito induz à maior atividade de moléculas de adesão intercelular e vascular (ICAM-1 e VCAM-1) além de

19 Introdução 4 outras moléculas da família das selectinas A sequência de eventos mencionada acima provoca o seqüestro de neutrófilos para o interior dos sinusóides e, consequentemente, para o interior do parênquima hepático, contribuindo definitivamente para a lesão do hepatócito (Figura 1) 18. isquemia reperfusão ATP AMP citoplasma hipoxantina inosina XO O2 hepatócito hepatócito hepatócito sinusóide ERO c5a CKa inicial Na+/K+ PL CK Na+ H2O Il1 CKa TNFα PMN PMN hepatócito apoptose hepatócito tardia ICAM VCAM Figura 1. Esquema representativo e simplificado da lesão de (isquemia-reperfusão) hepática. Isquemia: acúmulo de hipoxantina no citoplasma do hepatócito. Bloqueio (X) da bomba de Na+/K+ (sódio-potássio) com acúmulo de Na+ (sódio) e H2O (água). Reperfusão: fase inicial - xantina-oxidase (XO) oxida (O 2 ) a hipoxantina, liberando ERO (espécies reativas de oxigênio) com participação ativa do complemento c5a (complemento) causando a PL (peroxidação lipídica). Fase tardia - Ativação de CKa (células de Kupffer ativada) com liberação de TNFα (fator de necrose tumoral alfa) e IL-1 (interleucina-1), causando apoptose do hepatócito, que ocasiona a migração de ICAM/VCAM (moléculas de adesão intercelular e vascular), e migração de PMN (polimorfonucleares). Um outro importante mecanismo para explicar a causa da lesão tecidual na isquemia-reperfusão hepática é a ocorrência da peroxidação

20 Introdução 5 lipídica (PL), causada, indiretamente, pela ação das ERO, e, portanto, sendo formada, principalmente, na primeira fase da reperfusão A PL não apenas inicia, mas propaga todo o processo de estresse oxidativo, mantendo relação direta entre tempo de isquemia e a intensidade da lesão de I/R hepática 21. Com efeito, a PL ocorre quando há remoção de H+ das membranas fosfolípicas formando hidroperóxidos e radicais lipídicos e tem sido observada na I/R em diferentes órgãos Surprendentemente, Fukai et al. 25 puderam observar a peroxidação lipídica logo na fase de isquemia, sugerindo a utilização de drogas antioxidantes já neste período. Além dos efeitos locais sobre o parênquima hepático, a I/R produz uma síndrome inflamatória de repercussão sistêmica, sendo os pulmões, intensamente afetados, ocasionando aumento da permeabilidade vascular pulmonar, edema e nos casos mais graves, evoluindo para insuficiência respiratória Em animais de experimentação observa-se destruição dos septos interalveolares e aumento do influxo de neutrófilos para o interior do parênquima pulmonar quando há interrupção temporária do fluxo arterial para o fígado 29. A lesão pulmonar resulta no fato de seu leito vascular ser o primeiro a receber o sangue proveniente do fígado pós-reperfusão, repleto de citocinas pró-inflamatórias e, recém submetido ao estresse oxidativo, com lesão direta das membranas alveolares 30,31. Na prática, toda a cascata inflamatória decorrente da lesão de I/R hepática contribui com maior ou menor intensidade para a disfunção dos enxertos nos transplantes hepáticos e com a insuficiência hepática pós-

21 Introdução 6 operatória nas grandes hepatectomias, aumentando assim, a morbidade e a mortalidade destes pacientes 2,29. No transplante de fígado, por exemplo, após 60 minutos de isquemia quente, observam-se sinais de lesão histológica definitiva e, a partir de 90 minutos, o fígado sofre alterações orgânicas e funcionais que aumentam a mortalidade do receptor 6,32. Devido à escassez de enxertos hepáticos provenientes de doadores falecidos em relação ao número de receptores em lista de espera, os critérios utilizados para aceitação destes órgãos vêm sendo progressivamente expandidos. Além disso, os limites impostos para as indicações de ressecções hepáticas têm sido constantemente aumentados, não apenas em relação ao volume a ser ressecado como ao número de procedimentos realizados, contribuindo, ainda mais para as lesões de I/R hepáticas graves. Estes dados reforçam a importância de se conhecer e procurar atenuar as lesões de I/R hepática. Algumas medidas vêm sendo propostas com a finalidade de diminuir a intensidade da I/R hepática. Uma delas, o pré-condicionamento cirúrgico, consiste em realizar a interrupção temporária do fluxo sanguíneo hepático por um período de tempo mais curto, para, então, se realizar a isquemia definitiva. Clavien et al. 33 foram os primeiros autores a comprovarem sua eficácia na prática clínica. Uma outra alternativa para o tratamento da I/R, na qual está baseado o presente estudo, tem como alicerce a utilização de drogas endovenosas que bloqueiem e diminuam a produção e ação das citocinas infamatórias e ERO, visando, desta maneira, a minimizar as consequências da I/R hepática. A pentoxifilina e a solução salina hipertônica

22 Introdução 7 a 7,5% (SSH) são exemplos de substâncias que têm sido empregadas com esta finalidade A utilização da SSH foi estudada, principalmente, no tratamento da lesão de I/R sistêmica em experimentos nos quais se induziam choque hipovolêmico ou sepse 38,39. A SSH promove a expansão da volemia, além de melhorar o débito cardíaco, a microcirculação e a resposta imunológica no choque hipovolêmico provocado por trauma 40. Além disso, a SSH diminui a ativação de macrófagos alveolares pulmonares através da redução do estresse oxidativo sistêmico em isquemia-reperfusão intestinal 41. Uma vez que o uso da SSH no tratamento do choque hemorrágico se mostrou eficiente, sua utilização foi ampliada em estudos experimentais para o tratamento da I/R de origem hepática, revelando, também neste caso, uma diminuição da intensidade do processo 42. Nosso grupo, dentro da mesma linha de pesquisa do atual trabalho, já havia demonstrado os benefícios, tanto locais quanto sistêmicos, do emprego da SSH isolada, quando esta fora administrada quinze minutos antes da fase de reperfusão e analisada depois de quatro horas 43. Shield et al. 44 comprovaram que a SSH apresenta propriedade imunomodulatória reduzindo significantemente a resposta inflamatória através da diminuição dos níveis de interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNFα). Adicionalmente, outros autores demonstraram relação direta do emprego da SSH e diminuição de moléculas de adesão intercelular e vascular no processo de I/R 45.

23 Introdução 8 A pentoxifilina (1-[5-oxohexil]-3,7-dimetilxantina) é um inibidor da fosfodiesterase que possui propriedade vasodilatadora, particularmente no fígado. Apesar de, inicialmente, ter sido utilizada para o tratamento de doenças vasculares periféricas por melhorar o fluxo microcirculatório, sabese que a pentoxifilina inibe os efeitos deletérios de algumas citocinas inflamatórias, como o TNFα e interleucinas, minimizando assim a lesão hepatocelular 46,47. A pentoxifilina atua comprovadamente nas hemácias, leucócitos e plaquetas resultando no aumento da sua deformidade e conseqüentemente diminuição da viscosidade sanguínea, possivelmente pelo aumento da concentração de ATP que leva à estabilização de membranas celulares 48. Existem evidências de que a transcrição de ácido ribonucléico mensageiro (m-rna) para produção de citocinas nos monócitos seja bloqueada pela pentoxifilina 49. O NF-κB é uma molécula de transcrição responsável por extrair do ácido desoxirribonucleico (DNA) a informação genética necessária para produção de mediadores inflamatórios. A transcrição do m-rna, por sua vez, é dependente da ativação do NF-kB, desempenhando este, um papel central no controle da resposta imune e inflamatória 49. A pentoxifilina bloqueia diretamente a produção de citocinas, através da inibição da ativação do NF-κB, impedindo assim, que o processo de transcrição ocorra. Com efeito, a ação benéfica da pentoxifilina nas lesões de I/R hepática normotérmica foi demonstrada em estudo anterior, que comprovou a inibição da transcrição do m-rna responsável pela produção de TNFα 34.

24 Introdução 9 Desde que a SSH e a pentoxifilina apresentem efeitos benéficos tanto na microcirculação como na redução do processo inflamatório, é possível que a associação destas duas substâncias em conjunto resulte na potencialização dos efeitos isolados de cada uma delas. Embora a associação das mesmas não tenha sido avaliada em relação a I/R hepática, a utilização simultânea destas duas drogas no tratamento do choque hemorrágico evidenciou redução da translocação bacteriana além da melhora do débito cardíaco e da oxigenação da mucosa gástrica 50,51. A associação de drogas para o tratamento de processos inflamatórios constitui-se no que há de mais moderno na terapêutica da lesão de isquemia-reperfusão, visando a englobar diferentes mecanismos e etapas do processo. A hipótese que norteia o presente trabalho é de que a associação da pentoxifilina a SSH estenda os efeitos benéficos já comprovados quando cada uma das drogas é utilizada isoladamente na I/R hepática, aumentando assim, o armamentarium terapêutico da lesão de I/R hepática.

25 2. OBJETIVO

26 Objetivo 11 Avaliar os efeitos locais e sistêmicos da administração endovenosa da solução salina hipertônica (NaCl 7,5%) associada a pentoxifilina na lesão de isquemia-reperfusão hepática em ratos.

27 3. MÉTODOS

28 Métodos 13 A pesquisa foi realizada no Laboratório de Investigação Médica (LIM/37) da Disciplina de Transplante e Cirurgia do Fígado da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. 3.1 Aspectos éticos O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (CAPPesq, HC-FMUSP), sob o número 0339/09. As normas de proteção e cuidados aos animais de experimentação foram respeitadas segundo o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council, Washington, D.C., Animais de experimentação Foram utilizados 138 ratos Wistar, machos, com peso entre 230 e 270 g, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, e mantidos no Laboratório de Investigação Médica - LIM 37, em ambiente com temperatura controlada (20-22 o C) e com alimentação comercial (Nuvilab CR1-Nuvital Nutrientes LTDA) e água filtrada ad libitum em gaiolas individuais e, alternância dia e noite.

29 Métodos Indução da isquemia/reperfusão hepática Os animais foram anestesiados por via intraperitoneal com cloridrato de cetamina 5% (Ketalar, Cristália), 30 mg/kg e cloridrato de xylazina 2% (Rompum, Bayer), 30 mg/kg, submetidos à intubação orotraqueal com cateter n 16 (Jelco ) e, à ventilação mecânica (Harvard Rodent Ventilator model 683, USA), com freqüência de 60 rpm e volume corrente de 0,08 ml por grama de peso. Durante todo o procedimento, o animal foi aquecido com lâmpada halogênica de 45W e 127V. A temperatura corpórea, monitorizada por termômetro retal digital (YSI Precision 4000A Thermometer, USA), foi mantida entre 35 e 37 C. A laparotomia foi realizada por incisão mediana estendendo-se por aproximadamente 4cm, a partir do apêndice xifóide. A isquemia hepática foi realizada seletivamente através do isolamento e oclusão do pedículo hepático comum dos lobos mediano e ântero-lateral esquerdo com pinça microvascular atraumática (Figura 2). Esta técnica permite a manutenção do fluxo portal para o interior do parênquima hepático evitando a estase venosa intestinal e possibilitando a avaliação dos lobos isquêmicos e nãoisquêmicos.

30 Métodos 15 Figura 2. Isquemia hepática seletiva do lobo mediano e ântero-lateral esquerdo em rato. O período total de isquemia foi de 60 minutos, sendo, então, efetuada a liberação da pinça vascular do pedículo hepático e, conseqüentemente a reperfusão dos lobos isquêmicos. A incisão foi novamente fechada com sutura contínua com mononylon 4.0. O animal, devolvido á gaiola individual, foi mantido aquecido após a recuperação anestésica. 3.4 Desenho experimental Os 138 ratos do estudo foram distribuídos em quatro grupos de acordo com a solução administrada e o grupo sem tratamento. Dentro destes grupos, os animais foram subdivididos em conformidade com o período e o parâmetro a ser avaliado, em quatro, 12 ou 24 horas (Figura 3).

31 Métodos 16 IOT anestesia 0 min 45 min 60 min isquemia tratamento reperfusão Mediano e ântero-lateral esquerdo oclusão direito caudado livre GC SSF SSH HPTX 4 hs 12 hs AST,ALT AE,MPO S3,S4,RCR,ADP/O, MDA,histologia AST,ALT, IL-6,IL-10 AE, MPO histologia 24 hs histologia Figura 3. Representação esquemática do desenho experimental. IOT: intubação orotraqueal; min: minutos; CG: grupo controle/sem tratamento; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina; AST: aspartatoaminotransferase; ALT: alaninoaminotransferase; AE: azuldeevans; MPO: mieloperoxidase pulmonar; S3: estado3; S4: estado4; RCR: razão do controle respiratório; ADP/O: adenosina difosfato sobre consumo de oxigênio; IL-6:interleucina 6; IL-10: interleucina-10. GC (grupo controle/sem tratamento) - Vinte e sete ratos foram anestesiados e submetidos à anestesia e intubação orotraqueal. Após laparotomia foram submetidos à isquemia hepática parcial por 60 minutos sem administração endovenosa de drogas ou soluções. Estes animais foram sacrificados em quatro, 12 e 24 horas após a reperfusão para a dosagem de transaminases e interleucinas (IL6 e IL10) séricas, azul de Evans e atividade de mieloperoxidase no pulmão e, no fígado dosagem de malondialdeído, estudo da respiração mitocondrial (S3, S4, RCR e ADP/O) e avaliação histológica.

32 Métodos 17 SSF (solução salina fisiológica a 0,9%) - Trinta e sete ratos foram anestesiados e submetidos à anestesia e intubação orotraqueal. Após laparotomia foram submetidos à isquemia hepática parcial por 60 minutos. Foi administrada solução salina fisiológica a 0,9% na dose de 34ml/Kg, 45 minutos após a isquemia e 15 minutos antes da reperfusão. Estes animais foram sacrificados em quatro, 12 e 24 horas após a reperfusão para a dosagem de transaminases e interleucinas (IL6 e IL10) séricas, azul de Evans e atividade de mieloperoxidase no pulmão e, no fígado, dosagem de malondialdeído, estudo da respiração mitocondrial (S3, S4, RCR e ADP/O) e avaliação histológica. SSH (solução salina hipertônica a 7,5%) - Trinta e sete ratos foram anestesiados e submetidos à anestesia e intubação orotraqueal. Após laparotomia foram submetidos à isquemia hepática parcial por 60 minutos. Foi administrada solução salina hipertônica a 7,5% isolada na dose de 4ml/Kg, 45 minutos após a isquemia e 15 minutos antes da reperfusão. Estes animais foram sacrificados em quatro, 12 e 24 horas após a reperfusão para a dosagem de transaminases e interleucinas (IL6 e IL10) séricas, azul de Evans e atividade de mieloperoxidase no pulmão e, no fígado, dosagem de malondialdeído, estudo da respiração mitocondrial (S3, S4, RCR e ADP/O) e avaliação histológica. HPTX (solução salina hipertônica a 7,5% associada a pentoxifilina) Trinta e sete ratos foram anestesiados e submetidos à anestesia e intubação orotraqueal. Após laparotomia foram submetidos à isquemia hepática parcial por 60 minutos. Foi administrada solução salina

33 Métodos 18 hipertônica a 7,5% na dose de 4ml/Kg associada a pentoxifilina na dose de 25mg/Kg, 45 minutos após a isquemia e 15 minutos antes da reperfusão. Estes animais foram sacrificados em quatro, 12 e 24 horas após a reperfusão para a dosagem de transaminases e interleucinas (IL6 e IL10) séricas, azul de Evans e atividade de mieloperoxidase no pulmão e, no fígado, dosagem de malondialdeído, estudo da respiração mitocondrial (S3, S4, RCR e ADP/O) e avaliação histológica. O número de ratos por subgrupos de acordo com o período e material coletado encontra-se ilustrado nas Figuras 4 a 26 e descrito nos Anexos A-W. 3.5 Administração das soluções As soluções foram administradas por via endovenosa através de punção com agulha de insulina da veia peniana e injetadas pelo período de cinco minutos. Todas as drogas foram administradas 15 minutos antes da liberação da pinça vascular e reperfusão dos lobos isquêmicos, ou seja, 45 minutos após o início do período de isquemia. A solução salina fisiológica a 0,9% foi administrada na dose de 34 ml/kg, de modo a fornecer quantidade equivalente de sódio (5 meq/kg) em comparação com a solução salina hipertônica; a solução salina hipertônica a 7,5% foi administrada na dose de 4 ml/kg e, a pentoxifilina na dose de 25 mg/kg. No grupo em que se associou a SSH com a pentoxifilina,

34 Métodos 19 as drogas foram administradas em seringa única misturando-se a droga e a solução. 3.6 Coleta do material para análise Após a revascularização e recuperação da anestesia, foram retirados os catéteres da intubação orotraqueal e o animal acondicionado em gaiola individual com água ad libitum. Após cada período dos grupos acima mencionados, o rato foi novamente anestesiado com cloridrato de cetamina 5% (Ketalar, Cristália), 40 mg/kg e injetado, pela veia peniana, o corante azul de Evans (Sigma-Chemical Company, USA) na dose de 20mg/kg. Cada subgrupo foi submetido à reabertura da parede abdominal para coleta do material determinado para aquele período. O animal foi então sacrificado por secção da aorta e da veia cava inferior. O fígado foi removido e nas amostras dos lobos isquêmicos e nãoisquêmicos foram realizadas avaliações histológicas, da respiração mitocondrial e da peroxidação lipídica. A artéria pulmonar foi cateterizada via ventrículo direito com cateter de 2,0 mm de diâmetro (Silastic, Dow Corning, n o ) para infusão de 30 a 50 ml de solução fisiológica, 10ml/min. O pulmão foi removido para a extração de azul de Evans e quantificação da mieloperoxidase tecidual para aquele determinado período. No sangue, foi realizada a dosagem das transaminases hepáticas (aspartato aminotransferase e alanina aminotrasferase) e dos mediadores inflamatórios (IL-6 e IL-10). Como o corante azul de Evans interfere nas

35 Métodos 20 dosagens dos mediadores inflamatórios, este grupo de animais foi utilizado somente para a avaliação do corante no pulmão. 3.7 Análise dos materiais coletados Enzimas hepáticas As transaminases, aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotrasferase (ALT), foram analisadas como indicadores de lesão hepática após a reperfusão em quatro e 12 horas. As quantificações de AST e ALT foram realizadas pelo método ultravioleta (COBAS MIRA, Roche) otimizado de acordo com a International Federation of Clinical Chemistry. Os resultados foram expressos em unidades por litro (U/L) Mediadores inflamatórios Nas amostras de sangue coletadas foram dosados os seguintes mediadores inflamatórios: Interleucina-6 (IL-6) e Interleucina-10 (IL-10) no período de 12 horas após a reperfusão. Cada amostra coletada foi centrifugada por 10 minutos a 0 C e o sobrenadante estocado a -20 C. A quantificação dos mediadores inflamatórios foi realizada por enzimoimunoensaio (ELISA) através da utilização dos kits da Biosource International Cytoscreen e, os resultados expressos em pg/ml.

36 Métodos Extração do azul de Evans Uma vez que o corante azul de Evans se liga principalmente à albumina, a permeabilidade vascular pulmonar foi avaliada pela quantificação do corante extraído. A dosagem avalia o aumento da atividade inflamatória e aumento da permeabilidade capilar com extravazamento de macromoléculas. Um fragmento do pulmão de cada animal foi utilizado para extração do azul de Evans no período de quatro e 12 horas após a reperfusão. O corante foi extraído pela incubação dos fragmentos em tubos de ensaio com formamida (formamide, BDH Labs, England) na dose de 4 g/mg de tecido, por 24 horas, em temperatura ambiente. A quantidade de corante extraído do tecido foi determinada pelo espectrofotômetro com comprimento de onda de 620nm (ELX 808 Ultra Microplate Reader, Bio-Tek Instruments, Inc, USA). Os resultados expressos em microgramas de azul de Evans por grama de tecido seco Atividade da mieloperoxidase pulmonar A atividade da mieloperoxidase pulmonar (MPO) foi utilizada como indicador da presença de neutrófilos seqüestrados no pulmão e avaliada no período de quatro e 12 horas após a reperfusão. As amostras foram homogeinizadas com homogeinizador Polytron, usando tampão PBS contendo 0,5% de hexadecil e 5mM EDTA, ph 6,0. As amostras homogeinizadas foram submetidas ao ultrassom (40Hz) e, posteriormente,

37 Métodos 22 centrifugadas a 3000g por minuto. A atividade da MPO no sobrenadante foi quantificada através da densidade óptica (DO) a 490nm resultante da decomposição de H2O2 na presença de O-dianisina. Os resultados foram expressos em DO a 490nm Respiração mitocondrial hepática A função mitocondrial hepática foi estudada nos lobos hepáticos isquêmicos e não isquêmicos dos animais 4 horas após a reperfusão e imediatamente após estes terem sido retirados e imersos em solução de homogeinização. O consumo de oxigênio pelas mitocôndrias foi determinado polarograficamente, usando um oxígrafo 5/6 H (Gilson Medical Eletronics, Inc) com eletrodo de O2 (Clarck, Yellow Springs Instruments Co., Yellow Springs, Ohio) a 28 C. Para a determinação do estado 4 (S4) da respiração (estado basal), as mitocôndrias receberam succinato de potássio como substrato energético. O estado 3 (S3) da respiração (estado ativado) foi induzido pela adição de adenosina difosfato (ADP, Sigma Chemical Company, St Louis, Missouri). Após todo o ADP ter sido fosforilado para ATP, S4 foi medido novamente. A razão do controle respiratório (RCR relação entre a velocidade de consumo de oxigênio na presença de ADP (S3) e a velocidade obtida após o gasto final de ADP(S4) e a relação de ADP/consumo de oxigênio (ADP/O) foram calculadas como índices das funções oxidativas e

38 Métodos 23 foforilativas das mitocôndrias. Os estados S3 e S4 foram expressos em nanogramas (ng) de átomos de oxigênio por miligrama de proteína mitocondrial por minuto Peroxidação lipídica A quantificação da peroxidação lipídica no tecido hepático isquêmico e não-isquêmico foi realizada através da determinação da concentração de malondialdeído (MDA) por meio de dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). As amostras foram homogeneizadas em KCL, centrifugadas e, no sobrenadante, foi adicionada uma solução contendo o ácido tiobarbitúrico, duodecilsulfato de sódio, ácido acético glacial e água destilada. A mistura foi aquecida a 90 C por 45 minutos. Após resfriamento em temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas (15.000rpm, 10 min). As concentrações dos produtos da peroxidação lipídica foram expressas pelo TBARS. Os resultados foram expressos em nmol/tbar/mq proteína Histologia Os fragmentos do tecido hepático isquêmico e não isquêmico, fixados em solução de formol a 10% e corados com hematoxilina e eosina foram submetidos à análise histológica por microscopia óptica por um único patologista sem conhecimento dos grupos estudados. Foram analisados os seguintes parâmetros nos período de quatro, 12 e 24 horas pós-reperfusão:

39 Métodos 24 1) tumefação hepatocelular, avaliada como alargamento e clareamento citoplasmático; 2) destrabeculação, definida como destruição do arcabouço hepatocitário; 3) esteatose hepática, revelando a presença de gotículas claras e bem delimitadas no hepatócito; 4) necrose hepática; 5) inflamação lobular com visualização de necrose focal permeadas por células inflamatórias; 6) inflamação portal, definida pelo aumento da população de células inflamatórias no espaço porta; 7) presença de células de Kupffer. As variáveis receberam um escore de zero a três, sendo zero a ausência de lesão, 1 a presença discreta e focal, 2 presença moderada e 3 a presença intensa de lesão visível à microscopia. Para a pontuação global de cada amostra, foi utilizada a somatória dos pontos de cada variável, e, deste modo analisada a intensidade da lesão de isquemia-reperfusão. A necrose ganhou peso três e, as demais variáveis peso um (Quadro 1). Quadro 1. Graduação histológica da lesão de isquemia/reperfusão hepática. Tumefação Destrabeculação Esteatose Necrose Inflamação lobular Inflamação portal Kupffer Ausente x Leve x Moderada x Grave x

40 Métodos Análise Estatística Os dados anotados foram transferidos para um banco eletrônico do Microsoft Excel sendo submetidos à análise estatística pelo Graph Pad Prism versão 6.0, sendo o nível de significância adotado de 5% em todos os testes. A análise descritiva do estudo foi preparada sob a forma de gráficos representada pelas Figuras 4-26 e os dados estão dispostos nos anexos A- W. Os resultados das dosagens das transaminases hepáticas (AST e ALT), do consumo de oxigênio pela mitocôndria, do corante azul de Evans, da atividade da mieloperoxidase pulmonar, dos mediadores inflamatórios (IL-6 e IL-10) e do malondiadeído, considerados variáveis paramétricas, foram analisados pelo teste t de Student. Os resultados não paramétricos da avaliação histológica dos tecidos hepáticos foram analisados pelo teste de Mann Whitney.

41 4. RESULTADOS

42 Resultados Análise das dosagens de transaminases: AST e ALT AST Os níveis séricos de AST foram significantemente maiores no GC do que nos demais grupos no período de 4 horas. Os animais que receberam SSH isolada ou em associação com pentoxifilina apresentaram níveis significantemente menores de AST quando comparados com animais que receberam SSF. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos que receberam SSH e SSH associada a pentoxifilina (Figura 4). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes nos níveis séricos de AST entre o GC e os demais estudados no período de 12 horas. Os animais que receberam SSH isolada ou em associação com pentoxifilina apresentaram níveis significantemente menores de AST quando comparados com animais que receberam SSF. Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis de AST entre os grupos que receberam SSH e os que receberam HPTX neste período (Figura 5).

43 Resultados 28 AST- 4horas N=7 * Δ Δ * * N=13 N=13 N=13 GC SSF SSH HPTX Figura 4. Valores médios ± DP das dosagens séricas de AST no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF. Teste t de Student. GCxSSF: P=0,002 GC x SSH: P=0,0007 GC x HPTX: P=0,0007 SSF x SSH: P=0,047 SSF X HPTX: P=0,041 SSH X HPTX: P=0,36 AST-12horas Δ Δ N=14 N=18 N=18 N=18 GC SSF SSH HPTX Figura 5. Valores médios ± DP das dosagens séricas de AST no período de 12 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): Δ em relação à SSF. Teste t de Student GC x SSF: P=0,45 GC x SSH: P=0,12 GC x HPTX: P=0,22 SSF x SSH: P=0,0002 SSF X HPTX: P=0,009 SSH X HPTX: P=0,093

44 Resultados 29 ALT Os níveis séricos de ALT foram significantemente maiores no GC do que nos demais grupos no período de 4 horas. Os animais que receberam SSH isolada ou em associação com pentoxifilina apresentaram níveis significantemente menores de ALT quando comparados com o grupo SSF. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos nos quais foram administradas SSH e HPTX (Figura 6). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os níveis séricos de ALT dos animais que não receberam tratamento e os demais grupos no período de 12 horas. Não houve diferença estatisticamente significante quando comparado o grupo que recebeu SSF e o os grupos com SSH com ou sem pentoxifilina. Também não houve diferença estatística quando comparado o grupo que recebeu SSH e o grupo no qual foi adicionado pentoxifilina a SSH (Figura 7).

45 Resultados 30 ALT- 4horas N=7 * Δ Δ * * N=13 N=13 N=13 Figura 6. Valores médios ± DP das dosagens séricas de ALT no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF. Teste t de Student GC SSF SSH HPTX GC x SSF: P=0,02 GC x SSH: P=0,002 GC x HPTX: P=0,002 SSF x SSH: P=0,013 SSF X HPTX: P=0, 019 SSH X HPTX: P=0,48 ALT- 12 horas N=14 N=18 N=18 N=18 GC SSF SSH HPTX Figura 7. Valores médios ± DP das dosagens séricas de ALT no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Teste t de Student GC x SSF: P=0,28 GC x SSH: P=0,36 GC x HPTX: P=0,29 SSF x SSH: P=0,16 SSF X HPTX: P=0,12 SSH X HPTX: P=0,41

46 Resultados Análise dos mediadores inflamatórios: IL-6 e IL-10 IL-6 Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis séricos de interleucina 6 no período de 12 horas entre o grupo controle e o grupo que recebeu SSF. Entretanto, quando se compara o grupo controle com os grupos nos quais foram administradas SSH isolada ou em associação com pentoxifilina, os níveis de Interleucina-6 foram significantemente maiores no grupo sem tratamento. Os níveis de interleucina 6 também foram significantemente maiores nos ratos que receberam SSF se comparados às SSH e HPTX. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos SSH e HPTX (Figura 8). IL-10 Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis séricos de interleucina-10 no período de 12 horas entre os grupos sem tratamento e os demais grupos. Não houve diferença estatisticamente significante quando comparado o grupo que recebeu SSF e o os grupos que receberam SSH com ou sem pentoxifilina. Não houve diferença estatisticamente significante quando comparado o grupo que recebeu SSH e o grupo em que foi adicionado pentoxifilina (Figura 9).

47 Resultados 32 Interleucina-6 12 horas Δ N=6 N=10 Δ * N=10 * N=10 GC SSF SSH HPTX Figura 8. Valores médios ± DP das dosagens séricas de interleucina-6 no período de 12 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF. Teste t de Student GC x SSF: P=0,21 GC x SSH: P=0,0001 GC x HPTX: P=0,0005 SSF x SSH: P=0,004 SSF X HPTX: P=0,017 SSH x HPTX: P=0, 1 Interleucina horas N=6 N=10 N=10 N=10 GC SSF SSH HPTX Figura 9. Valores médios ± DP das dosagens séricas de interleucina-10 no período de 12 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Teste t de Student GC x SSF: P=0,27 GC x SSH: P=0,29 GC x HPTX: P=0,46 SSF x SSH: P=0,45 SSF X HPTX: P=0,30 SSH X HPTX: P=0,32

48 Resultados Análise da extração do azul de Evans pulmonar Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis do azul de Evans extraído do tecido pulmonar dos animais do grupo controle e SSF no período de 4 horas. Entretanto, quando estes dois grupos são comparados aos grupos SSH e HPTX, estes últimos apresentaram resultados significantemente menores, expressando menor permeabilidade pulmonar. Apesar de não exibir resultados estatisticamente significantes, os pulmões dos ratos que receberam HPTX revelaram menor extração do corante quando comparados àqueles que receberam SSH (Figura 10). Os níveis do azul de Evans no período de 12 horas foram significantemente menores no grupo HPTX quando comparados aos dos grupos controle, SSFe SSH. Não se observaram diferenças estatisticamente significantes entre os grupos que receberam SSH e SSF. Foi observada diferença estatísticamente significante entre o grupo controle e SSF que exibiu níveis significantemente menores (Figura 11).

49 mg de azul de Evans/g de tecido mg de azul de Evans/g de tecido Resultados 34 Azul de Evans 4 horas N=6 N=10 Δ * N=10 Δ * N=10 GC SSF SSH HPTX Figura 10. Valores médios ± DP das dosagens dos níveis de azul de Evans no pulmão no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF. Teste t de Student GC x SSF: P=0,41 GC x SSH: P=0,022 GC x HPTX: P=0,002 SSF x SSH: P=0,024 SSF X HPTX: P=0,002 SSH X HPTX: P=0,06 Azul de Evans 12 horas Ϯ N=9 * Δ * N=9 N=9 N=9 Figura 11. Valores médios ± DP das dosagens dos níveis de azul de Evans no pulmão no período de 12 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF; Ϯ em relação à SSH. Teste t de Student GC SSF SSH HPTX GC x SSF: P=0,044 GC x SSH: P=0,086 GC x HPTX: P=0,008 SSF x SSH: P=0,28 SSF X HPTX: P=0,026 SSH X HPTX: P=0,019

50 Resultados Análise da atividade da mieloperoxidase pulmonar Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis de mieloperoxidase pulmonar no período de 4 horas entre os grupos GC e SSF. Entretanto, quando se compara o grupo controle com os grupos que foram administrados SSH isolada ou em associação com pentoxifilina, os níveis de mieloperoxidase pulmonar foram significantemente maiores no GC. Não houve diferença estatística entre os demais grupos estudados (Figura 12). Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis de mieloperoxidase pulmonar no período de 12 horas entre o grupo controle e o grupo SSF. Quando se compara o grupo controle com os grupos nos quais foram administradas SSH isolada ou em associação com pentoxifilina, os níveis de mieloperoxidase pulmonar foram significantemente maiores no grupo sem tratamento. Não houve diferença estatisticamente significante quando comparado o grupo que recebeu SSH e o grupo em que foi adicionada a pentoxifilina, que por sua vez não apresentaram diferença estatisticamente significante quando comparados ao SSF (Figura 13).

51 DO a 490 nm DO a 490 nm Resultados 36 mieloperoxidase pulmonar 4 horas * * N=6 N=9 N=9 N=9 Figura 12. Valores médios ± DP das dosagens dos níveis mieloperoxidase pulmonar no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC. Teste t de Student GC SSF SSH HPTX GC x SSF: P=0,34 GC x SSH: P=0,008 GC x HPTX: P=0,026 SSF x SSH: P=0,083 SSF X HPTX: P=0,16 SSH X HPTX: P=0,26 mieloperoxidase pulmonar 12 horas * * N=9 N=9 N=9 N=9 GC SSF SSH HPTX Figura 13. Valores médios ± DP das dosagens dos níveis mieloperoxidase pulmonar no período de 12 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC. Teste t de Student GC x SSF: P=0,2 GC x SSH: P=0,036 GC x HPTX: P=0,015 SSF x SSH: P=0,2 SSF X HPTX: P=0,1 SSH X HPTX: P=0,16

52 Resultados Análise da respiração mitocondrial hepática Foram avaliados os estados 3 (S3) e 4 (S4), além da razão do controle respiratório (RCR) e ADP/consumo de oxigênio (ADP/O) nos lobos hepáticos isquêmicos e não-isquêmicos no período de 4 horas após a reperfusão. S3 Não houve diferença estatisticamente significante na avaliação do estado S3 da respiração mitocondrial no período de 4 horas entre os grupos controle e SSF. Quando comparados com os grupos nos quais foram administradas SSH isolada ou em associação com pentoxifilina, o grupo sem tratamento e o grupo com SSF demonstraram resultados significantemente menores expressando piora da função mitocondrial. Não houve diferença estatisticamente significante quando comparados o grupo que recebeu SSH e o grupo HPTX (Figura 14). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes nos resultados da avaliação do estado 3 da respiração mitocondrial no lobo nãoisquêmico no período de 4 horas entre os grupos estudados (Figura 15).

53 ng de O2/mg de proteína.min ng de O2/mg de proteína.min Resultados 38 Respiração mitocondrial S3 isquêmico 4 horas Δ * Δ * N=6 N=6 N=6 N=6 GC SSF SSH HPTX Figura 14. Valores médios ± DP da avaliação do estado 3 da respiração mitocondrial do lobo isquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF. Teste t de Student GC x SSF: P=0,27 GC x SSH: P=0,014 GC x HPTX: P=0,02 SSF x SSH: P=0,01 SSF X HPTX: P=0,003 SSH X HPTX: P=0,31 Respiração mitocondrial S3 não-isquêmico 4 horas N=6 N=6 N=6 N=6 GC SSF SSH HPTX Figura 15. Valores médios ± DP da avaliação do estado 3 da respiração mitocondrial do lobo nãoisquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX:solução salina hipertônica e pentoxifilina. Teste t de Student GC x SSF: P=0,15 GC x SSH: P=0,28 GC x HPTX: P=0,38 SSF x SSH: P=0,30 SSF X HPTX: P=0,16 SSH X HPTX: P=0,34

54 Resultados 39 S4 Não houve diferença estatisticamente significante na avaliação do S4 da respiração mitocondrial no lobo isquêmico no período de 4 horas entre os grupos controle e SSF. Quando comparados com o grupo controle, os grupos nos quais foram administradas SSH isolada ou em associação com pentoxifilina apresentaram resultados significantemente maiores. Não houve diferença estatisticamente significante quando comparados os grupo que receberam SSH, HPTX ou SSF (Figura 16). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes nos resultados da respiração mitocondrial no estado S4 no lobo não-isquêmico no período de 4 horas entre os grupos estudados (Figura 17).

55 ng de O2/mg de proteína.min ng de O2/mg de proteína.min Resultados 40 Respiração mitocondrial S4 isquêmico 4 horas * * N=6 N=6 N=6 N=6 GC SSF SSH HPTX Figura 16. Valores médios ± DP da avaliação do estado 4 da respiração mitocondrial do lobo isquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC Teste t de Student GC x SSF: P=0,10 GC x SSH: P=0,05 GC x HPTX: P=0,03 SSF x SSH: P=0,18 SSF X HPTX: P=0,10 SSH X HPTX: P=0,42 Respiração mitocondrial S4 não-isquêmico 4 horas N=6 N=6 N=6 N=6 GC SSF SSH HPTX Figura 17. Valores médios ± DP da avaliação do estado 4 da respiração mitocondrial do lobo nãoisquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Teste t de Student GC x SSF: P=0,17 GC x SSH: P=0,43 GC x HPTX: P=0,46 SSF x SSH: P=0,12 SSF X HPTX: P=0,12 SSH X HPTX: P=0,46

56 Resultados 41 RCR Não houve diferença estatisticamente significante na avaliação da razão do controle respiratório da respiração mitocondrial no período de 4 horas entre os grupos controle e SSF. Quando comparados os grupos nos quais foram administradas solução SSH isolada ou em associação com pentoxifilina, estes expressaram resultados significantemente maiores quando comparados aos grupos controle e SSF. Não houve diferença estatisticamente significante quando comparado o grupo que recebeu SSH com o grupo no qual foi adicionada pentoxifilina (Figura 18). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes nos resultados da razão do controle respiratório da respiração mitocondrial do lobo não-isquêmico no período de 4 horas entre os grupos estudados (Figura 19).

57 Resultados 42 Respiração mitocondrial RCR isquêmico 4 horas Δ * Δ * N=6 N=6 N=6 N=6 GC SSF SSH HPTX Figura 18. Valores médios ± DP da avaliação da razão do controle respiratório da respiração mitocondrial do lobo isquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF. Teste t de Student GC x SSF: P=0,38 GC x SSH: P=0,013 GC x HPTX: P=0,031 SSF x SSH: P=0,0008 SSF X HPTX: P=0,0003 SSH X HPTX: P=0,14 Respiração mitocondrial RCR não-isquêmico 4 horas N=6 N=6 N=6 N=6 GC Figura 19. Valores médios ± DP da avaliação da razão do controle respiratório da respiração mitocondrial do lobo não- isquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Teste t de Student SSF SSH HPTX GC x SSF: P=0,45 GC x SSH: P=0,11 GC x HPTX: P=0,23 SSF x SSH: P=0,069 SSF X HPTX: P=0,15 SSH X HPTX: P=0,28

58 Resultados 43 ADP/O Não houve diferença estatisticamente significante na avaliação da relação ADP/O no período de 4 horas entre os grupos controle e SSF. Quando comparados os grupos nos quais foram administradas SSH isolada ou em associação com pentoxifilina, estes expressaram resultados significantemente maiores quando comparados aos grupos controle e SSF. Não houve diferença estatisticamente significante quando comparados os dois grupos que receberam SSH associada ou não a pentoxifilina (Figura 20). Com relação aos lobos não-isquêmicos, não houve diferença estatisticamente significante na avaliação da ADP/O da respiração mitocondrial no período de 4 horas entre os grupos controle e SSF. Quando comparados os grupos nos quais foram administradas SSH isolada ou em associação com pentoxifilina, estes apresentaram resultados significantemente maiores quando comparados aos grupos controle e SSF. Não houve diferença estatística quando comparado o grupo SSH e o grupo HPTX (Figura 21).

59 ADP/O ADP/O Resultados 44 Respiração mitocondrial ADP/O isquêmico 4 horas Δ * Δ * N=6 N=6 N=6 N=6 GC SSF SSH HPTX Figura 20. Valores médios ± DP da avaliação da ADP/O da respiração mitocondrial do lobo isquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF. Teste t de Student GC x SSF: P=0,19 GC x SSH: P=0,019 GC x HPTX: P=0,019 SSF x SSH: P<0,0001 SSF X HPTX: P=0,0002 SSH X HPTX: P=0,45 Respiração mitocondrial ADP/O não-isquêmico 4 horas Δ Δ * * N=6 N=6 N=6 N=6 GC SSF SSH HPTX Figura 21. Valores médios ± DP da avaliação da ADP/O da respiração mitocondrial do lobo nãoisquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF. Teste t de Student GCxSSF: P=0,15 GC x SSH: P=0,0002 GC x HPTX: P=0,005 SSF x SSH: P<0,0001 SSF X HPTX: P=0,004 SSH X HPTX: P=0,10

60 Resultados Análise da dosagem tecidual de malondialdeído (TBARS) Houve diferença estatisticamente significante na avaliação da dosagem tecidual do TBARS no lobo isquêmico no período de 4 horas entre o grupo HPTX, que apresentou níveis menores e os demais grupos. Quando os outros grupos foram comparados entre si, não se observou diferenças estatisticamente significantes (Figura 22). Com relação ao lobo não-isquêmico, o grupo controle apresentou níveis significantemente maiores que os demais grupos. O grupo em que se associou a pentoxifilina apresentou níveis significantemente menores que os outros grupos. Não houve diferença estatisticamente significante entre os animais que receberam SSF e SSH (Figura 23).

61 TBARS (nmol/mg proteína) TBARS (nmol/mg proteína) Resultados 46 Dosagem de TBARS isquêmico 4 horas Ϯ N=6 N=8 N=8 Δ * N=8 GC SSF SSH HPTX Figura 22. Valores médios ± DP da avaliação da dosagem de TBARS do lobo isquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF; Ϯ em relação à SSH. Teste t de Student GC x SSF: P=0,26 GC x SSH: P=0,39 GC x HPTX: P=0,003 SSF x SSH: P=0,13 SSF X HPTX: P=0,049 SSH X HPTX: P<0,0001 Dosagem de TBARS não-isquêmico 4 horas * * N=6 N=8 N=8 Ϯ Δ * N=8 GC SSF SSH HPTX Figura 23. Valores médios ± DP da avaliação da dosagem de TBARS do lobo não- isquêmico no período de 4 horas. GC: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF; Ϯ em relação à SSH. Teste t de Student GC x SSF: P=0,047 GC x SSH: P=0,016 GC x HPTX: P<0,0001 SSF x SSH: P=0,25 SSF X HPTX: P=0,022 SSH X HPTX: P<0,0001

62 Resultados Histologia No período de quatro horas, o grupo controle apresentou escore significantemente maior que os grupos que receberam tratamento com SSH e HPTX. O grupo que recebeu SSH isolada apresentou escore significantemente menor que o grupo que recebeu SSF. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos que receberam SSH associadas ou não à pentoxifilina (Figura 24). Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos estudados no período de 12 e 24 horas após a reperfusão (Figuras 25 e 26). Não se observaram diferenças estatisticamente significantes nos períodos estudados dos lobos não-isquêmicos (escore 0).

63 escore escore Resultados 48 Histologia 4 horas N=6 Δ * * N=8 N=8 N=8 GC SSF SSH HPTX Figura 24. Valores médios ± DP do escore da avaliação histológica do lobo isquêmico no período de 4 horas. CG: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Diferença estatisticamente significante (p<0, 005): * em relação ao GC; Δ em relação à SSF. Teste de Mann Whitney GC x SSF: P=0,053 GC x SSH: P=0,004 GC x HPTX: P=0,02 SSF x SSH: P=0,01 SSF X HPTX: P=0,11 SSH X HPTX: P=0,08 Histologia 12 horas N=6 N=8 N=8 N=8 Figura 25. Valores médios ± DP do escore da avaliação histológica do lobo isquêmico no período de 12 horas. CG: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Teste de Mann Whitney GC SSF SSH HPTX GC x SSF: P=0,28 GC x SSH: P=0,33 GC x HPTX: P=0,24 SSF x SSH: P=0,32 SSF X HPTX: P=0,36 SSH X HPTX: P=0,16

64 escore Resultados 49 Histologia 24 horas N=6 N=6 N=6 N=6 GC SSF SSH HPTX Figura 26. Valores médios ± DP do escore da avaliação histológica do lobo isquêmico no período de 24 horas. CG: grupo controle; SSF: solução salina fisiológica; SSH: solução salina hipertônica; HPTX: solução salina hipertônica e pentoxifilina. Teste de Mann Whitney GC x SSF: P=0,28 GC x SSH: P=0,39 GC x HPTX: P=0,28 SSF x SSH: P=0,32 SSF X HPTX: P=0,13 SSH X HPTX: P=0,17 Os grupos SSH e HPTX apresentaram menor evidência de lesão histológica quando comparados ao grupo controle no período de 4 horas (Figuras 27 e 28).

65 Resultados 50 Figura 27. Micrografia de fígado normal em rato submetido à isquemia-reperfusão hepática e tratado com solução salina hipertônica associada a pentoxifilina no período de 4 horas após a reperfusão (H&E 40X). Figura 28. Micrografia de fígado de rato submetido à isquemia-reperfusão hepática sem tratamento no período de 4 horas após a reperfusão (H&E 40X).