DETECÇÃO DO VÍRUS DA CINOMOSE EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS NO MATO GROSSO

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1 10 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DETECÇÃO DO VÍRUS DA CINOMOSE EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS NO MATO GROSSO Leticya Lerner Lopes Cuiabá - MT 2014

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3 12 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DETECÇÃO DO VÍRUS DA CINOMOSE EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS NO MATO GROSSO Autor: Leticya Lerner Lopes Orientadora: Profª. Dr ª. Caroline Argenta Pescador Co-Orientador: Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Área de concentração: Sanidade de animais domésticos e silvestres, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso para obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Cuiabá - MT 2014

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5 14 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por me dar saúde todos os dias e me permitir buscar os meus sonhos! Agradeço aos meus pais pelo amor e educação! Agradeço aos meus irmãos pela paciência e companheirismo. Agradeço a profª Caroline pela oportunidade e confiança. Agradeço aos amigos do Laboratório de Patologia Veterinária e Laboratório de Virologia pela cooperação e paciência. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado.

6 15 EPÍGRAFE Disfarce o medo que lhe esconde o sorriso e deixe-o dormir sob as sombras que lhe perturbam. Ah! O medo de novo! Esse infeliz escudeiro é um mero aprendiz dos teus lábios, deixe-os percorrerem o desconhecido, esse amálgama que ladrilha o caminho, a estrada que personifica o medo, mas que nutre de sopro a vida e a faz incendiária!!! Marcos de Almeida Souza

7 16 RESUMO O vírus da cinomose canina (VCC) é um vírus RNA, que pertence ao gênero Morbillivírus e família Paramyxoviridae. A capacidade de resposta imune, assim como sua virulência são fatores críticos para a invasão viral dos tecidos epiteliais e do sistema nervoso central (SNC). O VCC é o maior responsável pelas encefalites em cães, acometendo diversas idades. O objetivo desse estudo foi detectar o VCC nos cães com sinais neurológicos encaminhados para necropsia no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). Durante um período de um ano, 85% (68/80) dos cães necropsiados tinham lesões microscópicas compatíveis com encefalomielite causada pelo VCC. Desses, 67.6% (46/68) foram confirmadas positivas através da imuno-histoquímica (IHQ). Microscopicamente, as lesões do SNC foram classificadas em encefalite desmielinizante aguda em 15.2% (7/46) dos cães, em subaguda em 73.9% (34/46) e crônica em 10.8% (5/46) dos cães. O cerebelo foi principal órgão a apresentar marcação positiva na IHQ (97.8%). O VCC é responsável pelos sinais neurológicos em cães principalmente abaixo de um ano de idade. A cinomose demonstrou sua relevância dentro da população canina de Cuiabá, sendo necessário ao nosso entendimento, caracterizar a estirpe viral relacionada à região. Palavras-chave: vírus da cinomose canina, gene H, imuno-histoquímica, sinais neurológicos, Brasil.

8 17 ABSTRACT Canine distemper virus (CDV) is a RNA virus classified under the genus Morbillivirus within the family of Paramyxoviridae. The time of onset of the immune response and, likely, also the virulence of the virus are critical factors in the extent of viral invasion of epithelial tissues and of the central nervous system. The CDV is the most responsible of encephalitis in dogs from different ages. In this study, the aim was to detected CDV in dogs with neurologicals signs referred for necropsy at the Laboratory of Veterinary Pathology, Federal University of Mato Grosso (LPV- UFMT).Over a period of 1 year, 85% (68/80) of the dogs necropsied had microscopic lesions compatible encephalomyelitis by CDV. Which 67.6% (46/68) were confirmed by immunohistochemistry (IHC). Microscopically, the CNS lesions were classified demyelinating encephalitis in 15.2% (7/46) to acute, 73.9% (34/46) in subacute and 10.8% (5/46) to chronic. The cerebellum (97.8%) was the main target organ to verify positivity in the IHC. Canine distemper virus is a pathogen responsible for neurological clinical signs in dogs mainly under one year of age. Distemper demonstrated its relevance within the canine population of Cuiabá, being necessary to our understanding, characterizing the viral strain related to the region. Keywords: Canine distemper virus, hemagglutinin (H) gen, immunohistochemistry, neurologic signs, Brazil.

9 18 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 10 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Vírus da Cinomose Canina Histórico Etiologia e Morfologia Epidemiologia Patogênese Imunologia Sinais Clínicos Patologia Achados Macroscópicos Achados Microscópicos Técnicas de Diagnóstico Exame Hematológico Swab ocular Sorologia - ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent 23 Assay) Detecção Molecular Imuno-Histoquímica Cinomose nas Demais Espécies Animais 25 3 MATERIAL E MÉTODOS Animais do Estudo Necropsia Histopatologia Imuno-Histoquímica Transcriptase Reversa - Reação de Cadeia Em Polimerase Extração de RNA RT-PCR Gene N Touchdown PCR Gene H 28 4 RESULTADOS Cães Achados Patológicos e Imuno-Histoquímicos 31

10 Análise Molecular Outras Causas 35 5 DISCUSSÃO 35 6 CONCLUSÃO 36 7 REFERÊNCIAS 37 Anexo I Ficha clínica de cães com cinomose 48 Apêndice A - Manuscrito submetido ao periódico Pesquisa Veterinária Brasileira 49

11 10 1 INTRODUÇÃO A cinomose é uma doença infecciosa pantrópica causada pelo vírus da cinomose canina (VCC) (KOUTINAS et al., 2002). O vírus é frequentemente letal em cães e carnívoros (SUMMERS e APPEL, 1994) sendo as principais lesões observadas no sistema respiratório, gastrointestinal e sistema nervoso central (SNC). O vírus pode infectar animais de diversas idades, mas os filhotes são os mais acometidos devido à perda dos anticorpos maternos, a não utilização de vacinas e a falha vacinal (APPEL e SUMMERS, 1995; CHAPPUIS, 1995). No Brasil a cinomose representa até 6% de todas as ocorrências atendidas em clínicas veterinárias sendo responsável por até 11% das mortes de cães (HEADLEY e GRAÇA, 2000). Em um levantamento na Mesorregião do Estado do Rio Grande do Sul a cinomose foi considerada a maior causadora de óbitos em cães com uma prevalência de 12,4%, perdendo dentro da categoria filhotes, apenas para a parvovirose canina. (FIGHERA et al., 2008). Segundo HEADLEY et al., (2012) os custos financeiros de cães com sinais clínicos do VCC, podem variar de R$ 258,3 milhões/ano a R$ 280,5 milhões/ano, demonstrando que a cinomose é uma doença de alto impacto econômico nas clínicas de pequenos animais no Brasil. O vírus da cinomose tem predileção pelos tecidos epiteliais, linfóides e tecido nervoso, a sua patogenicidade irá variar de acordo com a diversidade dos biotipos, apesar de ser conhecido, até o momento, um único sorotipo (ALVES et al., 2006). O diagnóstico post-mortem é realizado através da histopatologia principalmente com a visualização do corpúsculo de inclusão eosinofílico intracitoplasmático e intranuclear localizados em células epiteliais, linfóides e no SNC (APPEL e SUMMERS, 1999). Técnicas como reação de polimerase em cadeia (PCR) e imuno-histoquímica são utilizadas em casos que não são visualizados os corpúsculos de inclusão no exame histopatológico, mas que lesões microscópicas compatíveis são visualizadas (FRISK et al., 1999; SONNE et al., 2009). Dentro deste contexto, as doenças virais exercem grande importância dentre os diagnósticos de cães necropsiados no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). O presente trabalho teve por objetivo analisar os achados patológicos, imuno-histoquímicos e moleculares de cães portadores de quadros neurológicos e apresentação clínica sugestiva de

12 11 cinomosenecropsiados no LPV dentro do período de fevereiro de 2012 a fevereiro de 2013.

13 12 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Vírus da Cinomose Canina Histórico A cinomose foi descrita pela primeira vez em 1746, no Peru como uma doença altamente contagiosa nos cães (HOWELL, 1965). Em 1905 CARRÉ propõe (1905 apud APPEL e SUMMERS, 1995) a etiologia viral do agente que causava a cinomose. Em 1926, um estudo experimental realizado por Laidlaw e Dunkin com furões comprovou a etiologia da doença (GLEDHILL, 1953; 1962 apud KRAKOWKA et al., 1980). Em 1969, foi identificado o primeiro caso natural da doença em furões (Mustela putorius), sendo considerado o modelo experimental para estudos sobre o vírus da cinomose canina (APPEL, 1969). Embora o cão doméstico seja considerado o reservatório do vírus (ANDERSON, 1995; APPEL e SUMMERS, 1995; DOMINGO et al., 1995), vários animais selvagens já foram infectados pelo VCC, como por exemplo, as espécies da família Canidae, Mustelidae, Procionidae, Ailuridae, Viveridae, Hyaenidae, Protelidae Ursidae, Tayassuidae, Felidae, além de mamíferos marinhos de várias famílias (baleias, golfinhos, botos, leões marinhos e focas). Na tabela 1 encontra-se os principais eventos históricos do vírus da cinomose.

14 13 Tabela 1. Eventos históricos sobre o estudo do vírus da cinomose. ANO CONTRIBUIÇÃO REFERÊNCIA 1746 Descoberta uma doença altamente contagiosa em cães HOWELL, 1965; A doença se dissemina para Europa e Estados Unidos BLANCOU, A cinomose é identificada como uma doença que infecta cães de todas as raças e idades no Reino Unido 1890 Mais de 90% dos cães britânicos morrem com secreção óculo nasal, diarreia, anorexia e febre McBRIDGE, 1870 MILLAIS, Etiologia viral é proposta por Henri Carré APPEL, 1987; MACLACHLAN e DUBOVI, Teoria viral contestada devido à presença da bactéria Haemophilus bronchisepticus nos pulmões dos cães necropsiados 1908 Primeira descrição clássica dos sinais clínicos da doença - Edward Jenner em 1908 GLEDHILL, 1953 APPEL, 1987; MACLACHLAN e DUBOVI, Estudo experimental com furões, com ausência de alterações neurológicas GLEDHILL, Surto de encefalite em cães HOWELL, Forma epitelial é descrita por Rubarth in 1947 GLEDHILL, Holmes sugere que o VCC entre no grupo do vírus da Influenza devido à sintomatologia respiratória 1956 A partir de um embrião de frango foi desenvolvida primeira vacina viva modificada contra VCC em Onderstepoort, África do Sul 1959 Vacina viva atenuada desenvolvida através da cultura celular de um cão do primeiro relato de VCC na Suécia 1962 Formação da família Paramyxoviridae com os componentes: VCC, Measle vírus e Vírus da Peste Bovina Diferentes espécies da Ordem Carnívora são consideradas susceptíveis ao virus Mortalidade de grandes felinos (leões, tigres e leopardos) pelo VCC na 1992 América do Norte 1999 Primeiro relato de VCC em animais selvagens (Furão Grande e Lobo Guará) no estado de SP- Brasil HOLMES, 1948 HAIG, 1956 ROCKBORN, 1959 ANDREWES, 1962 MONTALI et al., 1987 APPEL et al., 1994 REGO et al., Detecção do RNA viral através da RT-PCR através nucleoproteína (N) FRISK et al., Análise parcial da sequência de nucleotídeos do gene N para conhecimento das estirpes circulantes no Brasil CASTILHO et al., Inclusão de uma nova estirpe viral África WOMA et al., Classificação gene H em subgenotipos BUDASZEWSKIA et al., Primeira infecção em um urso COTTRELL et al., 2013

15 Etiologia e Morfologia O VCC canina pertence à família Paramyxoviridae, gênero Morbillivirus, sendo antigenicamente relacionado ao vírus do sarampo (ÖRVELL e NORRBY, 1980; SUMMERS e APPEL, 1994; MACLACHLAN e DUBOVI, 2011), da peste dos pequenos ruminantes, da peste bovina (GREENE e APPEL, 2006; ARNS et al., 2007), da cinomose dos golfinhos, da cinomose das focas e da cinomose dos botos (GREENE e APPEL, 2006; BEINEKE et al., 2009). O genoma do VCC consiste de uma fita de RNA com polaridade negativa, não segmentada de a pares de base (pb) de extensão e seis sequências abertas de leitura (open reading frame ORF) (DIALLO, 1990). A organização genômica, a partir da extremidade 3, é constituída pelos genes das proteínas: nucleoproteína (N), atualmente chamada de proteína de ligação do RNA (RNA binding protein), fosfoproteína (P), proteína da matriz (M), proteína de fusão (F), hemaglutinina (H) e a grande proteína (Large L) (Figura 1) (MACLACHLAN e DUBOVI, 2011). Todos os genes são intercalados por regiões não-codificadoras (CURRAN et al., 1992). As três proteínas internas são as proteínas L, N e P e as inseridas no envelope são a H e F, a proteína M é a única inserida entre o envelope viral e o nucleocapsídeo (BARRETT, 1999; ZEE e MACLACHLAN, 2004). Fig. 1. Estrutura viral do gênero Morbillivirus. Fonte: Viral Zone, As proteínas L, N, P e o RNA viral formam o complexo ribonucleoprotéico (complexo RNP). A proteína M (matriz) é importante para a maturação viral e

16 15 funciona como conectora das glicoproteínas de superfície (F e H) e ao nucleocapsídeo (BEINEKE et al., 2009). As glicoproteínas H (hemaglutinina) e F (fusão) desempenham funções importantes na patogenia da neuroinvasividade; a proteína H é responsável pela adsorção do vírus aos receptores da célula do hospedeiro, e a F pela fusão do envelope viral na membrana celular do hospedeiro (BARRETT, 1999; ZEE e MACLACHLAN, 2004; PARDO et al., 2005; ARNS et al., 2007), possibilitando a entrada do complexo RNP no citoplasma da célula. A proteína F também confere a formação de sincícios sendo responsável pela disseminação do vírus de célula para célula e pela fusão entre as células do hospedeiro (ZEE e MACLACHLAN, 2004). A hemaglutinina, por ser a maior glicoproteína do envelope, é considerada o melhor alvo para o estudo e comparação entre sequencias do genoma viral das estirpes isoladas de cinomose (ÖRVELL et al., 1990; BOLT et al., 1997; HAAS et al., 1997). Até o presente momento foi isolado apenas um sorotipo do VCC. Porém, os casos de infecção natural apresentam isolados com uma grande variabilidade antigênica, os quais são divididos em linhagens que apresentam variações de patogenicidade e virulência (ZEE e MACLACHLAN, 2004; ARNS et al., 2007; MCVEY e KENNEDY, 2008) sendo associadas principalmente com a região geográfica onde a cepa foi isolada (SUMMERS et al., 1984). Existem várias linhagens conhecidas: América-1. América-2, Europa, Ártica, Ásia 1 e Ásia 2 (LAN et al., 2007; MCVEY e KENNEDY, 2008). Além dessas linhagens já conhecidas uma nova linhagem na África do Sul foi identificada e denominada África (WOMA et al., 2010) Epidemiologia A transmissão do vírus acontece principalmente através de aerossóis produzidos por secreções respiratórias e o seu período de incubação dura aproximadamente 7 dias (APPEL e SUMMERS, 1995). Após o período de incubação o animal começa a eliminar o vírus através das secreções ocular e nasal (GREENE e APPEL, 2006). A infecção pelo VCC pode acometer cães de todas as idades, principalmente os filhotes (3-6 meses de idade) devido à diminuição de anticorpos maternos (APPEL e SUMMERS, 1995; CHAPPUIS, 1995; GREENE e APPEL, 2006). Além

17 16 disso, os cães que se recuperam da infecção podem permanecer imunes por toda a vida sem eliminar o vírus (APPEL e SUMMERS, 1995). Os casos de cinomose são observados com maior frequência em épocas de temperaturas mais baixas (HEADLEY e GRAÇA, 2000; MARTINO et al., 2004). Não há predileção sexual nem racial pelo vírus (HEADLEY e GRAÇA, 2000; BORBA et al., 2002). Cães sem raça definida (SRD) lideraram as estatísticas da doença quando comparado às diferentes raças caninas, possivelmente por este grupo ser extremamente representativo no Brasil (HEADLEY e GRAÇA, 2000). Cães de rua parecem ser mais susceptíveis que cães domiciliados, já que geralmente não são vacinados e devido a isso apresentam títulos baixos de anticorpos contra o vírus, além de apresentarem maior chance de entrar em contato com partículas virais provenientes de outros cães infectados (BORBA et al., 2002). Apesar de a cinomose ter sido controlada durante vários anos em países desenvolvidos, surtos frequentes com alto índice de mortalidade têm ocorrido (MAES et al., 2003). Segundo DI FRANCESCO et al., (2012) mais de 50% dos cães infectados com o VCC eram cães vacinados acima de 1 ano de idade. Possivelmente o armazenamento inadequado ou a exposição a temperaturas extremas podem comprometer a efetividade da imunização assim como erros nos protocolos de imunização, levando a uma resposta imunológica falha ou ausente Patogênese O vírus é inalado ou ingerido juntamente com secreção nasal ou ocular de animais infectados que começam a eliminar o vírus cerca de sete dias após a infecção (GILLESPIE, 1962; GREENE e APPEL, 2006; MACLACHLAN e DUBOVI, 2011). Inicialmente o VCC se replica nos macrófagos das tonsilas e linfonodos bronquiais, causando uma imunossupressão grave e de longa duração (APPEL, 1969). Aproximadamente, 10 dias após a infecção, o vírus se dissemina pela via hematógena para os demais órgãos, incluindo as células do sistema respiratório, digestivo, urinário, endócrino, reprodutivo, linfóide (APPEL, 1969; APPEL, 1970), tegumentar (GRÖNE et al., 2003; GRÖNE et al., 2004; KOUTINAS et al., 2004), nervoso e vascular (KRAKOWKA et al., 1987). Acredita-se que os leucócitos sejam os principais carreadores do vírus pela via hematógena (ROCKBORN, 1958), pois o antígeno viral é detectado

18 17 primeiramente nos capilares e endotélio de vênulas do SNC 5 a 6 dias pós-infecção (PI) e em linfócitos perivasculares, processos podais astrocíticos e pericitos 8 dias PI (SUMMERS e APPEL, 1987). A infecção no SNC ocorre predominantemente através da via hematógena (KRAKOWKA, 1989) e a neuroinvasão pode ocorrer através de quatro formas: (1) uma disseminação direta através da pia mater atingindo as células meningeais; (2) através das células endoteliais na substância branca; (3) pelas células epiteliais do plexo coróide e (4) através das células do epêndima (Figura 2) (BEINEKE et al., 2009). Os mecanismos que ocasionam a desmielinização ainda são incertos, já que os oligodendrócitos não são as células alvo do VCC (BEINEKE et al., 2009). Sabese que ocorrem distúrbios circulatórios como edema, congestão e trombose em áreas próximas aos oligodendrócitos levando a apoptose dos mesmos e destruição da mielina (YAO-QIAN et al., 2013). Outra hipótese sugerida é um distúrbio metabólico caracterizado pelo aumento dos receptores de hialuranato nos CD44 (ALLDINGER et al., 2000; BEINEKE et al., 2009), o que levaria a danos nos astrócitos que por sua vez, tem a função de manter a barreira hematoencefálica (BHE) e nutrir os oligodendrócitos (YAO-QIAN et al., 2013). Segundo SEEHUSEN et al., (2010) a morte de alguns neurônios piramidais ocasionam danos nos axônios e consecutivamente a perda da mielina em uma fase inicial, levando ao desaparecimento da mielina e desencadeando por conseguinte, uma desmielinização severa (YAO-QIAN et al., 2013).

19 18 Fig.2: Disseminação do VCC através do SNC. Corte transversal do cerebelo: setas azuis: disseminação viral através das células meningeais infectadas; círculos pretos: disseminação viral por células endoteliais infectadas; setas amarelas: disseminação viral pelas células do epitélio do plexo coróide; setas vermelhas: disseminação viral pelas células do epêndima. Quadros destacados com marcação do antígeno VCC. Anticorpo monoclonal específico anti-vcc-n, método HRP-DAB. Fonte: BEINEKE et al., Imunologia A gravidade das lesões no SNC decorrente da infecção pelo VCC irá depender basicamente de três fatores: idade, estado imunológico e cepa viral (GREENE e APPEL, 2006). A idade do animal, assim como seu desenvolvimento e a eficiência do sistema imunológico podem influenciar na intensidade do quadro clinico-patológico (KRAKOWKA e KOESTNER, 1976; MACLACHLAN e DUBOVI, 2011). Os filhotes são considerados os mais susceptíveis a infecção devido à imaturidade do sistema imune que não é capaz de produzir uma quantidade adequada de anticorpos neutralizantes contra o vírus (GILLESPIE, 1962; APPEL, 1969). Os animais que apresentarem uma boa resposta imunológica, após o 14º dia, podem não apresentar sinais clínicos da cinomose canina, uma vez que anticorpos específicos neutralizam o vírus e inibem a sua propagação. Os animais que apresentam uma resposta imunológica intermediária não conseguem inibir a propagação do vírus pelo epitélio tecidual, mas podem conter a infecção quando os níveis de anticorpos aumentarem (GREENE e APPEL, 2006). Quando não há

20 19 resposta humoral, seja pela queda de anticorpos maternos, falha vacinal ou não vacinação ou até mesmo por falha na resposta imune individual, o vírus se dissemina por múltiplos tecidos desenvolvendo sinais clínicos graves que podem levar o animal a óbito (APPEL, 1969; GREENE e APPEL, 2006). TATSUO et al., (2000) identificaram uma glicoproteína de membrana expressa em algumas células T e células B conhecida como molécula sinalizadora de linfócitos ativados (SLAM) ou CD150 que tem a função de receptor celular para os Measles virus (MV). Essa molécula é expressa em algumas células do sistema imune, como células dendríticas maturas, macrófagos e células B e T ativadas (ROMERO et al., 2004), o que explicaria a capacidade dos Morbillivirus se disseminarem pelo organismo através do sistema imune. Devido a imunossupressão causada pelo vírus nas primeiras semanas PI (APPEL, 1969), pode ocorrer co-infecções com diversos agentes comumente conhecidos como Toxoplasma gondii (MORETTI et al., 2006, HEADLEY et al., 2013), Adenovírus canino tipo 1 e tipo 2 (CHVALA et al., 2007; RODRIGUEZ- TOVAR et al., 2007; HEADLEY et al., 2013), Parvovírus canino (HEADLEY e SAITO 2003; HEADLEY et al., 2013), Orthopoxvirus em gato doméstico (WIENER et al., 2013) e infecções causadas por fungos oportunistas (DILLEHAY et al., 1987, FLEGEL et al., 2012) Sinais Clínicos A cinomose apresenta uma grande variabilidade de sinais clínicos. Os sinais sistêmicos que podem ser observados variam desde anorexia, desidratação, vômito, secreções óculo-nasais muco purulentas (MOHANTY e DUTTA, 1981; SWANGO, 1997) e diarreia com ou sem sangue (APPEL, 1970; JONES et al., 2000). Em casos que o animal apresenta diarreia pode ocorrer uma piora do quadro clínico devido à desidratação grave (JONES et al., 2000). Alguns animais desenvolvem a fase epitelial com formação de pústulas na região abdominal ventral e/ou hiperqueratose dos coxins digitais (GREENE e APPEL, 2006). Os sinais clínicos neurológicos são muito variáveis e dependem da região do SNC acometida (SUMMERS et al., 1984). Os sinais neurológicos podem aparecer isoladamente ou iniciarem com os demais sinais sistêmicos, podem surgir entre uma a três semanas após a recuperação da doença sistêmica ou serem os únicos sinais observados no animal (SUMMERS et al., 1995; VANDEVELDE e ZURBRIGGEN,

21 ; GREENE e APPEL, 2006). As alterações neurológicas observadas são: apatia, alterações no comportamento, convulsão, sinais cerebelares (ataxia de cabeça e tronco, tremores de intenção e hipermetria), sinais vestibulares (inclinação de cabeça, quedas, andar em círculos e nistagmo), déficits visuais, paraplegia/paresia, tetraplegia/paresia, atrofia muscular, hiperestesia, mioclonia e coma (GILLESPIE, 1962; VANDEVELDE et al., 1982b; TIPOLD et al., 1992; AMUDE et al., 2006b; AMUDE et al., 2007). Os sinais neurológicos mais frequentemente observados em cães com cinomose são as mioclonias, convulsões e ataxia (MCGRATH, 1960, KOUTINAS et al., 2002; GEBARA et al., 2004; SILVA et al., 2007; HEADLEY et al., 2012). A mioclonia é caracterizada pela contração repetitiva de um músculo ou de um ou mais grupos musculares, envolvendo principalmente os músculos da mastigação e apendiculares (LORENZ e KORNEGAY, 2006). Foram descritas quatro síndromes clínico-patológicas causadas pelo VCC: encefalite em cães jovens, de caráter grave e agudo, com desenvolvimento de sinais clínicos sistêmicos e neurológicos; encefalite do cão adulto, considerada crônica, na qual os sinais neurológicos normalmente são isolados; encefalite do cão velho e a encefalite recidivante crônica, sendo de ocorrência esporádica (BRAUND, 1994) Patologia Achados macroscópicos Os cães acometidos podem desenvolver na fase aguda secreções nasais e oculares serosas, catarrais ou mucopurulentas caso haja uma infecção bacteriana secundária associada (LÓPEZ, 2013). A fase epitelial pode ocorrer com o surgimento de dermatites pustulares na região abdominal ventral e hiperqueratose dos coxins digitais (KOUTINAS et al., 2004; GREENE e APPEL, 2006). Ao realizar a necropsia, os pulmões podem não estar colabados, de coloração avermelhada e edemaciada (BEINEKE et al., 2009; LÓPEZ, 2013). No intestino pode ocorrer uma enterite catarral ou hemorrágica (SONNE et al., 2009). Pode ser observado atrofia parcial ou total do timo devido à capacidade que o vírus tem que se replicar e destruir os tecidos linfóides (ALVES et al., 2006). Os linfonodos podem estar congestos ou hemorrágicos (APPEL, 1969). Em animais que não desenvolveram os dentes permanentes o vírus infecta o alvéolo dentário, podendo levar a uma hipoplasia do esmalte dentário (DUBIELZIG, 1979).

22 Achados microscópicos Os pulmões podem apresentar pneumonia intersticial e histologicamente ser observado infiltrado inflamatório mononuclear associado a macrófagos espumosos, hiperplasia de pneumócitos tipo II e edema alveolar (PANDHER et al., 2006; LÓPEZ, 2013). Os coxins digitais podem apresentar hiperqueratose paraqueratótica ou ortoqueratótica, presença do corpúsculo viral, vacuolização de queratinócitos e hiperplasia epitelial (GRÖNE et al., 2004). No SNC, as alterações histopatológicas envolvem frequentemente a substância branca e a substância cinzenta, embora a lesãopossa predominar em uma delas (SUMMERS et al., 1995). A lesão predominante na maioria dos casos de cinomose é a desmielinização, ela pode ocorrer principalmente na substância branca, enquanto as lesões na substância cinzenta podem estar ausentes (VANDEVELDE et al., 1982b; VANDEVELDE e ZURBRIGGEN, 2005). As alterações histopatológicas como degeneração neuronal, gliose, infiltrado linfoplasmocitário perivascular podem ocorrer no córtex cerebral, cerebelar, tálamo, núcleo basal e medula espinhal (SUMMERS et al., 1995). As diferenças entre as cepas influenciam no tropismo viral, refletindo um padrão de lesão que pode ser predominantemente de desmielinização, quando, por exemplo, a cepa infecta um maior número de células da glia, especialmente astrócitos do que se infectassem neurônios (SUMMERS et al., 1984). A desmielinização pode ocorrer na fase inicial da doença, quando ainda não há inflamação, ou em uma fase mais crônica em que normalmente a inflamação está frequentemente presente (TIPOLD et al.,1992, VANDEVELDE e ZURBRIGGEN, 2005). A resposta inflamatória se inicia a partir do momento que o hospedeiro começa a restabelecer a sua resposta imunológica na tentativa de eliminar o vírus do SNC após imunossupressão grave nos estágios iniciais da infecção, VANDEVELDE et al., 1982a, SUMMERS et al., 1995). As lesões são classificadas como Encefalite desmielinizante de acordo com o seu grau de desmielinização e inflamação em: hiperaguda, aguda, subaguda e crônica, apresentando algumas diferenças entre os autores (VANDEVELDE et al., 1981; VANDEVELDE et al., 1985; TIPOLD et al., 1992; SCHOBESBERGER et al., 2002; JACHARY, 2013).

23 22 Histologicamente as lesões hiperagudas não apresentam desmielinização; há discreta ou nenhuma reação astroglial, ausência de inflamação; pequenos vacúolos na substância branca e corpúsculo de inclusão intranuclear em 25% dos astrócitos (SUMMERS et al., 1979; VANDEVELDE et al., 1981; SCHOBESBERGER et al., 2002). Por ocorrer próximo do oitavo dia pós-infecção (SUMMERS et al., 1979), a replicação viral é bastante acentuada nessa fase (SCHOBESBERGER et al., 2002). A fase aguda é caracterizada por desmielinização da substância branca, principalmente nas regiões subependimárias, periventriculares e subpiais, astrogliose leve ou moderada; ausência de lesões inflamatórias; formação de sincícios de astrócitos e corpúsculos de inclusão intranuclear em 30% dos astrócitos (SUMMERS et al., 1979; VANDEVELDE et al., 1981; VANDEVELDE e ZURBRIGGEN, 2005; GREENE e APPEL, 2006). A fase subaguda é caracterizada por desmielinização moderada, formação de esferóides axonais e pequena quantidade de infiltrado linfocítico nos espaços de Virchow-Robin. Células gitter e microgliose também podem ser observadas nessa fase. Os corpúsculos de inclusão podem ser vistos em até 50% das lesões nessa fase (VANDEVELDE et al., 1981; VANDEVELDE et al., 1982a; SUMMERS et al., 1994; SCHOBESBERGER et al., 2002). Nas lesões crônicas a desmielinização observada é extrema, sendo acompanhada de infiltrado inflamatório mononuclear difuso acentuado podendo estar presente nas leptomeninges, plexo coróide e espaço de Virchow-Robin em regiões adjacentes à lesão. Os manguitos perivasculares de linfócitos e plasmócitos são exuberantes e chegam a formar até 5 camadas ao redor dos vasos. Há formação de sincícios de astrócitos e os corpúsculos de inclusão intranuclear em astrócitos podem ser observados (VANDEVELDE et al., 1981; VANDEVELDE et al., 1982b; SCHOBESBERGER et al., 2002; GREENE e APPEL, 2006). Os corpúsculos de inclusão observados na cinomose são formados por agregados de nucleocapsídeos virais e debris celulares, resultados da infecção viral. A presença dos corpúsculos de inclusão na histologia confirma o diagnóstico (GREENE e APPEL, 2006). Infecções secundárias podem ocorrem devido a imunossupressão causada pela infecção viral, levando a pneumonias bacterianas secundárias principalmente por Bordetella bronchiseptica e Mycoplasma sp (CHVALA et al., 2007; LÓPEZ, 2013) ou associação com outros vírus como o adenovírus tipo 2 ou vírus da

24 23 parainfluenza (DAMÍAN et al., 2005; CHVALA et al., 2007; RODRIGUEZ-TOVAR et al., 2007). Infecções concomitantes de VCC com Neospora caninum e Toxoplasma gondii tem ocasionado encefalite supurativa, miosite e radiculoneurite (LEMBERGER et al., 2005; GREENE e APPEL, 2006; MORETTI et al., 2006) Técnicas de Diagnóstico Exame hematológico Exames hematológicos podem ser utilizados como diagnóstico auxiliar, já que o vírus causa linfopenia devido à destruição linfóide (KRAKOWKA e KOESTNER, 1977) Swab ocular A detecção do corpúsculo de inclusão in vivo pode ser realizada por um método simples e barato através do esfregaço de swab ocular em lâmina histológica. Deve-se ter cuidado ao realizar esse método, pois ele pode dar resultado falso negativo (MOHANTY e DUTTA, 1981; SWANGO, 1997). A demonstração de corpúsculos de inclusão em esfregaços conjuntivais ou em células inflamatórias associadas ao exsudato, confirma o diagnóstico. No entanto, estes testes são frequentemente negativos e a ausência não exclui a infecção pelo VCC (SWANGO, 1997) Sorologia - ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Testes sorológicos como ELISA, podem ser utilizados, porém se o animal estiver na fase aguda da infecção os títulos de anticorpos podem estar baixos devido à imunossupressão e não serem detectados. Animais que foram vacinados recentemente podem apresentar um pico alto de anticorpos o que pode ser confundido com um animal infectado o que dificulta a utilização desse método como diagnóstico, devido aos erros ocasionados na interpretação (SOMA et al., 2003; SOMA et al., 2013). A sorologia pode ser ineficiente, já que muitas vezes os animais que morrem de cinomose podem ou não ter anticorpos mensuráveis (SWANGO, 1997). Durante a avaliação de 26 cães infectados naturalmente pelo VCC, 26,9% (7) animais foram detectados positivos através do ELISA (SOMA et al., 2003). SOMA et

25 24 al., 2003 comparou o título de IgM dos 26 cães infectados naturalmente com os cães vacinados contra o VCC, foi possível observar que os títulos de IgM induzidos por uma estirpe virulenta do vírus são muito mais altos do que os títulos de IgM induzidos pela vacina. LATHA et al., (2007) demonstraram que o IgM-ELISA detectou 49% dos casos positivos, enquanto a técnica de Slot blot detectou apenas 36% dos casos das mesmas amostras. O IgM-ELISA é um método rápido e sensível quando comparado ao outros testes que utilizam amostras de soro para a detecção do antígeno nas fases iniciais da infecção Detecção Molecular A técnica de Transcriptase Reversa em Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) para detecção do RNA do VCC tem sido realizada amplamente para diagnósticos ante-mortem com amostras de sangue, soro, urina e liquor por muitos laboratórios (GEBARA et al., 2004; SAITO et al., 2006; AMUDE et al., 2007; NEGRÃO et al., 2013). Para a detecção post-mortem do RNA viral através do RT- PCR utilizam-se órgãos como cerebelo, córtex cerebral e pulmão (FRISK et al., 1999; AMUDE et al., 2007; ROSA et al., 2012). A técnica de RT-PCR detectou 86% das amostras de soro como positivas e 88% das amostras de sangue total e do SNC, de cães previamente positivos pela imuno-histoquímica (IHQ) (FRISK et al., 1999). Porém no estudo de SHIN et al., (1995), apenas 53,1% das amostras de sangue periférico foram positivas, mesmo utilizando dois pares de oligonucleotídeos distintos. Fatores como: a seleção da sequência alvo de nucleotídeos a ser amplificado, método de extração do RNA a ser utilizada, padronização dos reagentes empregados na técnica, seleção do material biológico a ser utilizado para o diagnóstico, forma de conservação e tempo de estocagem podem interferir na técnica, ocasionando em um resultado falso-negativos (DI FRANCESCO et al., 2012) Imuno-histoquímica A técnica de IHQ tem sido empregada como excelente diagnóstico auxiliar nos casos em que há lesão histopatológica, porém não são visualizados corpúsculos de inclusão (SONNE et al., 2009). O antígeno pode ser detectado no epitélio

26 25 respiratório, epitélio da bexiga, estômago, coxins digitais assim como no encéfalo, sendo a marcação visualizada principalmente no cerebelo (KOUTINAS et al., 2004; LIANG et al., 2007; SONNE et al., 2009). Segundo SONNE et al., (2009), dos 46 coxins analisados através da IHQ, 31 (67.4%) foram positivo, sendo considerado o principal órgão para marcação viral. De acordo com KOUTINAS et al., (2004), mesmo quando os coxins digitas não apresentam corpúsculos de inclusão viral podem apresentar marcação imunohistoquímica intensa no epitélio. O estômago é um dos órgãos de eleição para o diagnóstico histológico e imuno-histoquímico da cinomose canina, por usualmente conter, um grande número de corpúsculos de inclusão viral, sendo considerado o segundo melhor órgão para alvo da IHQ com 32 (62,7%) amostras positivas de 51 casos testados, mesmo em casos de autólise tecidual (SONNE et al., 2009). O cerebelo apresentou 23 (45,1%) positivos de 51 testados. Porém a marcação viral não foi visualizada em locais em que havia uma desmielinização moderada a severa e formação de manguitos acentuados, caracterizando a forma crônica da doença (SONNE et al., 2009). ALLDINGER et al., (2000) relatam que o antígeno da cinomose encontra-se ausente ou restrito as áreas de lesões em casos mais crônicos Cinomose nas demais espécies animais São susceptíveis ao VCC famílias de espécies selvagens como: Mustelidae (furão, ferret e marta) (PAVLACIK et al., 2007; MEGID et al., 2013), Procionidae (jupará, quati, guaxinim e panda) (NIKOLIN et al., 2012), Ailuridae (panda vermelho) (QIN et al., 2007), Viveridae (gato de alcália) (CHANDRA et al., 2000), Hyaenidae (hiena) (HAAS et al., 1996), Protelidae (protelo-mamífero semelhante à hiena), alguns membros da família Ursidae (COTTRELL et al., 2013), Tayassuidae (Javalispecari de coleira, Tayassu tajacu) (APPEL et al., 1991), Felidae (leões, tigres e onças) (APPEL et al., 1994; ROELKE-PARKER et al., 1996; SEIMON et al., 2013), mamíferos marinhos de várias famílias (baleias, golfinhos, botos, leões marinhos e focas) e primatas não humanos (SAKAI et al., 2013). 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais do estudo

27 26 O estudo prospectivo foi realizado com cães que vieram a óbito durante o período de fevereiro de 2012 a fevereiro de 2013, apresentando sinais clínicos neurológicos, com suspeita clínica prévia de infecção natural pelo vírus da cinomose canina (CDV), foram encaminhados ao Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT) para a realização da necropsia. Os cães encaminhados ao LPV-UFMT faziam parte da casuística de atendimento do HOVET-UFMT e de clínicas veterinárias particulares da região de Cuiabá, MT. Uma ficha padrão (Anexo 1) contendo dados referentes ao caso como: idade, sexo, raça, esquema de vacinação e sinais clínicos apresentados foi confeccionada sendo utilizada durante o estudo. 3.2 Necropsia e amostras biológicas Na necropsia, as lesões macroscópicas observadas nos cães necropsiados foram registradas. Fragmentos de encéfalo, medula espinhal, intestino delgado e grosso, timo, baço, rim, fígado, estômago, bexiga, coração, pulmão e linfonodo mesentérico foram coletados e fixados em formalina a 10%.Adicionalmente, secções do encéfalo e medula espinhal foram padronizadas de acordo com SILVA et al., (2009). Essas secções incluiram: (1) ponte, cerebelo, (2) diencéfalo, mesencéfalo; (3); lobo parietal, lobo temporal e (4) lobo frontal. A medula espinhal foi seccionada em três regiões: cervical, torácica, lombar. Secções do encéfalo como: ponte, cerebelo, lobo parietal, lobo temporal e lobo frontal, seções da medula espinhal cervical, torácica e lombar e pulmão foram coletadas e armazenadas em microtubos a -20ºC para posterior análise. 3.3 Histopatologia Os fragmentos dos órgãos coletados durante a necropsia foram fixados em formalina a 10% e processadas rotineiramente para a análise histológica e coradas pela técnica de hematoxilina e eosina (HE) (BEHMER et al., 1976). As lesões microscópicas apresentadas pelos cães com achados patológicos compatíveis com o vírus da cinomose foram identificadas, e posteriormente graduadas em aguda, subaguda e crônica de acordo com SILVA et al., (2009). 3.4 Imuno-histoquímica

28 27 O teste imuno-histoquímico para a identificação do VCC foi realizado obrigatoriamente em cortes do cerebelo em todos os casos selecionados. Nos casos que não foi visualizada a marcação positiva no cerebelo, optou-se pelo estômago por ser um órgão epiteliotrópico alvo do vírus e nos casos em que havia pneumonia mononuclear ou supurativa também era realizada a técnica em cortes do pulmão para identificar a presença do vírus na lesão. Foi realizada a padronização da técnica de imuno-histoquímica a fim de estabelecer o melhor método de visualização antígeno viral do VCC. Como controles positivos, foram utilizados casos de cães naturalmente infectados pelo VCC contendo lesões histopatológicas compatíveis associadas à visualização do corpúsculo de inclusão. A IHQ foi realizada pelo método streptavidina-biotina conjugada com fosfatase alcalina (LSAB + System AP - DAKO ) descrita por SONNE et al., (2009), contendo algumas modificações. 3.5 Transcriptase Reversa - Reação de Cadeia em Polimerase (RT-PCR) Extração de RNA O RNA viral foi extraído a partir de 120µg de um pool do fragmento de encéfalo congelado macerado em 300µl de solução de PBS (Phosphate Buffered Saline) estéril diluído em água DEPC (Invitrogen Life Techolology, Carlsbad, CA, USA). A extração foi realizada por meio de kit SV Total RNA Isolation System (Promega Z3100) seguindo as instruções do fabricante RT-PCR Gene N As amostras de encéfalo previamente extraídas foram analisadas por RT- PCR com primers de oligonucleotídeos (Invitrogen Life Technologies, USA) CDV 1 (sense) [5 -aca gga ttg ctg agg acc tat-3, nt ] and CDV2 (anti-sense) [5 -caa gat aac cat gta cgg tgc-3, nt ], selecionados para amplificar um fragmento 257 pb do gene da Nucleoproteína do VCC (FRISK et al., 1999). A transcriptase reversa foi realizada com 9µl de RNA extraído e 2,0 pmol de CDV1, finalizando uma solução de 10 µl. A solução foi desnaturada a 70 C por 10 minutos e imediatamente transferia para cubos de gelo por 5 minutos. Foi então adicionado o solução RT-MIX que constituía 0,2mM de cada dntp (Invitrogen Life Technologies, USA), 1x PCR buffer (Invitrogen Life Technologies, USA) (20 mm Tris- HCl ph 8.4 and 50 mm KCl), 1.5 mm MgCl2, 100 unidades da enzima transcriptase

29 28 reversa M-MLV (Invitrogen Life Technologies, USA) e água ultrapura estéril para um volume final de 20 µl. Depois da homogeneização a solução foi incubada a 42 C por 30 minutos seguido a 70 C por 5 minutos para inativação da enzima. Para a reação da RT-PCR foi usado 2,5 µl do cdna, 0,4 pmol de cada primers (CDV1 e CDV2), 0,2 mm of cada dntp, 1x PCR-buffer (20 mm Tris-HCl ph 8,4 e 50 mm KCl), 1,5 mm MgCl2, 2,5 unidades Taq DNA Polymerase (Invitrogen Life Technologies, USA) e água ultrapura estéril para um volume final de 25 µl (AMUDE et al., 2006a), com algumas modificações. A reação foi realizada no termociclador MULTIGENE MINI24 (Labnet International Inc.) usando as seguintes condições de tempo e temperatura: i) desnaturação inicial a 94 C por 1 minuto; ii) desnaturação a 40 ciclos a 94 C por 1 minuto, primeiro anelamento a 59 C por 2 minutos e extensão a 72 C por 1 minuto; iii) a extensão final foi realizada a 72 C por 7 minutos. Uma amostra sabiamente positiva do nosso laboratório foi utilizada durante a reação como controle positivo e uma alíquota de água ultrapura estéril foi utilizada como controle negativo. Os produtos amplificados foram visualizados através de gel de agarose 2% em eletroforese em tampão de TBE 0,5X (44,58 MTris-base; 0,44 M ácido bórico; 12,49 mm EDTA ph 8,0) em voltagem constante (120v/60mA) por aproximadamente 45 minutos. O gel de agarose foi corado com GelRed Nucleic Acid Gel Stain, 10000x em água (Biotium - Uniscience), e visualizado sob luz ultravioleta (UV) em câmara escura. O tamanho esperado foi amplicons com 257 pb para o gene N Touchdown PCR Gene H Amostras de encéfalo previamente extraídas foram analisadas por RT-PCR com primers de oligonucleotídeos (Invitrogen Life Technologies, USA) CDV-H1 (5 - GTT GCC ACA AAA RCT AAACGA-3, posição 453 do gene H) e CDV-H2 (5 - CCT CCY AAG GGT TCC CAT GA -3, posição 1196 do gene H), resultando em um amplicon esperado de 882 pb do gene da Hemaglutinina do VCC (ROSA et al., 2012). Para a reação foi utilizado o método Touchdown-PCR (DON et al., 1991) e utilizado o kit GoTaq Green Master Mix (Promega M7113) segundo instruções do fabricante, 2 µl do cdna, 1 pmol de cada iniciador CDV-H1e CDV-H2 e água q.s.p.para uma reação final de 50 µl.

30 29 A mistura foi aquecida por 5 min. a 94 C para a desnaturação, caindo para 55 C, caindo 0,5 C por ciclo durante 35 ciclos, cada ciclo dura 1 min., seguindo a 37,5 por 1,5 min, subindo a 72 C por 2 min. e extensão final a 72 C por 10 min. em um termociclador Bio-Rad T100. O produto amplificado foi analisado por eletroforese em gel de agarose 0,7% contendo 0,5mg de brometo de etídio/ml de gel e usando 0,5x de tampão TBE (Tris base89 mm, Ácido Bórico 89 mm, EDTA 2 mm, ph 8.0), em voltagem constante (90V) por 40 min. O produto visualizado sob UV em câmara escura. O tamanho esperado foi amplicons com 882 pb para o gene H.

31 30 4 RESULTADOS 4.1 Cães Entre os meses de fevereiro de 2012 a fevereiro de 2013, um total de 80 cães com suspeita clínica de cinomose foram selecionados para a realização da necropsia. Em 48,75% (39/80) dos casos a idade dos cães afetados eram inferior a um ano, seguido por 18,75% (15/80) dos casos entre 1 a 2 anos de idade; 18,75% (15/80) entre 3 a 7 anos; 5% (4/80) entre 11 e 15 anos e 2,5% (2/80) entre 8 a 10 anos de idade. Em 6,25% (5/80) dos casos a idade não foi informada. Um total de 56% (45/80) dos cães com sintomalogia neurológica eram fêmeas e 44,5% (35/80) eram machos. Dentre as raças, a predominante foi a SRD (sem raça definida) com 66% (539/80) dos casos conforme a Tabela 2. Tabela 2. Dados clínico-epidemiológicos dos 80 cães necropsiados entre Fevereiro 2012 a Fevereiro de 2013 no LPV-UFMT. Dados clínico-epidemiológicos Raça Sem raça definida Pinscher PitBull Labrador Rottweiler Doberman Poodle Boxer Dálmata Lhasa Apso Pug Yorkshire Sexo Fêmea Macho Idade (anos) < Não informado N (%) 53 (66,25%) 6 (7,5%) 6 (7,5%) 3 (3,75%) 3 (3,75%) 2 (2,5%) 2 (2,5%) 1 (1,25%) 1 (1,25%) 1 (1,25%) 1 (1,25%) 1 (1,25%) 45 (56%) 35 (44,5%) 39 (48,75%) 15 (18,75%) 15 (18,75%) 2 (2,5%) 4 (5%) 5 (6,25%) Dos 80 cães com sinais clínicos neurológicos, a mioclonia foi o sinal predominante, estando presente em 43,7% (35/80) dos casos, seguido por convulsão em 40% (32/80) e dificuldade de locomoção em 31,2% (25/80), conforme Tabela 3.

32 31 Tabela 3. Sinais Neurológicos predominantes nos 80 cães. Sinais Neurológicos N(%) Mioclonia 35 (43,7%) Convulsão 32 (40%) Dificuldade de locomoção 25 (31,2%) Nistagmo 13 (16,2%) Vocalização 8 (10%) Opistótono 5 (6,2%) Compressão de cabeça 5 (6,2%) Cegueira 3 (3,7%) Movimentos de pedalagem 3 (3,7%) Andar em círculos 1 (1,2%) Bruxismo 1 (1,2%) 4.2 Achados patológicos e Imuno-histoquímicos Dos 80 cães com sinais clínicos neurológicos, 68 (85%) apresentaram algum tipo de lesão microscópica no SNC. Destes, 46 (67,6%) foram positivos na IHQ para CDV. Os principais dados clínicos e epidemiológicos destes cães estão resumidos na Tabela 4. Os principais achados macroscópicos observados durante necropsia dos 46 cães positivos para VCC foram: pulmões não colabados em 39,1% (18/46) dos casos (Fig. 3A), atrofia de timo em 39,1% (18/46), hiperqueratose dos coxins digitais em 13% (6/46) (Fig. 3B) e em 8,6% (4/46) descarga nasal e ocular (Fig. 3C).

33 32 Tabela 4. Dados clínico-epidemiológicos dos 46 cães positivos para VCC na IHQ necropsiados entre Fevereiro 2012 a Fevereiro de 2013 no LPV-UFMT. Dados clínico-epidemiológicos IHQ positive VCC (%) Raça Sem raça definida Labrador Pinscher PitBull Rottweiler Boxer Doberman Poodle Sexo Macho Fêmea Idade (anos) < Não informado Sinais clínicos Mioclonia Dificuldade de locomoção Convulsão Dificuldade respiratória Diarréia hemorrágica 31 (67,3%) 3 (6,5%) 3 (6,5%) 3 (6,5%) 3 (6,5%) 1 (2,1%) 1 (2,1%) 1 (2,1%) 17 (36,9%) 29 (63%) 24 (52,1%) 10 (21,7%) 6 (13%) 1 (2,1%) 2 (4,3%) 3 (6,5%) 27 (58,6%) 24 (52,1%) 18 (39,1%) 8 (17,3%) 5 (10,8%)

34 33 Fig. 3. Cães. Cinomose. 3A. Pulmões não colabados. 3B. Hiperqueratose coxim plantar. 3C. Secreção ocular purulenta. Microscopicamente, as lesões do SNC foram classificadas como: aguda em 15,2% (7/46) dos casos, sendo caracterizadas por desmielinização leve, astrogliose leve a moderada e ausência de reação antiinflamatória (Fig. 4A); subaguda em 73,9% (34/46) dos casos, sendo caracterizada por desmienilização moderada, infiltrado linfoplasmocitário leve a moderado ao redor de vasos; pequena quantidade de células gitter e alguns casos corpúsculos de inclusão (Fig. 4B); e crônica em 10,8% (5/46) sendo caracterizadas por desmielinização acentuada, presença intenso infiltrado inflamatório ao redor de vasos, de moderada a acentuada quantidade de células gitter e em alguns casos corpúsculos de inclusão (Fig.4C e D). Fig. 4. Cães. Cinomose. 4A. Cerebelo. Fase Aguda. Desmielinização da substância branca com infiltrado inflamatório linfocítico perivascular moderado. Hematoxilina e Eosina. Barra = 10µm. 4B. Cerebelo. Fase Subaguda. Desmielinização da substância branca com infiltrado inflamatório linfocítico perivascular moderado. Hematoxilina e Eosina. Barra = 100µm. 4C. Cerebelo. Fase Crônica. Infiltrado inflamatório linfocítico perivascular acentuado. Hematoxilina e Eosina. Barra = 50µm. 4D. Cerebelo. Fase Crônica. Infiltrado inflamatório linfoplasmocitário acentuado. Hematoxilina e Eosina. Barra = 50µm. Dos 68 casos testados na IHQ, 46 (67,6%) foram positivos. Destes, 45 (97,8%) a marcação foi observada no cerebelo (Fig. 5A), em 3 (6,5%) a presença do

35 34 vírus foi visualizada também em cortes de pulmão e 3 (6,5%) casos somente no estômago, conforme Tabela 5. Tabela 5. Achados histopatológicos nos cães positivos para VCC necropsiados no município de Cuiabá. Achados histopatológicos N (%) IHQ SNC Pulmão Estômago Aguda (desmielinização leve e ausência de reação inflamatória) Subaguda (desmielinização moderada e reação inflamatória leve a moderada) Crônica (desmielinização e reação 7 (15,2%) 34 (73,9%) 5 (10,8%) inflamatória acentuada) Total Fig. 5. Cães. Cinomose. 5A. Astrócitos são positivos para o anticorpo monoclonal anti-cinomose. Imuno-histoquímica fosfatase alcalina cromógeno permanent red, contra corado com Hematoxilina de Mayer. Barra = 20 μm. 5B. Astrócitos são positivos para o anticorpo monoclonal anticinomose. Imuno-histoquímica fosfatase alcalina cromógeno permanent red, contra corado com Hematoxilina de Mayer. Barra = 20 μm. 4.3 Análise Molecular Das 46 amostras submetidas à análise molecular, 28 (60,8%) foram positivas para o gene N através da RT-PCR e 5 (10,8%) foram positivas para o gene H através da Touchdown PCR.

36 Outras causas Dos 80 cães necropsiados, em 42,5% (34/80) dos casos, a etiologia dos sinais clínicos neurológicos foram atribuídos a outras causas (Tabela 6). Tabela 6. Diagnóstico das outras causas de histórico clínico neurológico. Causa Inconclusivo Encefalite Parasitária Encefalite Fúngica Insuficiência Renal Crônica Neoplasias Encefalite supurativa Encefalite granulomatosa Encefalopatia hepática Endocardite bacteriana Hepatite infecciosa Hidrocefalia Pneumonia supurativa N (%) 17 (50%) 3 (8,8%) 3 (8,8%) 3 (8,8%) 2 (5,8%) 2 (5,8%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) IHQ VCC Positivo Total 34 5 DISCUSSÃO No período de um ano, um total de 67,6% dos cães com sinais clínicos neurológicos foram confirmados positivos para VCC através da técnica de IHQ. Avaliação macroscópica e histopatológica foi realizada, e todos os achados foram consistentes com a doença clínica causada pelo VCC (KOUTINAS et al., 2002). Em nosso estudo, cães com menos de um ano de idade foram os mais afetados pelo VCC, sendo este achado similar a de outros autores (JÓZWIK e FRYMUS, 2002; GREENE e APPEL 2006; SONNE et al., 2009). A atrofia do timo foi o achado macroscópico mais observado (39,1%) em cães jovens (<1 ano), sugerindo que o vírus ocasiona uma destruição das células linfóides (MORO et al., 2003; SONNE et al., 2009). As lesões microscópicas observadas no encéfalo de cães positivos foram caracterizadas principalmente pela desmielinização (86,9%), a qual foi associada à

37 36 entrada do vírus no SNC através do LCR ou pelo rompimento a BHE via células linfóides infectadas (KOUTINAS et al., 2002; BEINEKE et al., 2009) havendo por conseguinte, replicação em neurônios e ocasionando danos nos axônios (KOUTINAS et al., 2002; SEEHUSEN et al., 2010). Em 54,3% dos cães, foi observado infiltrado linfocítico perivascular no SNC, sendo este achado diferente do observado por outros autores (SONNE et al., 2009), sugerindo que as lesões observadas podem estar associadas a presença de diferentes estirpes virais (KOUTINAS et al., 2002). O cerebelo (97,8%) foi o principal fragmento do SNC onde a marcação da IHQ foi visualizada, sendo este achado similar ao VAN MOLL et al., (1995). As amostras submetidas à técnica de RT-PCR assim como Touchdown PCR apresentaram um número menor de amostras positivas quando comparada a técnica de IHQ. Segundo SHIN et al., (1995), essas técnicas são muito sensíveis, porém a sensibilidade pode variar de acordo com o tipo de amostra, o método de extração do ácido nucléico viral e a escolha do primer. Em seu estudo foram utilizados dois pares distintos de oligonucleotídeos iniciadores demonstrando uma positividade de 53,1% nas amostras provenientes de cães com sinais clínicos de cinomose. Adicionalmente um estudo realizado por FRISK et al., (1999), com os mesmos oligonucleotídeos iniciadores revelou uma freqüência de 88% de animais positivos. Apesar de termos utilizado como critério de seleção amostras positivas na IHQ para realizar a RT-PCR e Touchdown-PCR, nossos resultados positivos foram inferiores ao encontrado por FRISK et al., (1999) sugerindo que ainda é preciso contornar alguns inconvenientes da técnica de RT-PCR que podem interferir substancialmente na maioria dos métodos de diagnóstico post-mortem (GEBARA et al., 2004). 6 CONCLUSÃO Considerando que a cinomose é uma doença de distribuição mundial a combinação de exames laboratoriais como a histopatologia, técnicas moleculares e a imuno-histoquímica são recomendadas na obtenção de um diagnóstico definitivo. A cinomose demonstrou sua relevância dentro da população canina de Cuiabá, sendo necessário ao nosso entendimento, caracterizar a estirpe viral relacionada à região, através do sequenciamento e análise filogenética das amostras previamente estabelecidas como positivas na RT-PCR.

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49 48 ANEXO I UFMT UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO HOSPITAL VETERINÁRIO HOVET LABORATÓRIO DE PATOLOGIA VETERINÁRIA (65) patologiaveterinaria@ufmt.br FICHA CLÍNICA DE CÃES COM CINOMOSE Nome:. Idade:. Peso: NPP:. Raça:. Sexo: ( ) Macho ( ) Fêmea. Médico (a) Veterinário (a):. Data consulta: / /. Proprietário:. Tel:. Endereço:. INFORMAÇÕES CLÍNICAS Já foi vermifugado: ( ) Sim ( ) Não. Se Sim, qual foi o vermífugo:. Possível data da última vermifugação: / /. Quantas doses:. Já foi vacinado: ( ) Sim ( ) Não. Se Sim, qual foi à vacina:. Possível data da última vacinação: / /. Quantas doses:. Mãe era vacinada: ( ) Sim ( ) Não. Era vermifugada: ( ) Sim ( ) Não. Teste SensPert C: ( ) Positivo ( ) Negativo. Entrou em contato com cães doentes: ( ) Sim ( ) Não. Animal teve acesso à rua? ( ) Sim ( ) Não. Teve contato com algum animal da rua? ( ) Sim ( ) Não. Algum filhote da mesma ninhada apresentou algum sinal clínico ou veio a óbito?. SINAIS CLÍNICOS 1. Apresentou secreção ocular: ( ) Sim ( ) Não. 2. Apresentou secreção nasal: ( ) Sim ( ) Não. 3. Apresentou diarréia: ( ) Sim ( ) Não. Se Sim, qual foi à coloração: ( ) sanguinolenta ( ) amarelada ( ) enegrecida. 4. Apresentou dificuldade respiratória: ( ) Sim ( ) Não. 5. Apresentou sinal neurológico: ( ) Sim ( ) Não. Se sim, qual foi: ( ) mioclonia ( ) dificuldade de locomoção ( ) nistagmo ( ) convulsão ( ) bruxismo ( ) compressão da cabeça. 6. Apresentou pústulas na pele: ( ) Sim ( ) Não. Se Sim, qual região do corpo: ( ) torácica ventral ( ) abdominal ventral ( ) Outros:. 7. Apresentou hiperqueratose de coxins digitais: ( ) Sim ( ) Não.

50 49 Detecção do vírus da cinomose em cães naturalmente infectados no Mato Grosso Canine distemper viruses detected in naturally infected dogs in Mato Grosso 1 Leticya L Lopes 2 Raquel AS da Cruz 3, Luana GF dos Santos 4, Camila G Campos 2, Daniel M de Aguiar 4, Fernando R. Spilki 5, Edson M. Colodel 2 and Caroline A Pescador 2* ABSTRACT.- Lopes L.L., Cruz R.S., dos Santos L.G.F., Campos C.G., Aguiar D.M., Spilki F.R., Colodel E.M. & Pescador C.A [Canine distemper viruses detected in naturally infected dogs in Midwestern Brazil]. Detecção do vírus da cinomose canina em cães da região Centro-Oeste do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0): Laboratório de Patologia Veterinária, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Fernando Corrêa da Costa, 2367, Boa Esperança, Cuiabá, MT, , Brazil. carolpescador@yahoo.com.br. Canine distemper virus (CDV) is a RNA virus classified under the genus Morbillivirus, within the Paramyxoviridae family. The virus virulence and the host immune response mounting time are critical factors in the extent of viral invasion into epithelial tissues and central nervous system (CNS). CDV causes most of the encephalitis cases in dogs at different ages. The necropsy of 80 dogs, over a period of one year, revealed that 85% (68) presented microscopic lesions in the CNS potentially caused by CDV infection; 67.6% of these dogs (46/68) showed confirmed CDV infection by immunohistochemistry (IHC). The microscopic analyses of the CNS lesions classified 15.2% (7/46) as acute, 73.9% (34/46) as subacute, and 10.8% (5/46) as chronic. Most of the CDV cases that were positive by IHC were verified in the cerebellum (97.8%). The Canine distemper virus is responsible for neurological clinical signs in dogs, mainly under one year of age. The subacute CNS microscopic lesions were observed in 73.9% of the cases. IHC is a considered a good technique for the postmortem diagnosis. INDEX TERMS: Canine distemper virus, hemagglutinin (H) gen, immunohistochemistry, neurologic signs, Brazil. Resumo [Detecção do Vírus da Cinomose canina em cães naturalmente infectados no Centro-Oeste do Brasil]. O virus da cinomose canina (VCC) é um virus RNA, que pertence ao gênero Morbillivírus e família Paramyxoviridae. A capacidade de resposta imune assim como o fator de virulência do virus são fatores críticos para a invasão viral dos tecidos epiteliais e do sistema nervoso central (SNC). O VCC é o maior responsável pelas encefalites em cães, acometendo diversas idades. Durante um período de um ano, 85% (68/80) dos cães necropsiados tinham lesões microscópicas de VCC no SNC, dos quais 67.6% (46/68) foram confirmadas positivas através da imunohistoquímica (IHQ). Microscopicamente, as lesões do SNC foram classificadas em aguda em 15.2% (7/46) dos cães, em subaguda em 73.9% (34/46) e crônica em 10.8% (5/46) dos cães. O cerebelo foi principal órgão a apresentar marcação positiva na IHQ (97.8%). O VCC é responsável pelos sinais neurológicos em cães principalmente abaixo de um ano de idade. Microscopicamente as lesões subagudas foram vistas em 73.9% dos casos. A IHQ é considerada uma boa técnica de diagnóstico post-mortem. TERMOS DE INDEXAÇÃO: vírus da cinomose canina, gene H, imunohistoquímica, sinais neurológicos, Brasil. 1 Recebido em... Aceito para publicação em... 2 Departamento de Clínica Médica Veterinária. Laboratório de Patologia Veterinária. Av. Fernando Corrêa da Costa 2367, Boa Esperança, CEP: , Cuiabá, Mato Grosso, MT. *Autor para correspondência: carolpescador@yahoo.com.br 3 Departamento de Patologia Clínica Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Av. Bento Gonçalves 9090, Porto Alegre, RS , Brasil. 4 Laboratório de Virologia e Rickettsioses, Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso (HOVET-UFMT). Cuiabá, MT. Brazil. 5 Laboratório de Microbiologia Molecular, Instituto de Ciências da Saúde,. Universidade Feevale, Rodovia RS , Novo Hamburgo, RS , Brasil.

51 50 INTRODUCTION Canine Distemper is a pantropic worldwide infectious disease caused by CDV, a member of the Morbillivirus genus and Paramyxoviridae family (Koutinas et al. 2002). The CDV causes most of the encephalitis cases in dogs at different ages (Martella et al. 2008) and is the second main infectious agent responsible for the death of puppies in Brazil (Fighera et al. 2008). The most common lesion seen in CDV infected animals is demyelinating white matter with perivascular lymphocytic cuffing and intranuclear inclusion bodies in astrocytes and intracytoplasmic parietal cells of the stomach and bladder (Schobesberger et al. 2002). CDV infection in dogs produce neurological clinical signs and cause severe systemic disease characterized by a variety of symptoms including fever and respiratory, enteric, and dermatologic signs. In addition, footpad hyperkeratosis and enamel hypoplasia have been described in infected dogs (Koutinas et al. 2004, Greene & Appel 2006). CDV also infects a broad range of other animals such as Mustelidae, Procyonidae, Ursidae, Viverridae, Hyaenidae, and Felidae (Appel & Summers 1995, Megid et al. 2013). The virus displays an enveloped particle with 150 to 300 nm in diameter and an unsegmented, negative-sense, single-stranded RNA genome (Murphy et al. 1999). It encodes 6 main proteins: Nucleoprotein (N), Phosphoprotein (P), Matrix protein (M), Fusion protein (F), Hemagglutinin (H), and Large protein (L) (Sidhu et al. 1993). The H protein is one of the most variable morbillivirus proteins, often used to assess genetic changes between CDV isolates (Hashimoto et al. 2001, Lednicky et al. 2004, Negrão et al. 2013). The N gene is also used to gather information on genetic diversity regardless of being more conserved than the H gene (Keawcharoen et al. 2005). Despite of the fact that the Canine distemper virus is one of the main causes of dog mortality in Brazil, only limited information is available about epidemiological and molecular characteristics of the virus in the Cuiabá region, Mato Grosso State. Thus, this study documented and classified microscopic changes observed in the CNS from dogs that were determined CDV positive by immunohistochemistry, and analyzed the phylogeny of viral genomic regions, the H and N genes, in amplified fragments from isolated strains. MATERIALS AND METHODS A total of 80 domestic dogs presenting neurological clinical signs that are suggestive of CDV infection were selected for this study. The dogs were necropsied in the Laboratory of Veterinary Pathology from the Federal University of Mato Grosso (UFMT), in Cuiabá, Mato Grosso State, Brazil, between February 2012 and February Fragments of the cerebral nervous system (CNS) composed of cerebellum, pons, parietal, telencephalon temporal and frontal lobes, and spinal cords (cervical, thoracic, and lumbar segments) were collected during necropsy, stored in plastic tubes, and frozen at -20 C until use. In addition, fragments of the CNS (Silva et al. 2009), spinal cords (cervical, thoracic, and lumbar segments), heart, lungs, thymus, lymph nodes, liver, kidney, spleen, stomach, bladder, small intestine, and brain were collected, fixed in 10% buffered formalin, and processed according to standard histological methods. Tissue sections (5 μm) embedded in paraffin were stained with hematoxylin and eosin and microscopically evaluated. Additional information such as age, breed, sex, gross lesions, microscopic lesions, and IHC results were recorded for all studied dogs. The microscopic CNS lesions were classified as acute, subacute, and chronic (Summers & Appel 1985, Tipold et al. 1992, Schobesberger et al. 2002). Acute lesions were characterized by mild white matter demyelination and mild or moderate astrogliosis and absence of inflammatory lesions. Subacute lesions were characterized by white matter demyelination, mild perivascular lymphocytic cuffing, and inclusion bodies in astrocytes. Chronic lesions were classified by accentuated demyelination, severe perivascular lymphocytic cuffing, and variable inclusion bodies in astrocytes. Immunohistochemistry (IHC) was performed in sections of the CNS prepared in slides with Poly- L-Lisine and fixed at room temperature for 24 hours according to Sonne et al CNS slides from a CDV positive dog were used as positive control in all IHC tests. In cases where the IHC result was negative in the CNS slide, but showed CNS microscopic lesions suggestive of CDV infection, new slides with sections from lungs, stomach, and bladder were submitted to IHC for confirmatory diagnosis. Frozen tissues were used for the extraction of nucleic acids. RNA extractions were performed using the SV Total RNA Isolation System kit (Promega Z3100) according to the manufacturer s instructions. RNA was stored at -80 C until used as a template in RT-PCR amplification reactions. The N gen was amplified by RT-PCR with oligonucleotide primers previously reported for the diagnosis of CDV infection in dogs (Frisk et al., 1999). The amplification conditions were: 70 C for 10 min, 5 min on ice, 42 C for 30 min, and 70 C for 5 min. The RT-PCR amplification conditions were: 94 C for 1 min, 40 cycles of 94 C for 1 min; 59 C for 2 min; 72 C for 1 min; and 1 cycle of 72 C for 7 min. Amplified

52 51 products were separated in 2% agarose gel in 0.5X TBE (44.58 MTris-base; 0.44 M boric acid; mm EDTA ph 8.0) and visualized by GelRed Nucleic Acid Gel Stain in a UV transilluminator. Sequences from amplified fragments were assembled in a contiguous sequence of 257 bp (N gen). The amplification of the H gene was performed with oligonucleotide primers previously reported for the diagnosis of CDV infection in dogs (Rosa et al. 2012) using the Touchdown-PCR (Don et al. 1991). The Touchdown-PCR was performed with the GoTaq Green Master Mix kit (Promega M7113) according to the manufacturer s instructions. The amplification conditions were: 1 cycle of 94 C for 5 min; 35 cycles beginning at 55 C for 1 min followed by a 0.5 C reduction in each cycle; 1 cycle of 37 C for 1.5 min; 1 cycle of 72 C for 2min; and 1 cycle of 72 C for 10 min. Amplified products were separated in 0.7% agarose gel in 0.5X TBE and visualized with ethidium bromide in a UV transilluminator. Sequences from amplified fragments were assembled in a contiguous sequence of 882 bp (H gen). Ultrapure water was used as the negative control and CDV positive dog brain tissue was used as the positive control in both amplification reactions. RESULTS Eighty dogs were included in the study and necropsied in the Pathology Veterinary Laboratory from February 2012 to February The observed neurological clinical signs were characterized mainly as myoclonus 43.7% (35/80), convulsion 40.0% (32/80), difficulty in locomotion 31.2% (25/80) and vocalization 10% (8/80). CNS microscopic lesions compatible with CDV infection were observed in 85% of the studied dogs (68/80), of which, 67.6% (46/68) were confirmed by IHC. The clinical and epidemiological data are summarized in Table 1. The main gross lesions observed were characterized as uncollapsed lungs 39.1% (18/46), thymus atrophy 39.1%, (18/46), footpad hyperkeratosis 13%, (6/46), and nasal and ocular discharge 8.6%, (4/46). The CNS lesions were microscopically classified as acute in 15.2% of the cases (7/46) (Fig. 1), subacute in 73.9% (34/46) (Fig. 2), and chronic in 10.8% (5/46) (Fig. 3). Among the 46 performed IHC tests, 97.8% (45/46) were positive in the cerebellum (Fig. 4) and 6.5% (3/46) in lungs in the same time, and 4.3% (3/46) only in stomach, and confirmed the CDV diagnosis (Table 2.). All 46 IHC positive samples were submitted to RT-PCR and Touchdown PCR; 60.8% (28/46) produced positive amplification of fragments by RT-PCR and 10.8% (5/46) by Touchdown PCR. DISCUSSION The evaluation of 80 dogs, over a period of one year, confirmed 67.6% infections by CDV through immunohistochemical staining. The gross and histopathological findings from examinations performed in tissues of various organs from all CDV positive dogs were consistent with the clinical disease caused by CDV infection (Koutinas et al. 2002). Our observation that dogs under one year of age are more predisposed to be infected by CDV is similar to that reported in other studies (Józwik & Frymus 2002, Greene & Appel 2006, Sonne et al. 2009). Macroscopic lesions, characterized by thymus atrophy, were observed in 39.1% of the dogs under one year of age suggesting that the virus destroys lymphocytes (Moro et al. 2003, Sonne et al. 2009). The microscopic lesions observed in the brain of CDV positive dogs were mainly characterized by demyelinating (86.9%). This is associated with the virus pathways in the host, from its entrance in the CNS tissue through the cerebrospinal fluid or by crossing the blood-brain barrier via infected lymphoid cells, to its replication in neurons and glial cells, in the grey and white matter, causing demyelination (Koutinas et al. 2002). Moreover, 54.3% of the dogs showed CNS tissue with perivascular lymphocytic cuffing; this result differs from results reported by Sonne et al. 2009, and could indicate the difference in outcomes from different viral strains (Koutinas et al. 2002). In this study, most of the CDV cases that were positive by IHC were verified in the cerebellum (97.8%), which is similar to the results reported by Van Moll et al The samples submitted to RT-PCR and touchdown PCR showed a lower positivity compared with IHC. According to Shin et al. (1995), these techniques are very sensitive, but its sensitivity varies with sample source, viral nucleic acid extraction method and choice of primer. In this study, the samples used were from postmortem dogs previously confirmed by IHC which differs from the study by Shin et al. (1995) which the samples used were from ante-mortem animals showing a positivity of 53.1%. Additionally, in a study by Frisk et al. (1999) obtained a positive frequency of 88% of the animals by CDV. Their samples were from dogs diagnosed with canine distemper previously confirmed by immunohistochemistry, which explains the higher percentage of positivity. It is clear that we still need to overcome some drawbacks of the technique RT-PCR/Touchdown PCR as nonviral protein synthesis in the subacute and chronic forms that can interfere substantially in most methods of post-mortem diagnosis, selection of the target sequence of nucleotides to be amplified,

53 52 the RNA extraction method to be used, standardization of reagents employed in the art, the selection of biological material to be used for diagnosis, shape preservation and storage times, since it is a virus whose genome consists of single-stranded RNA, which can easily be degraded (Gebara et al. 2004). CONCLUSIONS Considering that canine distemper disease has been reported worldwide a combination of histopatology and immunohistochemistry is useful to obtain a more definitive diagnosis. Because in the dog population in Cuiabá, CDV has proven to be an importante disease, it was decided to further characterize the strain responsible to present neurological clinical sings and thus attempt to elucidate the factors related to disease in this region. ACKOWLEDGEMENTS The authors are thankful to CAPES for the financial support. REFERENCES Appel M.J. & Summers B.A Pathogenicity of morbilliviruses for terrestrial carnivores. Vet. Microbiol. 44: Don R., Cox P., Wainwright B., Baker K., Mattick J Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res 19 (14): Frisk A.L., Konig M., Moritz A. & Baumgärtner W Detection of canine distemper virus nucleoprotein RNA by reverse transcription-pcr using serum, whole blood, and cerebrospinal fluid from dogs with distemper. J Clin Microbiol 1999;37(11): Gebara C.M.S., Wosiacki S.R., Negrão F.J., Oliveira D.B de, Beloni S.N.E, Alfieri A.A. & Alfieri A.F Detecção do gene da nucleoproteína do vírus da cinomose canina por RT-PCR em urina de cães com sinais clínicos de cinomose. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., 56(4): Greene C.E. & Appel M.J Canine Distemper. In Greene C. E., Infectious Diseases of the Dog and Cat, 3rd edition. Edited by Saunders Elsevier, St Louis, pp Hashimoto M., Une Y. & Mochizuki M Hemagglutinin genotype profiles of canine distemper virus from domestic dogs in Japan. Arch. Virol. 146: Józwik A. & Frymus T Natural distemper in vaccinated and unvaccinated dogs in Warsaw. J. Vet. Med. B. 49: Keawcharoen J., Theamboonlers A., Jantaradsamee P., Rungsipipat A., Poovorawan Y. & Oraveerakul K Nucleotide sequence analysis of nucleocapsid protein gene of canine distemper virus isolates in Thailand. Vet. Microbiol. 105: Koutinas A.F., Polizopoulou Z.S., Baumgaertner W., Lekkas S. & Kontos V Relation of clinical signs to pathological changes in 19 cases of canine distemper encephalomyelitis. J. Comp. Pathol. 126: Koutinas A.F., Baumgärtner W., Tontis D., Polizopoulou Z., Saridomichelakis M.N. & Lekkas S Histopathology and immunohistochemistry of canine distemper virus-induced footpad hyperquetosis (hard pad disease) in dogs with natural canine distemper. Vet. Pathol. 41:2-9. Lednicky J.A., Dubach J., Kinsel M.J., Meehan T.P., Bocchetta M., Hungerford L.L., Sarich N.A., Witecki K.E., Braid M.D., Pedrak C. & Houde C.M Genetically distant American canine distemper virus lineages have recently caused epizootics with somewhat different characteristics in raccoons living around a large suburban zoo in the USA. Virol. J. 1:2. Martella V., Elia G. & Buonavoglia C Canine distemper virus. Vet. Clin. Small. Anim. 38: Megid J., Teixeira C.R., Cortez A., Heinemann M.B., Antunes, J.M.A.P., Fornazari F., Rassy F.B. & Richtzenhain L.J Canine distemper virus infection in a lesser grison (Galicitis cuja): first report and virus phylogeny. Pesq. Vet. Bras. 33(2):

54 53 Moro L., Martins A.S., Alves C.M., Santos F.G.A., Nunes J.E.S., Carneiro R.A., Carvalho R. & Vasconcelos A.C Apoptosis in canine distemper. Arch. Virol. 148: Murphy F.A., Gibbs E.P., Horzinek M.C. & Studdert M.J Veterinary and Zoonotic Viral Diaseases. In Murphy F.A, Veterinary virology, 3rd edition. Edited by Academic Press, San Diego, pp Negrão F.J., Gardinali N.R., Headley S.A., Alfieri A.A., Fernandez M.A., Alfieri A.F Phylogenetic analyses of the hemagglutinin gene of wild-type strains of canine distemper virus in southern Brazil. Genet. Mol. Res. 12(3): Rosa G.N., Domingues H G., Santos M. M. AP. B., Felippe P. A. N., Spilki F. R. & Arns C. W Detecção molecular e análise filogenética do gene H de amostras do vírus da cinomose canina em circulação no município de Campinas, São Paulo. Pesq. Vet. Bras. 32(1): Schobesberger M., Zurbriggen A., Doherr M.G., Weissenböck H., Vandevelde M., Lassmann H. & Griot C Demyelination precedes oligodendrocytes loss in canine distemper virus-induced encephalitis. Acta Neuropathol. 103(1): Shin Y., Mori T., Okita M. Gemma T, Kai C. & Mikami T Detection of canine distemper virus nucleocapsid protein gene in canine peripheal blood mononuclear cells by RT-PCR. J. Vet. Med. Sci. 57: Sidhu M.S., Husar W., Cook S.D., Dowling P.C. & Udem S.A Canine distemper terminal and intergenic non-protein coding nucleotide sequences: completion of the entire CDV genome sequence. Virology 193: Silva M.C., Fighera R.A., Mazzanti A., Brum J.S., Pierezan F. &. Barros C.S.L Neuropatologia da cinomose canina: 70 casos ( ). Pesq. Vet. Bras. 29(8): Sonne L., Oliveira E.C., Pescador C.A., Santos A.S., Pavarini S.P., Carissimi A.S. & Driemeier D Achados patológicos e imuno-histoquímicos em cães infectados naturalmente pelo vírus da cinomose canina. Pesq. Vet. Bras. 29(2): Summers B.A. & Appel M.J.G Syncytia formation: an aid in the diagnosis of canine distemper encephalomyelitis. J. Comp. Pathol. 95(3): Tipold A., Vandevelde M. & Jaggy A Neurological manifestations of canine distemper virus infection. J. Small Ani. Prac. 33: Van Moll P., Alldinger S., Baumgärtner W. & Adami M Distemper in wild carnivores: an epidemiological, histological and immunocytochemical study. Vet. Microbiol. 44: Figure legends Figure 1. Canine Cerebellum. CDV Acute. White matter mild demyelination. Hematoxylin and eosin. Barr = 10µm. Figure 2. Canine Cerebellum. CDV Subacute. White matter demyelination with moderate perivascular lymphocytic cuffing. Hematoxylin and eosin. Barr = 100µm. Figure 3. Canine Cerebellum. CDV Chronic. Accentuate perivascular lymphocytic cuffing. Hematoxylin and eosin. Barr = 50µm. Figure 4. Canine Cerebellum. CDV. Astrocytes are positive for CDV monoclonal antibody. Immunohistochemistry alkaline phosphatase permanent red stain, Mayer hematoxylin counterstain. Bar = 20 μm.

55 54 Table 1. Summary of epidemiological and clinical data from 46 dogs confirmed as CDV positive by IHC. Epidemiology and clinical data CDV IHC positive (%) Breed Mixed Labrador Pinscher PitBull Rottweiler Boxer Doberman Poodle Sex Male Female Age (years) < No information Clinical signs Myoclonus Locomotion difficulty Convulsion Difficulty Breathing Hemorrhagic diarrhea 31 (67.3%) 3 (6.5%) 3 (6.5%) 3 (6.5%) 3 (6.5%) 1 (2.1%) 1 (2.1%) 1 (2.1%) 17 (36.9%) 29 (63%) 24 (52.1%) 10 (21.7%) 6 (13%) 1 (2.1%) 2 (4.3%) 3 (6.5%) 27 (58.6%) 24 (52.1%) 18 (39.1%) 8 (17.3%) 5 (10.8%)

56 55 Table 2. Histopathological findings in CDV positive CNS in necropsied dogs from the Cuiabá municipality. Histopathological findings N (%) IHC CNS Lung Stomach Acute (mild demyelination and absent 7 (15.2%) inflammatory lesions) Subacute (moderate demyelination 34 (73.9%) and perivascular cuffing) Chronic (severe demyelination and perivascular cuffing) 5 (10.6%) Total Figure 1 Figure 2

57 56 Figure 3 Figure 4