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1 PRINCIPAIS ALTERAÇÕES NEUROPATOLÓGICAS EM CASOS DE FELINOS COM PIF Leonardo Pereira MESQUITA (1), Adriana de SIQUEIRA (1), Dâmaris Marçal PORDEUS (2), Paulo César MAIORKA (3), Aline Santana da HORA (4), Paulo Eduardo BRANDÃO (5). (1) Doutorandos do Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil; (2) Aluna de Iniciação Científica do Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil; (3) Professor Doutor do Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil; (4) Doutoranda do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil. (5) Professor Doutor do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil. s: - Autor principal: leopmesquita@gmail.com - Apresentadora: damarismp3@gmail.com Resumo O objetivo do estudo foi o de avaliar lesões no sistema nervoso central (SNC) em casos não-efusivos e efusivos de peritonite infecciosa felina (PIF), observando os aspectos relacionados com reações astrocíticas e microgliais. Para o estudo utilizamos cinco gatos que morreram contaminados naturalmente com o vírus da PIF e que apresentaram diferentes intensidades de lesões do SNC. Cérebro e cerebelo foram avaliados para a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e vimentina a fim de avaliar a morfologia de astrócitos, e foi realizada histoquímica da lectina de aglutinina-i de Ricinus communis (RCA-l) para avaliar a micróglia, verificando a resposta da glia no SNC de gatos com PIF. Como resultados, obtivemos uma resposta astrocítica importante em muitas áreas do SNC de todos os gatos, incluindo as áreas periventriculares dos ventrículos laterais e quarto ventrículo, a camada molecular do cerebelo e córtex cerebral. Esta reatividade astrocitária foi associada com áreas de vasculite granulomatosa ou piogranulomatosa e com perivasculite na maioria dos casos e foi caracterizada por astrocitose e astrogliose multifocal a coalescente, com um aumento da expressão de filamentos intermédiários, tais como GFAP. No entanto, os astrócitos exibiram forte expressão de vimentina no parênquima com alterações inflamatórias e necróticas graves, mas a expressão da GFAP foi leve ou ausente nesses casos. Houve resposta microglial presente apenas em lesões graves, e expressão de RCA-I foi detectada principalmente em células microgliais em descanso e que fagocitaram material ANAIS 37ºANCLIVEPA p.1038

2 infeccioso e restos celulares. O presente estudo indica uma forte resposta astrocitária, incluindo a presença de menos astrócitos diferenciados para vimentina e micróglia fagocitária positiva para RCA-l em lesões graves no sistema nervoso central de gatos com PIF. Palavras-chave: peritonite infecciosa felina, sistema nervoso central, GFAP, Vimentina. Keywords: feline infectious peritonitis, central nervous system, GFAP, Vimentin. Introdução A peritonite infecciosa felina (PIF) é uma doença causada por um coronavírus felino (FCoV), sendo uma importante causa de morte em gatos. Lesões causadas pela PIF são caracterizadas por um serosite fibrinosa ou granulomatosa que está associada com efusões nas cavidades corpóreas e/ou lesões piogranulomatosas em vários órgãos, incluindo o SNC. Muitos estudos têm caracterizado o componente inflamatório no SNC dos gatos com PIF, mas poucos têm tentado avaliar as alterações necróticas e degenerativas no parênquima deste tipo de tecido em relação à reatividade glial. Portanto, este estudo avaliou as lesões do SNC em casos de PIF efusiva e não-efusiva, avaliando aspectos relacionados com reações astrocíticas e microgliais (BROWN et al., 2007; KIPAR & MELI, 2014). Metodologia Animais e tecidos: o estudo foi realizado em cinco gatos com lesões neurológicas, que vieram a óbito devido ao vírus da peritonite infecciosa felina (VPIF). Todos os animais foram necropsiados, sendo colhidas amostras de vários orgãos e o SNC e e emblocadas em parafina. Depois, foram feitos cortes do cérebro a partir do telencéfalo ao nível do córtex frontal e hipocampo, do mesencéfalo no nível dos colículos rostral e caudal; metencéfalo no nível da ponte; e a partir de medula oblongata. IHC e histoquímica da lectina: as secções de tecido (5μm) foram submetidas à IHQ e histoquímica da lectina (LSAB; Dako). Os cortes foram desparafinados, reidratados e o bloqueio da peroxidase foi feito com metanol e peróxido de hidrogênio (3%). A recuperação antigênica foi realizada com o auxílio do tampão citrato. Os seguintes anticorpos foram usados para detecção dos antígenos astrocitários: proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e vimentina. A lectina da RCA-I foi utilizada para detectar micróglia. As secções foram incubadas numa câmara úmida com os anticorpos primários e depois com os anticorpos secundários (LSAB; Dako). A ligação ANAIS 37ºANCLIVEPA p.1039

3 antígeno-anticorpo foi visualizada utilizando o cromógeno Vector Red (Vector NovaRed; Vector Laboratories), seguido de coloração com hematoxilina. Secções do cérebro e cerebelo de gato sem alteração histológica foram usados como controle. Resultados Animais e patologia: a idade dos cinco gatos variou de 3 a 12 meses, entre machos e fêmeas. O curso clínico da doença variou entre 2 e 6 semanas e três gatos apresentaram progressiva perda de peso, prostração, inapetência e sinais neurológicos, os quais foram mais graves no gato 1, com hiperestesia, cegueira, inclinação da cabeça, andar em círculos e ataxia. O gato 2 apresentou ataxia e o gato 3 apresentou paralisia, que durou 6 semanas. Em relação às lesões macroscópicas no SNC observou-se opacificação de meninges e leptomeninges, bem como congestão vascular. Histologia: todos os gatos neste estudo exibiram lesões inflamatórias com diferentes graus de gravidade. Processos degenerativos e necróticos apresentaram-se no parênquima nervoso. As lesões histológicas foram caracterizadas como vasculite granulomatosa ou piogranulomatosa e/ou perivasculite. Infiltrados inflamatórios foram compostos de um grande número de macrófagos em todos os casos. Houve uma espongiose grave, difusa com necrose de liquefação, a qual foi associada a uma grande quantidade de astrócitos reativos na substância branca de áreas periventriculares dos ventrículos laterais. IHC e histoquímica da lectina: no cérebro e cerebelo de todos os gatos, o antígeno do VPIF foi detectado no citoplasma das células mononucleares no interior das leptomeninges. Reações astrocíticas foram avaliadas utilizando GFAP e vimentina, as quais foram visualizadas em diferentes áreas do SNC em todos os gatos do presente estudo. Astrocitose e astrogliose foram detectadas principalmente em áreas periventriculares dos ventrículos laterais e quarto ventrículo. A massa cinzenta foi principalmente associada com leptomeningite e perivasculite/vasculite do parênquima do córtex central, onde havia um aumento do número de astrócitos protoplasmáticos (astrocitose). Astrogliose ficou bem marcada com GFAP e houve imunomarcação também com vimentina em astrócitos protoplasmáticos do córtex cerebral. Astrogliose e astrocitose ficaram bastante expressivas com GFAP. A imunomarcação pela vimentina foi forte em um grande número de astrócitos em áreas periventriculares. Imunomarcação para GFAP e vimentina em áreas periventriculares do quarto ventrículo foi semelhante aos ventrículos laterais. Além ANAIS 37ºANCLIVEPA p.1040

4 disso, houve forte imunomarcação para vimentina em astrócitos do hipocampo de um dos gatos. Encontrou-se moderada imunomarcação de GFAP na glia de Bergmann, próximo às zonas de leptomeningite no cerebelo. Em contraste, a imunomarcação nestes astrócitos era forte. As alterações inflamatórias não estavam presentes nas áreas do tronco cerebral, onde astrócitos positivos para vimentina foram achados. A lectina RCA-I foi detectada na micróglia residente de todos os gatos, e estas células foram caracterizadas por processos finos e fracamente corados. Discussão Este estudo descreve as características de lesões no parênquima do sistema nervoso central e da resposta glial em gatos com PIF (SLAUSON & FINN, 1972). A leptomeningite é geralmente restrita às meninges, com pouca extensão para o córtex, mas marcou encefalite com necrose presente em áreas subependimais. Em relação à resposta da glia, os resultados do presente estudo revelaram uma resposta astrocitária de destaque no parênquima do SNC, com lesões degenerativas e necróticas e também em áreas sem lesões do parênquima. Reatividade astrocitária estava presente em todos os gatos em diferentes áreas do SNC, incluindo o córtex cerebral, áreas ventriculares e periventriculares, cerebelo e tronco encefálico. O presente estudo demonstrou diminuição da expressão do GFAP num grande número de astrócitos em áreas periventriculares com degeneração grave e alterações necróticas em parênquima nervoso e áreas com uma resposta astrocitária proeminente. Em contraste, estes astrócitos foram fortemente imunomarcados para a vimentina. Expressão do GFAP diminuiu, com um concomitante aumento da expressão de Vimentina, como foi visto no nosso estudo e também foi observado em outras doenças com encefalite, como a cinomose (HEADLEY et al., 2001; ORSINI et al., 2007). Os astrócitos do corpo caloso, hipocampo e glia de Bergmann expressaram vimentina em condições normais, e a expressão da vimentina no citoplasma de astrócitos foi detectada principalmente em áreas com mudanças degenerativas e/ou inflamatórias. Vimentina é expressa principalmente em astrócitos maduros, o que pode ser interpretado como uma mudança transitória do fenótipo, simbolizando uma mudança reativa. A imunorreatividade da Vimentina também pode ser interpretada como um recrutamento de astrócitos imaturos para os sítios de lesão. A positividade de astrócitos para vimentina também foi detectada em áreas do tronco cerebral, onde ANAIS 37ºANCLIVEPA p.1041

5 não havia inflamação ou alteração degenerativa. A expressão de vimentina em astrócitos do hipocampo em gatos com PIF foi claramente associada a lesões no parênquima nervoso, astrocitose e astrogliose. Astrogliose reativa tem sido descrita em muitas condições patológicas do SNC, incluindo desordens neurodegenerativas inflamatórias e desmielinizantes e infecções virais (ENG & GHIRNIKAR, 1994). Conclusão Em gatos com lesões graves no parênquima nervoso pela infecção com PIF, há uma ativação importante de astrócitos que podem contribuir parcialmente para o desenvolvimento de alterações degenerativas e inflamatórias no SNC. Estas lesões foram caracterizadas pela presença de um elevado número de células positivas para vimentina e um grande número de micróglia fagocitárias positivas para RCA-1. Referências KIPAR A.; MELI M. L. Feline infectious peritonitis: still an enigma? Vet Pathol 2014; 51: ; BROWN C.C.; BAKER D. C.; BARKER I. K. Alimentary system. In: Maxie MG (eds). Jubb, Kennedy and Palmer s pathology of domestic animals. 5th ed. Oxford: Elsevier, 2007, pp 1 296; SLAUSON D.; FINN J. Meningoencephalitis and panophthalmitis in feline infectious peritonitis. J Am Vet Med Assoc 1972; 160: ; HEADLEY S. A.; SOARES I. C.; GRAÇA D.L. Glial fibrillary acidic protein (GFAP)- immunoreactive astrocytes in dogs infected with canine distemper virus. J Comp Pathol 2001; 125: 90 97; ORSINI H.; BONDAN E. F.; SANCHEZ M.; et al. Marcação imunohistoquímica da expressão astrocitária de proteína glial fibrilar ácida e de vimentina no sistema nervoso central de cães com cinomose. Arq Neuropsiquiatr 2007; 65: ; ENG L. F.; GHIRNIKAR R. S. GFAP and astrogliosis. Brain Pathol 1994; 4: ANAIS 37ºANCLIVEPA p.1042