UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos Tese Avaliação da atividade bacteriocinogênica e características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância antimicrobiana em filmes biodegradáveis Carla Pohl Sehn Pelotas, 2015

2 1 Carla Pohl Sehn Avaliação da atividade bacteriocinogênica e características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância antimicrobiana em filmes biodegradáveis Trabalho de Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Orientador: Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva Pelotas, 2015

3 1 S456a Sehn, Carla Pohl Avaliação da atividade bacteriocinogênica e características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância antimicrobiana em filmes biodegradáveis / Carla Pohl Sehn. 115 f. Tese(Doutorado)-- Universidade Federal de Pelotas, PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, "Orientação: Wladimir Padilha da Silva". 1. bactérias ácido láticas. 2. sakacina P. 3. probiótico. 4. filmes bioativos. I. Título. CDD Ficha Catalográfica elaborada por Maríndia Pôrto Nunes CRB10/1440

4 1 Carla Pohl Sehn Avaliação da atividade bacteriocinogênica e características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância antimicrobiana em filmes biodegradáveis Tese aprovada, como requisito parcial, para obtenção do grau de Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas. Data da Defesa: 28 de agosto de Banca examinadora: Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva (Orientador) Doutor em Ciências dos Alimentos pela Universidade de São Paulo (USP) Profª. Drª. Eduarda Hallal Duval Doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) Drª. Márcia Magalhães Mata Doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal de Pelotas (UFPEL) Profª. Drª. Simone Pieniz Doutora em Microbiologia Agrícola e do Ambiente pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Profª. Drª. Stela Maris Meister Meira Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)

5 2 AGRADECIMENTOS À Universidade Federal de Pelotas e a Universidade Federal do Pampa pela oportunidade de realização dessa etapa profissional. Ao Professor Wladimir Padilha da Silva pela oportunidade, ensinamentos e, principalmente, por ter confiado na minha capacidade. Aos colegas e amigos da Universidade Federal do Pampa, pelo apoio e incentivo. Aos professores que, de alguma forma, contribuíram com este trabalho: Profª Elessandra Zavarese, Prof. Álvaro Guerra Dias, Prof Fábricio Conceição, Profª Patricia Diaz (Bilica), Prof Odir Dellagostin, Profª Eduarda Duval, Profª Stela Meira, Prof Eliezer Gandra, Profª Simone Pieniz e, em especial, à Profª Angela Fiorentini, pelos ensinamentos e carinho. Aos colegas do Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, pelo convívio, confraternizações, chaves, senhas e risadas durante esse período. Em especial aos amigos do Laboratório de Grãos, Bárbara, Vânia, Jorge, Jean, obrigada por me acolherem. À Shanise Halal, minha dupla dinâmica, pelos ensinamentos, pelas risadas e pela amizade construída. À Josiara Mendes, do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Micologia Veterinária pela colaboração no trabalho e principalmente pela paciência. Aos colegas e amigos dos tempos de Biotecnologia, Michele, André, Carol, Suely, Sérgio, Samuel, Anelize, Gustavo, Neida, Marcelle, Rodrigo,

6 3 Clóvis, especialmente à Karla, ao Marcelo, à Sibele e ao Carlos, foi muito bom revê-los e estar perto. Aos estagiários do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, pela valiosa ajuda nas tarefas do dia-a-dia, pelo convívio e amizade, especialmente, aos meus pupilos, Maiara, Cristiano e Lyz, pelo carinho, confiança, lealdade e dedicação. À Dona Sonia, meu eterno abraço de gratidão e saudade. A todos os colegas e amigos do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, especialmente, Claudio, Guilherme, Darla, Márcia, Helena, Camila, Greici, Juliana, Mariana, Tassiana, Louise e Isabela, obrigada por tornarem esse ano muito especial e, com certeza inesquecível em minha vida. À Graciele Funck, minha dupla geminiana, pela calma, ensinamentos, paciência, companheirismo e, principalmente pela amizade e por me tornar mais forte quando nem eu mesma acreditava. Aos meus pais, Ilvo e Dulce, pelo carinho e incentivo em todas as etapas de minha formação, me apoiando para que eu não desistisse desse sonho. A todos meus amigos, que de longe ou de perto, sempre me apoiaram. E a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho. MUITO OBRIGADA!

7 4 RESUMO SEHN, Carla Pohl. Avaliação da atividade bacteriocinogênica e características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância antimicrobiana em filmes biodegradáveis f. Tese (Doutorado) Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Bactérias ácido láticas (BAL) é um grupo de micro-organismos heterogêneo que tem despertado grande interesse na indústria de alimentos devido à produção de substâncias antimicrobianas, como as bacteriocinas, e a utilização como probióticos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade bacteriocinogênica e as características probióticas do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e da utilização da sua substância antimicrobiana em filmes biodegradáveis. Cento e trinta e sete isolados de BAL foram caracterizados e 105 apresentaram atividade antimicrobiana contra Listeria monocytogenes ATCC Um isolado apresentou atividade bacteriocinogênica e foi identificado, pelo sequenciamento de 16S rdna, como Lactobacillus curvatus. Esse isolado, denominado LC254, é homofermentativo, móvel, resistente à vancomicina e tolera as condições simuladas do trato gastrointestinal. Tem capacidade de auto e coagregação, além de ser capaz de reduzir a adesão de L. monocytogenes ATCC 7644 em células intestinais HCT-116. O isolado LC254 carreia o gene codificador da bacteriocina Sakacina P, o qual foi confirmado por sequenciamento. A substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 tem natureza proteica e é estável em diferentes valores de ph, temperaturas e agentes químicos, além de apresentar ação contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Apresentou ação bacteriostática por até 3 h contra L. monocytogenes ATCC 7644 e não demonstrou toxicidade quando se utilizou Drosophila melanogaster como modelo. A substância antimicrobiana foi incorporada em filmes biodegradáveis produzidos com diferentes matrizes poliméricas e manteve atividade antimicrobiana por até 10 dias, demonstrando potencial para utilização no controle de L. monocytogenes em alimentos. PALAVRAS-CHAVE: bactérias ácido láticas; sakacina P; probiótico; filmes bioativos.

8 5 ABSTRACT SEHN, Carla Pohl. Evaluation of the bacteriocinogenic activity and of the probiotic characteristics of Lactobacillus curvatus isolate LC254 and the use of its antimicrobial substance in biodegradable films f. Thesis (Ph.D.) - Graduate Program in Food Science and Technology. Federal University of Pelotas, Pelotas, Lactic acid bacteria (LAB) are a group of heterogeneous microorganisms that are important to food industries due to the production of antimicrobial substances, such as bacteriocins, and their probiotic potential. This work aimed to evaluate isolate Lactobacillus curvatus LC254 characteristics and bactericinogenic activity in biodegradable films. One hundred and thirty seven LAB isolates were characterized. Of these, 105 presented antimicrobial activity against Listeria monocytogenes ATCC One isolate presented bacteriocinogenic activity and was identified as Lactobacillus curvatus by means of 16S rdna sequencing. This isolate, referred to as LC254, is homofermentative, mobile, resistant to vancomycin, and tolerates simulated gastrointestinal tract conditions. It is capable of auto- and co-aggregation and of reducing L. monocytogenes ATCC 7644 adhesion to HCT-116 intestinal cells. LC254 isolated bears a gene coding for Sakacin P, which was confirmed by sequencing. The antimicrobial substance produced by LC254 is of proteic nature and is stable in a range of ph values and temperature and resistant to several chemical agents. It acts against both Gram-positive and negative bacteria. The antimicrobial substance presented bacteriostatic activity for up to 3 h against L. monocytogenes ATCC 7644 and was not toxic to Drosophila melanogaster. This antimicrobial substance was incorporated into biodegradable films produced with different polymeric matrixes and maintained antimicrobial activity for up to 10 days, demonstrating its potential to control L. monocytogenes in food. KEY-WORDS: lactic acid bacteria; sakacin P; probiotic; active films.

9 6 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Motilidade do isolado Lactobacillus curvatus LC254 em ágar motilidade Figura 2 - Número de células viáveis do isolado Lactobacillus curvatus LC254 em suco gástrico simulado (pepsina 3 mg.ml -1 + ph 2,5) Figura 3 - Autogregação e coagregação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e de Listeria monocytogenes Scott A Figura 4 - Porcentagem de adesão de Listeria monocytogenes ATCC 7644 e do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a células intestinais HCT-116 após uma hora de incubação a 37 ºC Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 1,5 % com produto das PCR para genes de bacteriocinas Figura 6 - Mudanças no número de células viáveis (Log UFC.mL -1 ), ph e atividade antimicrobiana (UA.mL -1 ) durante a multiplicação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a 30 ºC durante 48 h Figura 7 - Mudanças no número de células viáveis (Log UFC.mL -1 ), ph e atividade antimicrobiana (UA.mL -1 ) durante a multiplicação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a 37 ºC durante 48 h... 78

10 7 Figura 8 - Multiplicação de Listeria monocytogenes ATCC 7644 a 37 ºC após adição da substância antimicrobiana do isolado Lactobacillus curvatus LC Figura 9 - Mortalidade de Drosophila melanogaster ao longo de 7 dias de tratamento com diferentes concentrações da substância antimicrobiana presente no sobrenadante livre de células do isolado Lactobacillus curvatus LC Figura 10 - Efeito de diferentes concentrações da substância antimicrobiana presente no sobrenadante livre de células do isolado Lactobacillus curvatus LC254 sobre a mortalidade de Drosophila melanogaster após 7 dias de tratamento Figura 11 - Atividade antimicrobiana dos filmes I e J a base de amido de batata, incorporados com sobrenadante livre de células do isolado Lactobacillus curvatus LC254 contendo a substância antimicrobiana, contra Listeria monocytogenes ATCC 7644, no primeiro dia de avaliação

11 8 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Micro-organismos utilizados, condições de cultivo e origem Tabela 2 - Primers utilizados para identificação de bactérias ácido láticas Tabela 3 - Primers, condições da PCR utilizados na identificação de genes codificadores de bacteriocinas Tabela 4 - Formulações de soluções filmogênicas elaboradas com diferentes concentrações de sobrenadante livre de célula de isolado de bactéria ácido lática e diferentes matrizes poliméricas Tabela 5 - Identificação pelo sistema Vitek 2 de bactérias ácido láticas homofermentativas e com atividade antimicrobiana, isoladas de queijo mussarela Tabela 6 - Identificação por sequenciamento de uma região do gene 16s rdna de bactérias ácido láticas homofermentativas e com atividade antimicrobiana, isoladas de queijo mussarela Tabela 7 - Perfil de suscetibilidade do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a antimicrobianos de uso clínico e respectivos tamanhos dos halos de inibição 60

12 9 Tabela 8 - Número de células viáveis do isolado Lactobacillus curvatus LC254 em suco intestinal simulado (pancreatina 1mg.mL -1 + ph 8,0) na presença/ausência de alimento e sais biliares Tabela 9 - Espectro de ação da substância antimicrobiana produzida pelo isolado Lactobacillus curvatus LC Tabela 10 - Efeito da ação de enzimas, ph, temperatura e agentes químicos sobre a estabilidade da substância antimicrobiana produzida pelo isolado Lactobacillus curvatus LC Tabela 11 - Atividade antimicrobiana de filmes contendo a substância antimicrobiana produzida pelo isolado Lactobacillus curvatus LC254 ao longo de 10 dias, contra Listeria monocytogenes ATCC

13 10 SUMÁRIO 1 Introdução Objetivos Geral Específicos Revisão Bactérias ácido láticas (BAL) BAL produtoras de substâncias antimicrobianas Bacteriocinas BAL como probióticos Material e métodos Amostras, cepas e condições de cultivo Identificação de isolados de BAL produtores de substâncias antimicrobianas Perfil fermentativo Identificação fenotípica Identificação molecular Extração de DNA Amplificação por PCR e sequenciamento parcial do gene 16S rdna.. 35

14 Caracterização de isolados produtores de substância antimicrobiana Avaliação fenotípica de motilidade Avaliação da suscetibilidade a antimicrobianos Avaliação do potencial probiótico Tolerância ao trato gastrointestinal de forma simulada Capacidade de autoagregação, coagregação e hidrofobicidade Avaliação da atividade da enzima β-galactosidase Capacidade de adesão de L. monocytogenes ATCC 7644 e do isolado de BAL a células intestinais HCT Caracterização da substância antimicrobiana Obtenção do sobrenadante livre de células (SLC) e determinação da atividade antimicrobiana Determinação do espectro de atividade antimicrobiana Avaliação da natureza da substância antimicrobiana Avaliação da estabilidade da substância antimicrobiana na presença de agentes químicos e em diferentes valores de ph e temperatura Avaliação de genes codificadores de bacteriocinas Cinética de produção da substância antimicrobiana Efeito da substância antimicrobiana sobre a multiplicação de L. monocytogenes Avaliação da toxicidade da substância antimicrobiana em Modelo de Drosophila melanogaster Avaliação da atividade antimicrobiana de filmes biodegradáveis incorporados de SLC de isolado de BAL Material Extração de amido Elaboração de filmes biodegradáveis Análise estatística... 54

15 12 5 Resultados e discussão Isolados de BAL produtores de substâncias antimicrobianas Perfil fermentativo Identificação dos isolados de BAL Caracterização do isolado bacteriocinogênico Motilidade Suscetibilidade do isolado LC254 a antimicrobianos Avaliação do potencial probiótico Tolerância ao trato gastrointestinal de forma simulada Autoagregação, coagregação e hidrofobicidade Atividade da enzima β-galactosidase Adesão de L. monocytogenes e do isolado LC254 a células intestinais HCT Caracterização da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC Atividade antimicrobiana e espectro de ação do SLC de LC Natureza da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC Estabilidade da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 aos agentes químicos e em diferentes valores de ph e temperatura Presença de genes codificadores de bacteriocinas Cinética de produção da substância antimicrobiana do isolado L. curvatus LC Efeito da substância antimicrobiana sobre a multiplicação de L. monocytogenes ATCC Toxicidade da substância antimicrobiana produzida por L. curvatus LC254 em modelo de Drosophila melanogaster Atividade antimicrobiana de filmes biodegradáveis incorporados com a substância antimicrobiana produzida pelo isolado L. curvatus LC

16 13 6 Considerações finais Referências Apêndices

17 14 1 Introdução Nas últimas décadas, diversas mudanças socioeconômicas e culturais levaram a transformações no modo de vida da população. Pode-se observar, especificamente no Brasil, uma rápida transição demográfica, epidemiológica e nutricional, apresentando como consequência, maior expectativa de vida, mudanças importantes no padrão de saúde e no consumo alimentar da população brasileira, entre outras (BRASIL, 2014). As alterações ocorridas no padrão de consumo alimentar são acompanhadas pelo crescente interesse por um estilo de vida mais saudável, incluindo a alimentação, quanto aos benefícios e a qualidade que os alimentos podem oferecer. Bactérias ácido láticas (BAL) têm sido utilizadas há séculos na preservação de alimentos para o consumo humano e muitas espécies são reconhecidas como probióticos (SULLIVAN; ROSS; HILL, 2002). Probióticos são definidos como micro-organismos vivos que, ao serem administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Os benefícios à saúde que têm sido associados aos probióticos são a estabilização da microbiota intestinal após a utilização de antibióticos, maior resistência gastrointestinal à colonização por patógenos devido a ação de seus metabólitos (ácido acético, lático, bacteriocinas, etc), estimulação do sistema imune, prevenção de diarreias e doenças inflamatórias do intestino (VASILJEVIC; SHAH, 2008), entre outros ainda não comprovados. Vários aspectos, incluindo características gerais, funcionais e tecnológicas, precisam ser considerados durante a seleção de estirpes probióticas, como a capacidade de sobreviver, se multiplicar e aderir ao epitélio intestinal, tolerar condições adversas, como a presença de sais biliares, suco

18 15 gástrico, pancreático e entérico, colonizar o intestino e apresentar capacidade antagônica a micro-organismos patogênicos (HUANG; ADAMS, 2004; SCHILLINGER et al., 2005). Apesar da indústria alimentícia, cada vez mais, produzir e ofertar alimentos que conferem benefícios à saúde, como alimentos constituídos de probióticos, com elevados padrões sensoriais, longa vida útil e com valores nutricionais adequados, há uma tendência geral de aumento do consumo daqueles alimentos que tenham sido submetidos a tratamentos tecnológicos menos drásticos, preparados com poucos, ou mesmo sem aditivos químicos e com baixo teor de ácidos, açúcares, sais e gorduras (CASABURI et al., 2016). Importantes implicações microbiológicas derivam dessa tendência, uma vez que a maioria das alterações realizadas comprometem as condições de preservação dos produtos, levando a diminuição da vida útil e de segurança alimentar. É importante que esta perda potencial de preservação e segurança seja de alguma forma, compensada e restabelecida (NASCIMENTO; MORENO; KUAYE, 2008). A bioconservação é uma técnica utilizada para estender a vida útil dos alimentos e aumentar a sua segurança por meio da aplicação de uma microbiota protetora ou de seus metabólitos (ROSS; MORGAN; HILL, 2002). A capacidade de produção de uma vasta gama de compostos bioativos com atividade antimicrobiana, especialmente bacteriocinas, é outra característica importante atribuída às BAL. As bacteriocinas são peptídeos ou proteínas sintetizadas nas células bacterianas e liberadas no meio extracelular, com ação bactericida ou bacteriostática sobre diversos micro-organismos (JACK et al., 1995). Por essas características, BAL são utilizadas como bioconservantes em alimentos (GARCIA et al., 2004; KYUNGWHA; AZLIN, 2007). Nas indústrias de alimentos, a bioconservação pode ser utilizada juntamente com as boas práticas de fabricação e higienização para evitar o crescimento de micro-organismos patogênicos e deteriorantes (GILLOR; ETZION; RILEY, 2008; MATAGARAS; DORSINOS; METAXOPOULOS, 2003; THERON; LUES, 2007). Entre as alternativas propostas, a utilização de substâncias antimicrobianas diretamente no alimento ou em filmes ativos, ou

19 16 mesmo a aplicação de isolados bacteriocinogênicos, tornam-se opções interessantes frente à essas questões. A utilização de filmes incorporados com substâncias antimicrobianas apresenta algumas vantagens sobre os métodos convencionais de adição direta de conservantes em alimentos como, a utilização de uma menor quantidade dessas substâncias e a liberação de maneira controlada, por atuarem, principalmente, na superfície do produto (KRISTO et al., 2008). Nesse sentido, o isolamento e a caracterização de novas linhagens provenientes de nichos não investigados, podem ser vantajosos para obtenção de linhagens com particularidades funcionais interessantes (ORTU et al., 2007). Além disso, BAL são constituintes naturais da microbiota de diversos alimentos, como leite e o queijo (HOLZAPFEL et al., 2001) e, vários trabalhos têm demonstrado os potenciais bactericinogênicos e/ou probióticos dessa microbiota (HERMANNS et al., 2014; JERONYMO-CENEVIVA, et al 2014; MEIRA, 2011; PERIN; NERO, 2014).

20 17 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Prospectar bactérias ácido láticas (BAL) produtoras de substâncias antimicrobianas e/ou com características probióticas isoladas a partir de queijo mussarela fatiado comercializado em supermercados e minimercados na cidade de Pelotas/RS, visando sua utilização tecnológica. 2.2 Específicos Caracterizar BAL produtoras de substâncias antimicrobianas e/ou com características probióticas isoladas a partir de amostras de queijo mussarela fatiado, utilizando métodos fenotípicos e genotípicos; Avaliar as características probióticas de isolados com atividade bacteriocinogênica; Caracterizar a substância antimicrobiana produzida por isolados bacteriocinogênicos quanto ao espectro de ação, natureza proteica, estabilidade, cinética de produção, modo de ação e toxicidade, além de identificar genes codificadores de bacteriocinas;

21 18 Aplicar a substância antimicrobiana produzida por isolados bactericinogênicos em filmes biodegradáveis a base de diferentes matrizes poliméricas.

22 19 3 Revisão 3.1 Bactérias ácido láticas (BAL) Bactérias ácido láticas (BAL) é a designação dada à um grupo de microorganismos que não representa uma categoria taxonômica, mas que possuem características morfológicas, fisiológicas e metabólicas comuns (PFEILER; KLAENHAMMER, 2007). Apresentam-se como Gram-positivas, na forma de cocos, bacilos ou coco-bacilos (FUGELSANG; EDWARDS, 2007), não formam esporos, são anaeróbias facultativas ou microaerófilas, ácido tolerantes e reproduzem-se por fissão binária (WALSTRA; WOUTERS; GEURTS, 2006). Quanto à temperatura, podem ser mesófilas ou termófilas, com temperaturas ótimas de multiplicação variando entre 30 ºC e 37 ºC e, 45 ºC e 50 ºC, respectivamente (CARR; CHILL; MAIDA, 2002; DE MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002). Geralmente, são micro-organismos imóveis, catalase negativa e desprovidos de citocromos, no entanto, algumas espécies foram identificadas com perfis distintos destes, como por exemplo, Pediococcus e Lactobacillus, capazes de produzir pseudo-catalase (ENGESSER; HAMMES, 1994). Outras espécies, na presença de sangue ou hematina, são capazes de formar catalase ou citocromo (MEISEL; WOLF; HAMMES, 1994; WHITTENBURY, 1964) e, pelo menos 14 espécies de Lactobacillus já foram descritas como móveis, das quais, 13 pertencentes à espécie L. salivarius (SALVETTI; TORRIANI; FELIS, 2012) e um L. curvatus (NRIC 0822) (COUSIN et al., 2015). O principal meio de obtenção de energia ocorre pela fermentação de carboidratos (especialmente glicose) e, baseado no perfil fermentativo, podem

23 20 ser classificadas em homo ou heterofermentativas. BAL homofermentativas produzem ácido lático como único ou o principal produto da fermentação da glicose, enquanto BAL heterofermentativas, são capazes de produzir, além do ácido lático, etanol, ácido acético e dióxido de carbono (CARR; CHILL; MAIDA, 2002). Em determinadas situações e dependendo da capacidade enzimática, algumas espécies de BAL utilizam vias alternativas para a metabolização do piruvato, levando a produção de outros compostos como o acetato, gás carbônico, peróxido, diacetil e acetoína (HUTKINS, 2006). De acordo com Stiles e Holzapfel (1997), BAL compreendem os seguintes gêneros: Aerococcus, Alliococcus, Bifidobacterium, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella. Os gêneros Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus (produtos lácteos, carne, legumes, cereais), Lactococcus (produtos lácteos), Leuconostoc (vegetais, produtos lácteos), Oenococcus (vinho), Pediococcus (legumes, carne), Streptococcus (produtos lácteos) e Weissella são os mais utilizados pela indústria alimentícia (BURGAIN et al., 2014; VANDAMME et al., 1996). Tradicionalmente, BAL têm sido classificadas com base nas suas características fenotípicas, como por exemplo, morfologia, modo de fermentação de glicose, crescimento em diferentes temperaturas, etc. No entanto, Holzapfel et al. (2001) observaram que as características fenotípicas não correspondem com as relações filogenéticas sugeridas a partir da comparação de sequências de 16S rdna, propondo uma nova classificação com base nessas sequências, que incluem os gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Carnobacterium, Enterococcus, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella, Microbacterium, Bifidobacterium e Propionibacterium. A primeira cultura pura de uma bactéria produtora de ácido lático foi obtida de uma amostra de leite por Joseph Lister, em 1873, sendo classificada como Bacterium lactis (SALMINEN; WRIGHT, 1998). No entanto, também são encontradas naturalmente no solo, na água, em fezes, em silagem e em plantas. Fazem parte da microbiota das mucosas do intestino, boca e do trato

24 21 genito-urinário, assim como da pele dos seres humanos e animais, e podem ter uma influência benéfica sobre estes ecossistemas (NETO et al., 2005) Embora apresentem alguns aspectos negativos, como a deterioração de alimentos, referido para algumas espécies de Pediococcus (HAN et al., 2007) ou potencial patogênico, relacionado especialmente ao gênero Enterococcus e Streptococcus (COLLINS; THORNTON; SULLIVAN, 1998; GUCHTE et al., 2002), muitas espécies de BAL apresentam grande relevância na indústria de alimentos e em saúde pública. As BAL podem ser classificadas em culturas iniciadoras ou starter (Starter Lactic Acid Bacteria) e, em não starter (Non Starter Lactic Acid Bacteria). Culturas iniciadoras usadas em alimentos fermentados são compostas por bactérias produtoras de ácidos e de aromas que influenciam na obtenção de um produto com variações dessas características sensoriais (SAMARZIJA et al., 2001). As culturas não starter geralmente são provenientes de alimentos e do ambiente de produção e utilizam, como fonte de energia alternativa, os aminoácidos liberados da autólise das culturas iniciadoras. Dessa forma, são capazes de modificar o sabor e o aroma original do produto. A associação das bactérias iniciadoras e não iniciadoras pode, em sinergia, contribuir positivamente para a qualidade do produto final (WILLIAMS; WITHERS; BANKS, 2000). BAL desempenham um papel essencial na tecnologia da maioria dos alimentos fermentados, com uma ampla variedade de cepas sendo rotineiramente utilizadas na produção de derivados lácteos, cárneos, de vegetais e produtos de panificação. Atuam na preservação e modificação de características sensoriais, como sabor e textura (BONOMO et al., 2011; REIS et al., 2012) e através da produção de substâncias antimicrobianas, sendo utilizadas na bioconservação de produtos alimentícios (GARCIA et al., 2004; KYUNGWHA; AZLIN, 2007). 3.2 BAL produtoras de substâncias antimicrobianas As BAL são importantes na conservação de alimentos devido à sua capacidade de interferir na multiplicação de bactérias deteriorantes e

25 22 patogênicas por meio de vários mecanismos, como competição por nutrientes e oxigênio, competição por sítios de ligação e através da produção de substâncias antimicrobianas (HUGAS, 1989). As principais substâncias produzidas por BAL com capacidade antimicrobiana são o ácido lático, peróxido de hidrogênio, dióxido de oxigênio (CO2), diacetil e as bacteriocinas, que são amplamente estudadas, devido a sua importância como bioconservantes em alimentos (ORTOLANI, 2009). Vários trabalhos relataram o isolamento e a caracterização de BAL bacteriocinogênicas a partir do leite e produtos lácteos, como o queijo, demonstrando que esses produtos são potenciais fontes para descoberta de novas substâncias com atividade inibitória contra micro-organismos indesejáveis (HERMANNS et al., 2014; ORTOLANI et al., 2010; PERIN; NERO, 2014). A identificação da atividade antimicrobiana de BAL usualmente é realizada utilizando o método spot-on-the-lawn (LEWUS; MONTVILLE, 1991; TAGG et al., 1976) ou o método de difusão em ágar (TAGG et al, 1971). No primeiro, é realizada a inoculação da cultura de BAL em um ponto sobre o meio de cultura base e, após, adiciona-se uma sobrecamada de meio contendo o micro-organismo indicador. A formação de halo de inibição ao redor da cultura da BAL indica a atividade antagonista do isolado e este método nos fornece um resultado qualitativo da produção de substância antimicrobiana (PERIN, 2010). O método de difusão em ágar (TAGG et al., 1971) utiliza o sobrenadante do cultivo de BAL como indicador da atividade antimicrobiana. Este é obtido a partir de centrifugação, neutralização, tratamento térmico e esterilização, para posterior aplicação em cavidades feitas no meio de cultura, contendo o microorganismo indicador. Uma variação deste método é a realização de diluição crítica (MAYR-HARTING; HEDGES; BERKELEY, 1972), em que são realizadas diluições do sobrenadante, as quais são inoculadas sobre o meio base, obtendo-se um resultado quantitativo da produção de substância antimicrobiana, expresso em Unidades Arbitrárias por mililitro (UA.mL -1 ). O método de difusão em ágar exclui a ação do ácido como substância antimicrobiana e consequentemente, determina em menor frequência isolados de BAL com potencial antimicrobiano quando comparado ao método spot-on-

26 23 the-lawn (ALEGRIA et al., 2010; MARTÍNEZ; SUÁREZ; RODRÍGUEZ, 1995; MORAES et al., 2010) Bacteriocinas As bacteriocinas são produzidas por, praticamente, todas as espécies bacterianas. Apesar do grande número de bacteriocinas produzidas por microorganismos Gram-positivos e Gram-negativos, as únicas bacteriocinas utilizadas comercialmente são aquelas produzidas por BAL (ARTHUR; CAVERA; CHIKINDAS, 2014). Normalmente, as bacteriocinas são sintetizadas na forma de prépeptídeos ou pré-bacteriocinas biologicamente inativos. Esses pré-peptídeos contêm uma sequência de 18 a 27 aminoácidos, apresentando duas glicinas na região N-terminal. As funções dessa sequência de aminoácidos são: evitar que a bacteriocina seja biologicamente ativa dentro da célula produtora e servir como sinal de reconhecimento para o sistema de transporte que envolve as proteínas do transporte ABC e uma proteína acessória (NES et al., 1996). Segundo Moll et al. (1996), as duas glicinas presentes na sequência de aminoácidos são as responsáveis pelo reconhecimento da pré-bacteriocina no sistema de transporte. Após o reconhecimento do pré-peptídeo, a sequência de aminoácidos é removida, e a bacteriocina, excretada da célula (ARTHUR; CAVERA; CHIKINDAS, 2014; ENNAHAR et al., 2000). A produção das bacteriocinas ainda não está bem compreendida, mas um dos possíveis fatores está relacionado com a competição entre microorganismos pelas mesmas fontes de nutrientes, permitindo à célula produtora dominar e se estabelecer em um dado nicho ecológico. Acredita-se que o mecanismo de produção de bacteriocinas seja regulado por quorum sensing, o qual é uma forma de comunicação célula-célula, onde as células presentes no ambiente produzem moléculas sinalizadoras (auto-indutoras) em função da densidade populacional. Quando a concentração celular do micro-organismo produtor excede um limiar, ocorre a expressão de alguns genes desse microorganismo, a qual induz a produção e liberação de compostos, como as

27 24 bacteriocinas, no meio extracelular (EIJSINK et al., 2002; TUROVSKIY et al., 2007). As bacteriocinas podem ter ação bactericida ou bacteriostática. A distinção entre os modos de ação é fortemente dependente da dose de bacteriocinas e do grau de purificação, estado fisiológico das células indicadoras (por exemplo, fase de crescimento) e das condições experimentais (por exemplo, temperatura, ph, a presença de agentes que alteram a integridade da parede celular e outros compostos antimicrobianos) (CINTAS et al., 2001; JUODEIKIENE et al., 2012). As bacteriocinas, geralmente, exercem a sua atividade antimicrobiana na parede celular ou na membrana celular do organismo-alvo, seja por inibição da biossíntese da parede celular ou pela formação de poros. A formação de poros na membrana plasmática é acompanhada de um fluxo passivo de pequenas moléculas, como íons potássio, magnésio e fósforo, com dissipação da força próton motriz envolvida diretamente com a síntese de ATP, ácidos nucleicos, fosforilação de proteínas, levando à morte celular bacteriana (DE CARVALHO et al., 2010; RODRÍGUEZ et al., 1998). Outro mecanismo de ação das bacteriocinas envolve a sua capacidade de induzir a lise da célula bacteriana. O processo está ligado à interação de bacteriocinas com os ácidos teicóico, teicurônico e lipoteicóico, componentes da parede celular, que resultam na liberação e ativação de enzimas autolíticas ligadas à célula, levando a autólise celular (GONZÁLES et al., 2010). O sistema de classificação proposto inicialmente para bacteriocinas produzidas por BAL, definiu quatro classes (KLAENHAMMER, 1993) e, desde então, várias modificações têm ocorrido a fim de adequar as bacteriocinas em diferentes classes (COTTER; HILL; ROSS, 2005; FRANZ et al., 2007; VAN BELKUM; STILES, 2000), porém, ainda há muita incerteza de como distinguir e caracterizar com precisão as bacteriocinas. A classificação mais aceita atualmente, divide as bacteriocinas produzidas por BAL em 3 classes: - Classe I ou lantibióticos: formada por peptídeos de baixo peso molecular (< 5 kda), termoestáveis, hidrofóbicas, catiônicas e diferenciam-se das demais bacteriocinas pela presença de lantionina e metilantionina. O

28 25 principal exemplo de bacteriocina pertencente a esta classe é a nisina. Esta bacteriocina é produzida por linhagens de Lactococcus lactis subsp. lactis e apresenta espectro de ação contra micro-organismos Gram positivos, como L. monocytogenes, S. aureus, B. cereus, além de outros patógenos e espécies de BAL. A nisina também pode exercer ação contra micro-organismos Gram negativos, quando combinada a outros tratamentos que alterem a permeabilidade da membrana plasmática, como EDTA ou SDS, por exemplo (HAMMOU et al., 2010). - Classe II: formada por peptídeos com até 10 kda, termoestáveis, hidrofóbicas, catiônicas e apresentam, de forma geral, uma estrutura helicoidal anfifílica, que possibilita sua inserção na membrana citoplasmática da célula alvo, promovendo a despolarização da membrana e a morte celular. São propostas 3 subdivisões para esta classe (DRIDER et al., 2006): - Classe IIa: composta por bacteriocinas que apresentam especificidade contra L. monocytogenes. Seus representantes possuem 37 a 48 resíduos de aminoácidos, com porção N-terminal com configuração de folha pregueada e uma porção C-terminal contendo duas hélices (FIMLAND, et al., 2005). As bacteriocinas desta classe se inserem na membrana celular do microorganismo alvo pela porção C-terminal, promovendo a formação de poros e consequente dissipação da força próton motriz. Na tentativa de manter ou restaurar a força próton motriz, ocorre uma aceleração no consumo do ATP e, consequentemente, a morte celular (KAISER; MONTVILLE, 1996). Pediocina AcH, enterocina A, sakacina A e P, leucocina A, mesentericina Y105, entre outras, são exemplos de bacteriocinas desta subclasse. - Classe IIb: esta classe é composta por bacteriocinas heterodiméricas que requerem a atividade combinada de dois peptídeos. Seu mecanismo de ação também envolve a dissipação do potencial de membrana e diminuição da concentração intracelular de ATP (COTTER; HILL; ROSS, 2005). São exemplos de bacteriocinas desta subclasse, a plantaricina EF, JK e S, enterocina 1071, lactococina G e MN, entre outras. - Classe IIc: as bacteriocinas pertencentes a esta classe apresentam uma união covalente das terminações C e N, resultando em uma estrutura

29 26 cíclica (COTTER; HILL; ROSS, 2005). São representantes desta classe: a enterocina AS-48, a circularina A e a reutericina 6. - Classe III: é formada por proteínas com peso molecular maior que 10 kda. São termolábeis, e consideradas complexas quanto à atividade e à estrutura proteica. São subdivididas em duas subclasses: IIIa ou bacteriolisinas e IIIb. A subclasse IIIa tem seu mecanismo de ação diferenciado das demais bacteriocinas, promovendo lise celular através da degradação da parede celular do micro-organismo alvo. A bacteriolisina melhor estudada é a lisostafina, um peptídeo de peso molecular de 27 kda, responsável pela hidrólise da parede celular de muitas espécies de Staphylococcus, principalmente S. aureus (BASTOS, COUTINHO; COELHO, 2010). A subclasse IIIb, em contraste, compreende os peptídeos que não causam lise, mas sim dissipação do potencial de membrana e diminuição da concentração intracelular de ATP. A helveticina J é exemplo desta subclasse. A utilização de bacteriocinas produzidas por BAL em alimentos é possível devido à certas características que estas apresentam, como: são reconhecidas como seguras (Generally Regarded As Safe - GRAS); não apresentam toxicidade às células eucarióticas e, geralmente, não são imunogênicas; são inativadas por proteases no trato gastrointestinal (TGI); em geral, apresentam tolerância a valores extremos de temperatura e ph; e, possuem espectro de ação antimicrobiano contra um grande número de bactérias (GÁLVEZ et al., 2007; TODOROV, 2009). Há, pelo menos, três maneiras pelas quais as bacteriocinas podem ser incorporadas em um alimento para melhorar a sua segurança: utilizando uma preparação purificada ou semipurificada da bacteriocina como ingrediente alimentar; pela incorporação de um ingrediente que foi anteriormente fermentado com uma BAL produtora de bacteriocina ou pela utilização de BAL produtora de bacteriocina diretamente no produto fermentado para produção da bacteriocina in situ (ARTHUR; CAVERA; CHIKINDAS, 2014; CHEN; HOOVER, 2003; GÁLVEZ et al., 2008). A aplicação das bacteriocinas na bioconservação dos alimentos oferece muitos benefícios, entre eles, o aumento da vida útil, redução do risco de veiculação de micro-organismos patogênicos, e a possibilidade de substituição

30 27 de conservantes químicos presentes em alguns alimentos (CASTELLANO et al., 2008; GÁLVEZ et al., 2007). Atualmente, somente a nisina (Nisaplin ), produzida por Lactococcus lactis, e a pediocina PA-1/AcH (ALTA TM 2431), produzida por Pediococcus acidilactici, são bacteriocinas aceitas como ingredientes comerciais para serem utilizados como bioconservantes em alimentos (COTTER; HILL; ROSS, 2005; GÁLVEZ et al., 2007; GÁLVEZ et al., 2008). No Brasil, a única bacteriocina aprovada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para uso em queijos fundidos, preparados à base de queijos fundidos, queijos pasteurizados e requeijão, com limite máximo de 12,5 mg.kg -1, é a nisina (ANVISA, 1996). No entanto, a aplicação direta de bacteriocinas em alimentos pode resultar na diminuição ou perda da atividade antimicrobiana devido a fatores como, o ph do alimento, interações com fosfolipídios e proteínas, baixa solubilidade ou mesmo a inativação por enzimas endógenas (ALVES et al., 2006; BROMBERG et al., 2006). Dessa forma, a encapsulação de BAL bacteriocinogênicas (BARBOSA et al., 2015a) e a aplicação de bacteriocinas em filmes biodegradáveis (MASSANI et al, 2012; 2014; MEIRA et al., 2014), tornam-se alternativas para garantir a atividade antimicrobiana das bacteriocinas em alimentos. Nas últimas décadas, o interesse por coberturas e filmes comestíveis e/ou biodegradáveis têm sido crescente devido a compatibilidade destes com o meio ambiente e a possibilidade de incorporação de agentes ativos, levando à uma maior segurança dos alimentos (BOTREL, 2007). Filmes antimicrobianos são uma forma de embalagem ativa que pode aumentar a vida útil dos produtos e fornecer segurança aos consumidores. Este tipo de embalagem visa reduzir, inibir ou retardar a multiplicação de microorganismos patogênicos e deteriorantes em alimentos (OJAGH et al., 2010). As embalagens antimicrobianas podem ser divididas em dois grupos: no primeiro, o agente antimicrobiano migra da embalagem para a superfície do produto e, no segundo, os agentes são efetivos contra a multiplicação microbiana superficial sem a necessidade de migração para o produto. Ou seja, o requisito necessário para o funcionamento da embalagem antimicrobiana é o intenso contato com o alimento, o que restringe o número de compostos a

31 28 serem utilizados na elaboração de filmes antimicrobianos, uma vez que estes não podem causar contaminação ou deixar resíduos no alimento (ANVISA, 2010; VERMEIREN; DEVLIEGHERE; DEBEVERE, 2002). Nesse sentido, as substâncias reconhecidas como seguras (GRAS) têm sido incorporadas em diferentes matrizes poliméricas para a produção de embalagens antimicrobianas, como o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (GÜÇBILMEZ et al., 2007), o ácido sórbico (CAGRI et al., 2001), o ácido benzóico e o ácido propiônico (MANAB et al., 2011). Além destas, a nisina (MEIRA et al., 2014) e outras bacteriocinas (MASSANI et al., 2012, 2014) apresentam grande potencial para aplicação em filmes ativos. 3.3 BAL como probióticos Etimologicamente, o termo probiótico é derivado da palavra grega Probios, e significa para a vida. Este termo foi utilizado pela primeira vez em 1965, por Lilly & Stillwell, para descrever substâncias secretadas por microorganismos e que estimulam o crescimento de outros micro-organismos (LILLY; STILLWELL, 1965). Desde então, outras definições foram atribuídas ao termo e, atualmente, segundo a Food and Agriculture Organization of the United Nations World Health Organization - probióticos são microorganismos vivos que ao serem administrados em quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). A recomendação de micro-organismos viáveis a serem ingeridos é baseada na porção diária do produto pronto para consumo, sendo o mínimo estipulado de 10 8 a 10 9 UFC por 100 gramas ou mililitro ao dia, para atender as concentrações fisiológicas (10 5 a 10 7 UFC.g -1 no conteúdo intestinal) (BRASIL, 2008; SAAD, 2006;). Além disso, é necessário que haja o consumo regularmente para que se mantenha o efeito desses micro-organismos sobre a composição da microbiota intestinal, já que a colonização não é permanente e sim transiente. De acordo com as atualizações de julho de 2008 da lista de alegações de propriedade funcional aprovadas da ANVISA, a quantidade mínima viável para os probióticos deve estar situada na faixa de 10 8 a 10 9 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) na recomendação diária do produto

32 29 pronto para o consumo, conforme indicação do fabricante, e deve ser declarada no rótulo, próximo à alegação da propriedade funcional (ANVISA, 2008). Entre os benefícios à saúde, atribuídos aos probióticos, podemos citar: a estabilização da microbiota intestinal após a utilização de antibióticos, maior resistência gastrointestinal à colonização por patógenos, devido a ação de seus metabólitos (ácido acético, lático, bacteriocinas, etc), estimulação do sistema imune, prevenção de diarreias e doenças inflamatórias do intestino (REIS et al., 2012; VASILJEVIC; SHAH, 2008). Estudos apontam, ainda, efeitos antimutagênicos, anticancerígenos, hipocolesterolêmicos, anti-hipertensivo, anti-osteoporose e imunomoduladores (CHIANG; PAN, 2012). Além disso, desempenham papéis importantes contra inflamações, alergias, doenças auto-imunes (KARIMI et al., 2009), estresse oxidativo (LAMBERTI et al., 2011; MANGIAPANE et al., 2014) e doenças cardiovasculares (PIGEON; CUEST; GILILLIAND, 2002). No entanto, esses benefícios à saúde fornecidos por probióticos são cepa específicos, portanto, nenhuma cepa probiótica será capaz de desempenhar todos esses benefícios simultaneamente, nem mesmo isolados de uma mesma espécie (FIGUEROA-GONZALEZ et al., 2011). Os tipos mais comuns de micro-organismos utilizados como probióticos são BAL, embora outras bactérias e certas leveduras também possam ser usadas (DIDARI et al., 2014), como Saccharomyces boulardii não patogênicas (MORROW et al., 2012) e, recentemente, Pichia pastoris, cuja capacidade probiótica e atividade antibacteriana contra Salmonela Typhimurium, foi demonstrada (FRANÇA et al., 2015). No entanto, apenas as cepas classificadas como BAL são consideradas de importância, no que diz respeito à alimentação e nutrição (HOLZAPFEL et al., 2001). Os principais representantes das bactérias probióticas pertencem aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium e as principais cepas encontradas em alimentos são L. rhamnosus GG (Valio ), L. casei Shirota (Yakult ); L. acidophilus NCFM (Rhodia ) e La- 5 e Lc-1 (Chr. Hansen ) (FAO/WHO, 2002; REIS et al., 2012; SANDERS, 2003).

33 30 As principais características que um micro-organismo deve apresentar para ser considerado como probiótico, incluem: sobrevivência, capacidade de multiplicação e adesão ao epitélio intestinal; suportar condições adversas, como a presença de sais biliares, suco gástrico, pancreático e entérico; ter efeito antagônico às bactérias prejudiciais; não ser toxigênico ou patogênico para o hospedeiro (HUANG; ADAMS, 2004; SCHILLINGER et al., 2005). Do ponto de vista tecnológico, deve ser cultivável em escala industrial, além de apresentar alta viabilidade e estabilidade no produto final (GOLDIN, 1998; FRANCO et al., 2006) Assim como para a aplicação de bacteriocinas, algumas estratégias têm sido empregadas visando aumentar a viabilidade de linhagens probióticas em situações adversas, como a utilização de células imobilizadas e técnicas de microencapsulação (DEL PIANO et al., 2006; SANZ, 2007).

34 31 4 Material e métodos 4.1 Amostras, cepas e condições de cultivo Foram utilizadas 137 isolados de BAL provenientes de queijo mussarela fatiado comercializado em mercados e minimercados na cidade de Pelotas, Rio Grande do Sul (RS), pertencentes a coleção de culturas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, da Universidade Federal de Pelotas (DCTA-FAEM-UFPel). Os isolados foram reativados em caldo Man, Rogosa e Sharpe (MRS) (Acumedia ) a 37 ºC por 24h e submetidos a um ciclo de purificação em ágar MRS a 37 ºC por 48h, sob anaerobiose. Os isolados purificados, com morfologia típica, Gram-positivos e catalase negativos, foram cultivados em caldo MRS (Acumedia ), a 37 ºC por 24h. Alíquotas de 1 ml dos cultivos foram acrescidas de 20 % de glicerol (Synth ) (v/v) e mantidas a - 80 ºC até o momento do uso (cultura estoque). Foram utilizadas cepas bacterianas padrão de BAL, bactérias Grampositivas e Gram-negativas de importância em alimentos e, L. monocytogenes isoladas de alimentos, as quais estão apresentados na tabela 1. Estas, foram mantidos sob refrigeração em tubos contendo ágar MRS (BAL) e ágar Triptona de Soja (TSA, Acumedia ) (demais micro-organismos).

35 32 Tabela 1 - Micro-organismos utilizados, condições de cultivo e origem Micro-organismo Condições de cultivo Origem Escherichia coli O157 H7 ATCC BHI, 37 ºC, aerobiose Escherichia coli ATCC BHI, 37 ºC, aerobiose Listeria monocytogenes ATCC 7644 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Listeria ivanovii ATCC TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Pseudomonas aeruginosa ATCC BHI, 37 ºC, aerobiose Salmonella Enteritidis ATCC BHI, 37 ºC, aerobiose American Type Salmonella Typhimurium ATCC BHI, 37 ºC, aerobiose Culture Collection Shigella dysenteriae ATCC BHI, 37 ºC, aerobiose Staphylococcus aureus ATCC BHI, 37 ºC, aerobiose Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 MRS, 37 ºC, aerobiose Lactobacillus plantarum ATCC 8014 MRS, 37 ºC, aerobiose Lactobacillus fermentum ATCC 9338 MRS, 37 ºC, aerobiose Lactobacillus brevis ATCC 367 MRS, 37 ºC, aerobiose Lactobacillus delbrueckii ATCC 3744 MRS, 37 ºC, aerobiose Listeria monocytogenes Scott A TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Food and Drug Administration Listeria monocytogenes SILIKEN TSB-YE, 37 ºC, aerobiose University of Tasmania Listeria innocua CLIP TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Listeria collection of Institute Pasteur Lactobacillus lactis subsp. lactis DY13 MRS, 37 ºC, aerobiose Gordons Bay, África do Sul Listeria monocytogenes L6P4 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Listeria monocytogenes L80P2 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Listeria monocytogenes L89P2 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Listeria monocytogenes L101P5 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Laboratório de Listeria monocytogenes L136P8 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Microbiologia de Listeria monocytogenes L137P2 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Alimentos DCTA- Listeria monocytogenes L164P5 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose FAEM-UFPel Listeria monocytogenes L167Q5 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Listeria monocytogenes L172P2 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Listeria monocytogenes L177P4 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose Listeria monocytogenes L190Q5 TSB-YE, 37 ºC, aerobiose TSB-YE: Caldo Tripticase de Soja (Acumedia ) com 0,6% de Extrato de Levedura (Himedia ); BHI: Caldo Brain Heart Infusion (Himedia ); MRS: Caldo de Man Rogosa & Sharpe (Acumedia ). 4.2 Identificação de isolados de BAL produtores de substâncias antimicrobianas Os isolados foram avaliados quanto a sua atividade antagonista e bacteriocinogênica, utilizando-se o cultivo puro e o sobrenadante livre de células (SLC), respectivamente, conforme descrito a seguir. A atividade antagonista foi avaliada através do método spot-on-the-lawn, de acordo com Fleming et al. (1975), com adaptações. Como controle positivo, foi utilizada a cepa Lactobacillus lactis subsp. lactis DY13 e, como microorganismo indicador, a cepa L. monocytogenes ATCC 7644.

36 33 A cepa L. monocytogenes ATCC 7644 foi recuperada em caldo Tripticase de Soja (Acumedia ) com 0,6 % de Extrato de Levedura (Himedia ) (TSB-YE) a 37 ºC por 24h, e quantificada a partir de diluições sucessivas e contagem das células, a fim de determinar e padronizar a quantidade necessária do micro-organismo indicador a ser utilizada nos ensaios (10 5 UFC.mL -1 ). Os isolados de BAL e a cepa de L. lactis foram incubados em caldo MRS (1% v/v) a 37 ºC por 24h e, uma alíquota de 2 μl do cultivo foi aplicada sobre placas de Petri contendo ágar MRS. Após a adsorção, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h, sob anaerobiose, para não haver produção de peróxido de hidrogênio. Decorridas as 24h, cada placa contendo os isolados recebeu uma sobrecamada de 10 ml de Brain Heart Infusion (BHI, Himedia ) semissólido (0,8 %) contendo, aproximadamente, 10 5 UFC.mL -1 de L. monocytogenes ATCC Após a solidificação do meio, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h, sob aerobiose. A presença de halos de inibição (zonas de transparência ao redor dos isolados de BAL) de 2 mm, foi considerada como indicadora de atividade antagonista em relação ao micro-organismo indicador (FURTADO, 2010). A medida do tamanho do halo foi realizada utilizando paquímetro Digimess. A atividade bacteriocinogênica dos isolados de BAL foi avaliada através do método de difusão em ágar descrito por Biscola et al. (2013), com modificações. Primeiramente, foi obtido o SLC dos isolados de BAL a partir dos cultivos em caldo MRS (1% v/v) a 37 ºC, por 24h. Os cultivos foram centrifugados a x g a 4 ºC, por 20min. Após, o sobrenadante de cada cultivo foi neutralizado (ph 7,0), utilizando-se solução de NaOH 1 N (Synth ), e aquecido a 80 C por 10min (TODOROV; DICKS, 2004a). Alíquotas de 20 µl de cada SLC dos isolados de BAL foram adicionadas sobre placas de Petri contendo ágar BHI com, aproximadamente, 10 5 UFC.mL -1 de L. monocytogenes ATCC Após a completa adsorção da alíquota pelo meio de cultura, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h. A presença de halo de inibição no meio foi considerada indicadora da produção de bacteriocina, caracterizando a capacidade bacteriocinogênica do isolado.

37 Perfil fermentativo A capacidade de fermentar glicose com produção de gás (CO2) foi determinada a partir do cultivo de 24h a 37 ºC em caldo MRS (1% v/v). Os isolados foram reinoculados (1 % v/v) em caldo MRS suplementado com 3 % de glicose (Synth ), em tubos de ensaio contendo tubos de Durhan e incubados a 37 ºC por 48h (LIMA et al., 2009). Lactobacillus fermentum ATCC 9338 e Lactobacillus plantarum ATCC 8014 foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente. Nos tubos em que se observou turbidez do meio e produção de gás, os isolados foram classificados como heterofermentativos, enquanto aqueles que apresentaram somente turvação do meio, foram classificados como homofermentativos. O ensaio foi realizado em duplicata Identificação fenotípica Isolados de BAL homofermentativos foram selecionados para a identificação fenotípica pelo sistema Vitek 2 (biomérieux), utilizando-se cartões GP Test Kit VTK 2 (Gram-positivos). O preparo do inóculo, incubação, leitura e interpretação dos resultados foram realizados conforme instruções do fabricante. Resumidamente, os isolados foram cultivados em caldo MRS a 37 ºC, por 24h e recuperados em placas de Petri contendo ágar MRS, incubadas a 37 ºC, sob anaerobiose, por até 24h. Em seguida, a densidade celular foi ajustada em solução salina (CareFusion ) a 0,43 %, em uma escala correspondendo a, aproximadamente, 0,61 a 0,63, em densímetro Densicheck (BioMerieux), para posterior aplicação nos cartões contendo 43 testes bioquímicos. Os cartões foram inoculados automaticamente por um sistema a vácuo, inseridos no módulo de incubação e leitura, e submetidos a uma medida cinética fluorescente a cada 15min. Os resultados foram armazenados em um sistema computadorizado, o qual, ao final da análise, emite um relatório com o resultado referente aos testes bioquímicos. O relatório apresenta, também, a

38 35 identificação do micro-organismo em nível de gênero e espécie, o tempo de análise e, quando necessário, provas bioquímicas adicionais para confirmação da identidade daqueles isolados nos quais houve um baixo poder discriminatório Identificação molecular Extração de DNA O DNA genômico dos isolados de BAL foi extraído conforme método adaptado a partir de Sambrook e Russell (2001). Primeiramente, 1,5 ml de um cultivo de 24h a 37 ºC em caldo MRS, de cada isolado, foi centrifugado por 5min a x g a temperatura ambiente. O pellet formado foi ressuspendido em 100 µl de tampão STES [Tris-HCl 0,2 M; NaCl 0,5 M; SDS 0,1 %; EDTA 0,01 M; ph 7,6] (Synth ) e, aproximadamente, 50 µg de pérolas de vidro (pérolas de zircônia/sílica 0,1 mm, BioSpec) e 100 µl de fenol-clorofórmio (1:1) (Synth ) foram adicionados à mistura, a qual foi homogeneizada e centrifugada nas mesmas condições anteriores. O sobrenadante coletado foi adicionado de etanol 100 % (Synth ) (2 vezes o volume inicial) e NaCl 5 M (Synth ) (0,1 uma vez o volume inicial) e a mistura foi incubada a - 20 C por 1h. Em seguida, foi realizada nova centrifugação a x g por 20min, o sobrenadante descartado, o pellet lavado 2 vezes em álcool 70 % (Synth ) e deixado secar a 37 C. O DNA foi, então, eluído em 30 µl de água ultrapura (Invitrogen ), adicionado 1 µl de RNAse (Invitrogen ), mantido a -20 ºC e quantificado em espectrofotômetro Eppendorf BioSpectrometer kinetic (Eppendorf) Amplificação por PCR e sequenciamento parcial do gene 16S rdna Os primers utilizados para amplificar uma porção da região codificadora do gene 16S rdna utilizando o DNA genômico de cada um dos isolados são descritos na tabela 2. Um fragmento de, aproximadamente, 252 pares de bases (pb) foi esperado após a amplificação por PCR.

39 36 Tabela 2 - Primers utilizados para identificação de bactérias ácido láticas Primers Sequência 5-3 pb Referência 16S1 GGACGGGTGAGTAACACGTGG 16S2 TCCCGTAGGAGTCTGGACCGT 252 Baron et al. (2004) Os primers utilizados foram desenhados por Baron et al. (2004) para identificação das espécies de Staphylococcus coagulase-positiva (S. aureus, S. hycus e S. intermedius) e tem como alvo uma região altamente conservada do gene RNA ribossomal 16S (rdna). Logo, para a reação, foram utilizados como controle positivo e negativo, as cepas S. aureus ATCC e Escherichia coli ATCC 11229, respectivamente. As reações foram realizadas em um volume final de 25 μl, contendo 12,5 μl de GoTaq Green Master Mix 2 X (Promega Corporation), 1 μl de cada primer (1 pmol), 2 μl de DNA genômico (50 ng) e 8,5 μl de água ultrapura. As reações foram realizadas em termociclador MJ Research PTC 100, sendo submetidas às etapas de desnaturação inicial (95 C, 4min) seguida de 32 ciclos de desnaturação (95 C, 2min), anelamento (52,7 C, 2min) e extensão (72 C, 2min). Ao término destes ciclos, a reação foi submetida a um ciclo de extensão final (72 C, 7min). Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5 % (Invitrogen ), visualizados sob luz UV em transiluminador (Loccus L-Pix Touch) e purificados utilizando o kit Illustra GFX PCR and gel Band Purification (GE Healthcare), de acordo com as orientações do fabricante. O sequenciamento das amostras foi realizado na Unidade de Análises Moleculares e de Proteínas (Centro de Pesquisa Experimental, HCPA), utilizando o equipamento ABI 3500 Genetic Analyzer com capilares de 50 cm e polímero POP7 (Applied Biosystems). Os produtos de PCR foram marcados utilizando-se 5,0 pmol do primer 16S1 5 -GGACGGGTGAGTAACACGTGG-3 e 1 µl do reagente BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) em um volume final de 10 µl. As reações de marcação foram realizadas em termociclador Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) com uma etapa de desnaturação inicial a 96 ºC por 1min, seguida de 35 ciclos de 96 ºC por 15s, 50 ºC por 15s e 60 ºC por 4min. Após marcadas,

40 37 as amostras foram purificadas pela precipitação com BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems) e eletroinjetadas no sequenciador automático. O programa Contig Express foi usado para geração dos contigs. A identificação da espécie foi realizada através de busca e alinhamento de sequências homólogas no GenBank utilizando a ferramenta BLAST ( 4.3 Caracterização de isolados produtores de substância antimicrobiana Avaliação fenotípica de motilidade Após cultivo em caldo MRS (1% v/v) durante 24h a 37 ºC, o isolado foi inoculado em tubos de ensaio contendo 4 ml de ágar Motilidade (Difco ). Os tubos foram incubados a 35 ºC, e a multiplicação celular observada entre 24 e 48h de incubação. O ensaio foi realizado em duplicata Avaliação da suscetibilidade a antimicrobianos A suscetibilidade a antimicrobianos foi avaliada pelo teste de difusão em ágar Müller-Hinton (MH, Oxoid ), realizado de acordo com as normas do documento M100-S22 do Clinical and Laboratory Stardards Institute (CLSI, 2012). Após o cultivo em ágar MRS a 37 ºC por 24h, o isolado de BAL foi repicado para solução salina 0,85% até atingir turbidez equivalente a 0,5 na escala de McFarland. Em seguida, com o auxílio de swab, a cultura foi semeada em ágar MH e foram adicionados os discos impregnados com diferentes tipos de antimicrobianos. Foram utilizados 10 agentes antimicrobianos: amicacina (30 µg), ampicilina (10 µg), cloranfenicol (30 µg), estreptomicina (10 µg), eritromicina (15 µ), gentamicina (10 µg), penicilina G (10U), sulfametoxazol-trimetoprim (25 µg), tetraciclina (30 µg) e vancomicina (30 µg) (Laborclin ). Após, as placas foram incubadas a 37 ºC por 24h e os diâmetros das zonas de inibição foram medidos utilizando-se paquímetro

41 38 Digimess e expressos em milímetros. Os resultados foram expressos como isolado resistente ( 15mm), sensibilidade intermediária (16 20mm) ou sensível ( 21mm), conforme descrito por Liasi et al. (2009) Avaliação do potencial probiótico Tolerância ao trato gastrointestinal de forma simulada A resistência à passagem do trato gastrointestinal foi avaliada de forma simulada, sendo realizada conforme Huang e Adams (2004). Primeiramente, foi realizada a ativação do isolado de BAL a partir do cultivo em 5 ml de caldo MRS, com posterior passagem para 10 ml de caldo MRS e incubação a 37 ºC, por 24h cada. O cultivo foi então centrifugado a x g por 10min, a 4 ºC, e o pellet obtido, lavado duas vezes com Tampão Fosfato Salina (PBS, Laborclin ), com posterior ressuspensão em solução salina a 0,5 %. Uma alíquota de 200 µl da suspensão celular foi misturada em 300 µl de solução salina e à 1 ml de suco gástrico ou suco intestinal simulado, com posterior incubação à 37 ºC. O suco gástrico simulado consistiu de 3 mg.ml -1 de pepsina (Sigma- Aldrich ) e ph 2,5, enquanto o suco intestinal foi composto por 1 mg.ml -1 de pancreatina (Sigma-Aldrich ) e ph 8,0. A influência da presença de um alimento na sobrevivência do isolado à passagem do trato gastrointestinal de forma simulada, foi avaliada substituindo a solução salina por 300 µl de leite integral, reconstituído a 10 % (m/v) e, a influência da presença de sais biliares na sobrevivência à passagem do trato intestinal de forma simulada, foi avaliada pela adição de 0,5 % de bile bovina (Sigma-Aldrich ) ao suco intestinal. A contagem do número de células viáveis durante a passagem pelo trato gástrico foi realizada nos tempos 0, 15, 30, 60, 120, 180 e 240min, enquanto a contagem à passagem pelo trato intestinal, foi realizada nos tempos 0, 60, 120, 180 e 240min, em placas de Petri contendo ágar MRS.

42 Capacidade de autoagregação, coagregação e hidrofobicidade A capacidade de autoagregação e coagregação foi avaliada conforme metodologia descrita por Collado, Meriluoto, Salminen (2008). As suspensões celulares utilizadas nos ensaios foram obtidas a partir de cultivo do isolado em caldo MRS, e de L. monocytogenes ATCC Scott A (micro-organismo indicador) em BHI, ambos a 37 ºC, por 24h. Os cultivos foram centrifugados a x g por 10min, a 4 ºC, e os pellets lavados duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram ressuspendidas em solução salina 0,5 % e a absorbância (600 nm) foi ajustada a 0,25 ± 0,02. A autoagregação foi determinada a partir da leitura da absorbância (600 nm) das suspensões celulares, denominada suspensão bacteriana total e, após 2h, 20h e 24h de incubação a 37 ºC, denominadas de suspensão superior. Os resultados foram expressos em percentual, conforme a fórmula a seguir: % autoagregação = 1 (As/At) x 100 Onde: As = absorbância da suspensão superior; At = absorbância da suspensão total. Para determinar a capacidade de coagregação, suspensões celulares do isolado de BAL e L. monocytogenes Scott A foram preparadas conforme descrito acima, incubadas a 37 ºC isoladamente (controles) e, em igual proporção do isolado e do patógeno (1:1). A leitura da absorbância (600 nm) foi realizada nos tempos 0, 2h, 4h e após 24h de incubação. Os resultados foram expressos em percentual, conforme a fórmula a seguir: % coagregação = [(At0) (Atx)/(At0)] x 100

43 40 Onde: At0 = absorbância das suspensões bacterianas no tempo inicial (zero); Atx = absorbância das suspensões bacterianas nos diferentes tempos avaliados (2h, 4h e 24h). A avaliação de hidrofobicidade foi realizada utilizando iso-octano (Vetek ) para determinar a adesão bacteriana ao hidrocarboneto, conforme descrito por Vinderola e Reinhemer (2003). Para isso, a suspensão celular (3 ml) do isolado foi agitada em vórtex por 1min com 400 µl de iso-octano. Depois de 2h a 37 ºC a fase aquosa foi cuidadosamente removida e realizada a leitura da absorbância (600 nm). A hidrofobicidade foi determinada como percentual de adesão, conforme a fórmula a seguir: % hidrofobicidade: [(A0 A)/A] x 100 Onde: A0 = absorbância antes da extração com iso-octano; A = absorbância depois da extração com iso-octano Avaliação da atividade da enzima β-galactosidase A atividade da enzima β-galactosidase foi determinada de acordo com Vinderola e Reinheimer (2003), com modificações. Primeiramente, foi realizada a ativação do isolado conforme descrito no item , a partir do cultivo em 5 e 10 ml de caldo MRS sucessivamente, o qual foi utilizado como pré-inóculo para o teste. Cultivo de 24h a 37 ºC em caldo MRS adicionado de lactose (1% v/v), foi centrifugado a x g, por 5min a 4 ºC e o pellet lavado duas vezes com PBS. As células foram ressuspendidas em PBS e a absorbância (560 nm) ajustada para 1,0. Em seguida, 1 ml da suspensão celular foi permeabilizada com 50 µl de solução de tolueno:acetona (Synth ) (1:9 v/v), através de agitação por 7min, utilizando vórtex. Após, 100 µl da suspensão permeabilizada foi adicionada a 900 µl de tampão fosfato e 200 µl de o-

44 41 nitrophenyl-β-d-galactopyranoside (4 mg.ml -1 ) (ONPG, Sigma-Aldrich ). A mistura foi mantida em banho-maria a 37 ºC por 15min e a reação foi paralisada pela adição de 500 µl de Na2CO3 1 mol.l -1. Os valores de absorbância foram medidos a 420 e 560 nm, e os resultados expressos como unidades Miller, conforme a fórmula a seguir: Atividade β-galactosidase = 1000 x [(A420 1,75x A2560)/(15min x 1mL x A1 560)] Onde: A1 = absorbância imediatamente antes e A2 a densidade das células da reação Capacidade de adesão de L. monocytogenes ATCC 7644 e do isolado de BAL a células intestinais HCT Cultura de células HCT-116 Células intestinais HCT-116 foram obtidas da coleção de células do Laboratório de Imunologia Aplicada do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTEc) - UFPel. As células foram cultivadas em Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma-Aldrich ) suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB, Sigma-Aldrich ) (DMEM + SFB) e mantidas a 37 ºC em atmosfera úmida com 5 % de CO2. Placas para cultivo celular com 24 cavidades foram semeadas com 10 6 células por cavidade. As placas foram incubadas nas condições descritas acima, até atingirem confluência de 90 %. As células aderidas à placa foram utilizadas nos experimentos de adesão e competição.

45 Ensaio de adesão a células HCT-116 O ensaio de adesão foi realizado segundo Garriga et al. (2015), com modificações. Cultivos de 18h a 37 ºC do isolado de BAL e de L. monocytogenes ATCC 7644 em caldo MRS e TSB-YE, respectivamente, foram centrifugados a x g por 3min. Os pellets foram lavados 3 vezes com PBS esterilizado, ph 7,4, e ressuspendidos em 1 ml de PBS (10 9 UFC.mL -1 ). Uma alíquota de 100 µl foi utilizada para quantificação do inóculo inicial a partir de diluições seriadas (base 10) em placas de TSA para L. monocytogenes ATCC 7644 e MRS para a BAL (37 ºC por 24h a 48h). Outra alíquota de cada uma das suspensões (100 µl) foi adicionada a 900 µl de DMEM (concentração final de 10 7 UFC.mL -1 ) e foi aplicado 100 µl por cavidade, em triplicata. Após 1h de incubação a 37 ºC, o meio de cultura foi removido e as cavidades foram lavadas três vezes com meio DMEM para remoção das células não aderidas. Após, 100 µl de PBS contendo 0,1% (v/v) de Triton X-100 (Synth ) foram adicionados às cavidades e mantidos por 5min a 37 ºC. Por fim, os 100 µl foram removidos, diluídos em série decimal e a quantificação realizada em triplicata, utilizando-se os meios e condições de incubação descritos acima. Os resultados foram expressos em porcentagem de adesão às células intestinais HCT-116, conforme a fórmula a seguir: % adesão = Número de células do micro-organismo aderidas x 100 Número total de células do micro-organismos adicionadas por poço Ensaio de competição a células HCT-116 O ensaio de competição foi realizado segundo Garriga et al. (2015), com modificações.. As condições de cultivo, preparo das suspensões celulares e diluições decimais seriadas foram realizadas nas mesmas condições descritas para o ensaio de adesão celular. Em seguida, 100 µl da cultura de L. monocytogenes ATCC 7644 (10 7 UFC.mL -1 ) e 100 µl da cultura do isolado (10 7 UFC.mL -1 ) foram adicionados de forma concomitante às cavidades da placa para cultivo celular contendo a cultura de células HCT-116. A partir dessa

46 43 etapa, o ensaio foi realizado conforme o item , exceto pela semeadura em placas de ágar Cromogênio (Oxoid ), para enumeração de L. monocytogenes ATCC 7644, e em MRS para o isolado de BAL, com incubação a 37 ºC por 48h. Os resultados foram expressos em porcentagem, conforme fórmula apresentada no item anterior. 4.4 Caracterização da substância antimicrobiana Obtenção do sobrenadante livre de células (SLC) e determinação da atividade antimicrobiana O SLC do isolado de BAL foi obtido a partir do cultivo em 50 ml de caldo MRS, utilizando-se 1 % (v/v) da cultura estoque, seguido de incubação a 37 ºC por 24h. O cultivo foi centrifugado a x g a 4 ºC, por 20min, o sobrenadante neutralizado (ph 6,0), utilizando-se solução de NaOH 1 N (Synth ) e esterilizado por membrana (0,22 µm)para realização dos testes descritos a seguir (TODOROV; DICKS, 2004a). A atividade da substância antimicrobiana presente no SLC foi quantificada pelo método de diluição crítica (MAYR-HARTING; HEDGES; BERKELEY, 1972), na proporção 1:1 em PBS. A determinação foi realizada utilizando-se o método de difusão em ágar, conforme descrito por Biscola et al. (2013). Foram adicionados 5 µl do sobrenadante bruto e diluído sobre ágar BHI previamente inoculado com L. monocytogenes ATCC 7644 (microorganismo indicador), na concentração de 10 5 UFC.mL -1. As placas de Petri foram incubadas a 37 ºC por 18h. Após esse período, as placas foram analisadas quanto à formação de halos de inibição. A atividade antimicrobiana foi expressa em unidades arbitrárias por ml (UA.mL -1 ), calculada conforme fórmula abaixo e, 1 UA.mL -1 definida como a maior diluição capaz de produzir halos de inibição 2 mm de diâmetro (IVANOVA et al., 1998). O ensaio foi realizado em duplicata.

47 44 UA.mL -1 = 1000 x D V Onde: D = fator de diluição (maior diluição que produziu halo de inibição); V = volume do SLC (µl) Determinação do espectro de atividade antimicrobiana O espectro de atividade antimicrobiana do SLC do isolado de BAL foi determinado utilizando o método de difusão em ágar (BISCOLA et al., 2013), empregando-se como micro-organismos indicadores aqueles listados na tabela 1. Foram adicionados 5 µl do SLC sobre o ágar MRS para BAL e ágar BHI para as demais bactérias, previamente inoculados com o micro-organismo indicador (1 % v/v), os quais foram incubados a 37 ºC por 18h. Após esse período, as placas de Petri foram analisadas quanto à formação de halos de inibição e a atividade antimicrobiana expressa em unidades arbitrárias por ml (UA.mL -1.). O ensaio foi realizado em duplicata Avaliação da natureza da substância antimicrobiana O SLC foi submetido ao teste de sensibilidade enzimática, para determinação da natureza proteica da substância antimicrobiana. Foi adicionado, individualmente, 1 mg.ml -1 das enzimas catalase, proteinase k, tripsina, pepsina, quimotripsina (Sigma-Aldrich ) à 1 ml do SLC. Após, incubou-se a 37 ºC por 30min e, posteriormente, a 95 ºC por 5min, para inativação enzimática. A estabilidade da substância antimicrobiana presente no SLC tratado com as enzimas foi avaliada pelo método de diluição crítica e empregando-se o método de difusão em ágar (BISCOLA et al., 2013), utilizando L. monocytogenes ATCC 7644 como micro-organismo indicador. SLC sem tratamento foi utilizado como controle positivo, para determinação da atividade antimicrobiana residual, conforme fórmula apresentada abaixo. As

48 45 placas de Petri contendo ágar MRS foram incubadas a 37 C, por 18h. O ensaio foi realizado em duplicata. % atividade antimicrobiana residual = HT x 100 HC Onde: HT = Halo do SLC após tratamento (mm); HC = Halo do SLC sem tratamento (mm) Avaliação da estabilidade da substância antimicrobiana na presença de agentes químicos e em diferentes valores de ph e temperatura A ação dos agentes químicos sob a estabilidade da substância antimicrobiana foi analisada pela adição de 10 % (v/v ou m/v) de Tween 20, Tween 80, Triton X-100, Triton X-114, SDS, uréia, NaCl, álcool, glicerol e acetona (Synth ) à alíquotas de 1 ml de SLC. Os mesmos foram incubados a 37 ºC por 1h (TODOROV et al., 2010). O efeito do ph foi avaliado ajustando-se alíquotas de 1 ml do SLC para ph 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 e 10,0, com adição de solução de HCl 1 M ou NaOH 1 M, seguido de incubação a 37 ºC por 1h (TODOROV et al., 2010). A estabilidade da substância antimicrobiana em diferentes temperaturas foi avaliada incubando-se alíquotas de 1 ml do SLC a 30 ºC, 37 ºC, 45 ºC, 60 ºC, 80 ºC e 100 ºC por 1h e 121 ºC por 15min (TODOROV et al., 2010). Decorridos os períodos de incubação de cada uma das análises, o ph das amostras foi corrigido para 6,0 pela adição de solução de HCl 1 M ou NaOH 1 M e a atividade antimicrobiana dos SLC avaliada conforme descrito no item Cada um dos ensaios foi realizado em duplicata e, como controle positivo, foi utilizado SLC sem nenhum tratamento.

49 Avaliação de genes codificadores de bacteriocinas O DNA genômico do isolado de BAL, obtido conforme método adaptado a partir de Sambrook e Russell (2001), descrito no item , foi utilizado como molde para a avaliação da presença de genes codificadores de bacteriocinas por PCR. As reações foram realizadas em um volume final de 25 μl, contendo 12,5 μl de GoTaq Green Master Mix 2 X (Promega Corporation), 1 μl de cada primer (1 pmol), 2 μl de DNA genômico (50 ng) e 8,5 μl de água ultrapura. Os primers e as condições da PCR estão apresentados na tabela 3. As reações foram realizadas em termociclador MJ Research PTC 100, totalizando 35 ciclos e os produtos da PCR analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5 % (Invitrogen ), visualizados sob luz UV em transiluminador (Loccus L-Pix Touch) e purificados utilizando o kit Illustra GFX PCR and gel Band Purification (GE Healthcare), de acordo com as orientações do fabricante. O sequenciamento e alinhamento das amostras foram realizados conforme apresentado no item , a fim de confirmar a identidade do fragmento obtido.

50 47 Tabela 3 - Primers, condições da PCR utilizados na identificação de genes codificadores de bacteriocinas Bacteriocina Primers Sequência Fragmento (pb) Condições PCR Sakacina Tα SakT-alfa F TCGGTGGCTATACTGTCTAAACA 95ºC por 15min; 95ºC por 30s; 160 SakT-alfa R TGTCCTAAAAATCCACCAATGC 58ºC por 1min; 72ºC por 1min Sakacina T SakT-beta F AAGAAATGATAGAAATTTTTGGAGG 95ºC por 15min; 95ºC por 30s; 151 SaKt -beta R TGTGAAATCCAATCTTGTCCTG 56ºC por 1min; 72ºC por 1min Sakacina P SakP F ATGGAAAAGTTTATTGAATTA 94ºC por 3min; 94ºC por 30s; 186 SakP R TTATTTATTCCAGCCAGCGTT 40ºC por 1min; 72ºC por 1min Sakacina G1 SakGA1 F TTAGAACTACACTGATCGTG 94ºC por 4min; 94ºC por 30s; SakGA1 R TGGAAGAATGAGTACTTGTT 38ºC por 30s; 72ºC por 30s Sakacina G2 SakGA2 F CGTTACAACAGAACTTCAAG 94ºC por 4min; 94ºC por 30s; SakGA2 R CGTTACAACAGAACTTCAAG 38ºC por 30s; 72ºC por 30s Curvacina A CurvA F GTAAAAGAATTAAGTATGACA 94ºC por 3min; 94ºC por 30s; 171 CurvA R TTACATTCCAGCTAAACCACT 40ºC por 1min; 72ºC por 1min Sakacina A SakA F GAATATAGCAACANCAATTACTACGGTGG 95ºC por 15min; 95ºC por, 30s; 150 SakA R CAGCCGCTAATCATACCACC 55ºC por 1min; 72ºC por 1min Referência Macwana and Muriana, 2012 Macwana and Muriana, 2012 Reminger et al., 1996 Todorov et al., 2011 Todorov et al., 2011 Reminger et al., 1996 Dortu et al., 2008

51 Cinética de produção da substância antimicrobiana A cinética de produção da substância antimicrobiana produzida pelo isolado de BAL foi avaliada em duas temperaturas, 30 ºC e 37 ºC. Um cultivo em caldo MRS de 24h a 37 ºC do isolado de BAL, foi adicionado (1 % v/v) a 100 ml de caldo MRS (ph 6,5), com posterior incubação a 30 ºC e 37 ºC, sob agitação (100 rpm). Alíquotas de 2 ml foram retiradas nos tempos 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36 e 48h, para determinação do ph, multiplicação microbiana e quantificação da atividade antimicrobiana. A multiplicação microbiana foi monitorada por contagem do número de células viáveis em placas de Petri contendo ágar MRS. Para a determinação da atividade antimicrobiana, foi utilizado o método de difusão em ágar, conforme descrito no item O ph foi monitorado utilizando-se fita medidora de ph universal. O experimento foi realizado em duplicata com três repetições Efeito da substância antimicrobiana sobre a multiplicação de L. monocytogenes A capacidade de inibir a multiplicação celular bacteriana pela substância antimicrobiana presente no SLC do isolado de BAL foi avaliada segundo metodologia descrita por TODOROV (2009). Cultivo de 24h a 37 ºC de L. monocytogenes ATCC 7644 em caldo BHI (concentração final entre 10 6 e 10 7 UFC.mL -1 ) foi reinoculado (1% v/v) em 50 ml de caldo BHI e incubado a 37 ºC, por 3h (fase exponencial). Nesse momento, 10 ml do SLC (6.400 UA.mL -1 ) foram adicionados ao cultivo e este foi mantido a 37 ºC. O número de células viáveis de L. monocytogenes ATCC 7644 foi determinado de hora em hora, durante 6h, por contagem em placas de Petri contendo ágar TSA. Como controle positivo, utilizou-se a cultura do micro-organismo indicador sem a adição do SLC. O ensaio foi realizado em duplicata.

52 Avaliação da toxicidade da substância antimicrobiana em Modelo de Drosophila melanogaster A avaliação da toxicidade da substância antimicrobiana produzida pelo isolado de BAL, utilizando como modelo a mosca Drosophila melanogaster, foi realizada de acordo com metodologia descrita por SUDATI et al. (2013) Cultura de D. melanogaster D. melanogaster (linhagem Harwich), provenientes do Laboratório de Avaliações Farmacológicas e Toxicológicas Aplicadas às Moléculas Bioativas, da Universidade Federal do Pampa (Laftambio UNIPAMPA) foram utilizadas para avaliação da toxicidade da substância antimicrobiana presente no SLC do isolado LC254. As moscas foram mantidas em incubadora de Demanda Bioquímica de Oxigênio (BOD), ciclo claro/escuro 12h (25 C ± 1 C; 60 % de umidade), alimentadas em meio padrão do laboratório, composto por 1% de farinha de milho, 1% de levedura, 1% de germe de trigo, 2% de sacarose, 1% de leite em pó e 0,08% de nipagin (Sigma-Aldrich ) Protocolo de tratamento Moscas fêmeas, com 3 a 5 dias de idade, foram divididas em 7 grupos, contendo 25 moscas cada: (1) controle sem adição de SLC, (2) SLC 10 UA.mL - 1, (3) SLC 20 UA.mL -1, (4) SLC 500 UA.mL -1, (5) SLC UA.mL -1, (6) SLC UA.mL -1 e (7) SLC UA.mL -1. Cada grupo foi exposto ao tratamento durante 7 dias. A dieta, durante este período, consistiu de 2% de sacarose, 1% de leite em pó, 1% de ágar, 0,08% nipagin e SLC, em diferentes concentrações, exceto para o grupo controle A taxa de sobrevivência foi avaliada por contagem diária do número de moscas vivas até ao final do período experimental (7 dias). O ensaio foi realizado em triplicada.

53 Avaliação da atividade antimicrobiana de filmes biodegradáveis incorporados de SLC de isolado de BAL Material Foi testada a incorporação do SLC do isolado de BAL em filmes biodegradáveis de diferentes matrizes poliméricas. O SLC foi obtido a partir do cultivo do isolado em caldo MRS a 37 ºC por 24h, conforme descrito no item O SLC também foi liofilizado por 48h a 25 ºC, 1,33 Pa (Edwards). Foram elaborados filmes de amido (com e sem adição de Tween 20), de amido e celulose, e de zeína. Para a obtenção do amido foi utilizada batata inglesa adquirida no comércio local. Foi utilizada a celulose extraída de casca de arroz cultivar IRGA 417 e a zeína comercial (Z3625, Sigma-Aldrich ) Extração de amido O amido de batata foi isolado de acordo com Liu et al. (2003). As amostras de batata, da cultivar Baronesa (Solanum tuberosum L.), foram descascadas e imersas em bissulfito de sódio a 0,1% na proporção de 1:7 (p/v) por 2h. As batatas, dispersas na solução de bissulfito, foram trituradas em liquidificador doméstico, com adição de água destilada, por 5min e o material obtido foi filtrado em tecido de algodão e em peneira com abertura de 200 mesh, respectivamente. O material retido na peneira foi ressuspendido em água, sendo este processo repetido três vezes. Após, foi realizada uma etapa de decantação por 5h. O amido decantado foi seco em estufa com circulação forçada de ar a 40 C, até atingir 10% de umidade.

54 Elaboração de filmes biodegradáveis Elaboração de filmes de amido incorporados com SLC de isolado de BAL Os filmes foram elaborados utilizando a técnica de casting. As soluções filmogênicas (SF) foram compostas por 3 g de amido.100 ml -1 de água destilada, 0,3 g de glicerol.g -1 de amido seco e diferentes concentrações do SLC (líquido e liofilizado), as quais são apresentadas na tabela 4. O amido e o glicerol foram suspensos em água e aquecidos em banhomaria a 85 ºC por 5min. Após, procedeu-se o resfriamento a 50 ºC e adição do SLC líquido ou liofilizado, de acordo com a formulação da SF. Quando adicionado o SLC liofilizado, a SF foi submetida a agitação em ultraturrax a rpm durante 5min. Em seguida, 20 g de cada SF foi espalhada em placas de Petri acrílicas de 9 cm de diâmetro e mantidas em estufa de circulação de ar a 35 ºC por 24h. Após a secagem, os filmes foram acondicionados em ambiente com umidade relativa de 75 ± 5 % para posterior análise. Tabela 4 - Formulações de soluções filmogênicas elaboradas com diferentes concentrações de sobrenadante livre de célula de isolado de bactéria ácido lática e diferentes matrizes poliméricas Formulação Formulação básica SLC Tween 20 Agitação* A Amido de batata 0,25 g (liofilizado) Sem Com B Amido de batata 0,50 g (liofilizado) Sem Com C Amido de batata + celulose 0,25 g (liofilizado) Sem Com D Amido de batata + celulose 0,50 g (liofilizado) Sem Com E Amido de batata 10 ml (líquido) Sem Sem F Amido de batata 20 ml (líquido) Sem Sem G Zeína 10 ml (líquido) Sem Sem H Zeína 0,50 g (liofilizado) Sem Sem I Amido de batata 10 ml (líquido) Com Sem J Amido de batata 20 ml (liquido) Com Sem * Ultraturrax rpm

55 Elaboração de filmes de amido incorporados com SLC de isolado de BAL com adição de Tween 20 Os filmes foram elaborados utilizando a técnica de casting. As SF foram compostas por 3 g de amido.100 g -1 de água destilada, 0,3 g de glicerol.g -1 de amido seco e 100 µl de Tween 20 e diferentes concentrações do SLC (líquido e liofilizado), as quais são apresentadas na tabela 4. O amido, o glicerol e o Tween 20 foram suspensos em água e aquecidos em banho-maria a 85 ºC por 5min. Após, procedeu-se o resfriamento a 50 ºC e adição do SLC líquido de acordo com a formulação da SF. Em seguida, 20 g de cada SF foi espalhada em placas de Petri acrílicas de 9 cm de diâmetro e mantidas em estufa de circulação de ar a 35 ºC por 24h. Após a secagem, os filmes foram acondicionados em ambiente com umidade relativa de 75 ± 5 % para posterior análise Elaboração de filmes de amido e celulose incorporados com SLC de isolado de BAL Os filmes foram elaborados utilizando a técnica de casting. As SF foram compostas por 3 g de amido.100 g -1 de água destilada, 0,3 g de glicerol.g -1 de amido seco, 0,05 g de celulose.100 g -1 de amido seco, goma guar 0,01 g/g de amido seco (para evitar a sedimentação de fibras) e diferentes concentrações do SLC liofilizado, as quais são apresentadas na tabela 4. As fibras de celulose e a goma-guar foram suspensas em água, submetidas a agitação em ultraturrax a rpm durante 10min e, após, adicionado à esta solução, o amido e o glicerol. As SF foram aquecidas em banho maria a 85 ºC durante 5min, com posterior resfriamento a 50 ºC, adição do SLC liofilizado e homogeneização em ultraturrax a rpm por 5min. Em seguida, 20 g de cada SF foi espalhada em placas de acrílico de 9 cm de diâmetro e secas em estufa com circulação de ar a 35 C por 24h. Após a secagem, os filmes foram acondicionados em ambiente com umidade relativa de 75 ± 5 % para posterior análise.

56 Elaboração de filmes de zeína incorporados com SLC do isolado de BAL Os filmes à base de zeína foram elaborados utilizando o método descrito por Chen et al. (2014), com modificações. As SF foram compostas por 10 g de zeína.100 g -1 de solução etanólica 70%, 3 g de glicerol e diferentes concentrações do SLC (líquido e liofilizado) as quais são apresentadas na tabela 4. A zeína, o glicerol e o SLC foram suspensos em solução etanólica, homogeneizados com bastão de vidro e aquecidos em banho-maria a 60 ºC por 10min de acordo com a formulação da SF. Em seguida, 20 g de cada SF foi espalhada em placas de Petri acrílicas de 9 cm de diâmetro e mantidas em estufa de circulação de ar a 39 ºC por 2h e, posteriormente, a 30 ºC por 16h. Após a secagem, os filmes foram acondicionados em ambiente com umidade relativa de 75 ± 5 % para posterior análise Avaliação da atividade antimicrobiana dos filmes incorporados com SLC do isolado de BAL A atividade antimicrobiana do SLC líquido, liofilizado e dos filmes incorporados com o SLC do isolado de BAL foi determinada utilizando-se o método de difusão em ágar (BISCOLA et al., 2013). Para determinação da atividade antimicrobiana do SLC liofilizado, o mesmo foi ressuspendido em PBS na concentração de 1 mg.ml -1. Primeiramente, os filmes foram assepticamente cortados em círculo, de cerca de 8 mm de diâmetro, e expostos à luz ultravioleta (UV) em capela de fluxo laminar, durante 30min, para esterilização (CAGRI et al., 2001). Em seguida, os filmes foram adicionados à superfície de placas de Petri contendo ágar BHI, previamente inoculado com L. monocytogenes ATCC 7644 (micro-organismo indicador), na concentração de 10 5 UFC.mL -1. Como controle positivo, foi utilizado o SLC puro. As placas foram incubadas a 37 C por 18h e, após esse período, analisadas quanto à formação de halos de inibição, expressos em mm, como a média de duas medições.

57 54 A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada nos tempos 1, 3, 6 e 10 dias, a fim de verificar a estabilidade da atividade antimicrobiana ao longo do tempo. Os filmes foram armazenados a temperatura ambiente e umidade relativa de 75 %. 4.6 Análise estatística Os resultados dos dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), teste de Tukey e teste de Dunnet utilizando o programa Statistica (Statsoft versão ). Em todas as análises foi considerado nível de significância P 0,05.

58 55 5 Resultados e discussão 5.1 Isolados de BAL produtores de substâncias antimicrobianas Dos137 isolados de BAL utilizados neste estudo provenientes de queijo mussarela fatiado, 105 foram capazes de inibir a multiplicação de L. monocytogenes ATCC 7644, quando avaliados pelo método spot-on-the-lawn, demonstrando a atividade antagonista desses isolados, cujos halos de inibição variaram entre 4 e 25 mm. Estes resultados sugerem que a atividade antimicrobiana dos isolados de BAL, possivelmente, está associada à ação do ácido lático produzido por estas bactérias, uma vez que o método spot-on-thelawn utiliza o cultivo puro. Em geral, a produção de ácido lático é uma característica essencial de BAL e um dos principais mecanismos pelos quais estas bactérias inibem outros micro-organismos (REQUENA, 1995; HELANDER et al., 1997). No entanto, a quantidade de ácido lático produzida é dependente da estirpe (SORIA; AUDISIO, 2014), o que justificaria a diferença de tamanho dos halos de inibição apresentado pelos isolados. Além disso, é importante considerar que muitas BAL possuem genes que codificam substâncias antimicrobianas, como as bacteriocinas, os quais podem não ser expressos, dependendo das condições ambientais (CHEN; HOOVER, 2003; GÁLVEZ et al., 2007), ou ocorrer mutações, que podem eliminar ou inativar esses genes, resultando em perda da atividade antimicrobiana (HOOVER; STEENSON, 1993). Quando avaliada a atividade antimicrobiana dos isolados de BAL, através da técnica de difusão em ágar, somente um isolado, identificado geneticamente como L. curvatus e denominado de LC254, apresentou

59 56 atividade. Esta pode ser devida a produção de peptídeos antimicrobianos ou compostos semelhantes a bacteriocinas, visto que a atividade foi mantida mesmo após a neutralização do sobrenadante livre de células. Diversos estudos têm sido realizados a fim de identificar BAL com atividade antimicrobiana oriundas de diferentes fontes, no entanto, tem-se observado que dentre estas, o número de BAL com atividade bacteriocinogênica é consideravelmente pequeno (MURUA et al., 2013; MIGAW et al., 2014; PERIN; NERO, 2014; RIBEIRO et al., 2014; CASABURI et al., 2016), o que corrobora os dados obtidos no presente trabalho. 5.2 Perfil fermentativo Dos 105 isolados de BAL que apresentaram atividade antimicrobiana, 67 foram selecionados e avaliados quanto a capacidade de fermentação da glicose com produção de gás. Verificou-se que 91,04 % (n = 61) dos isolados foram classificados como homofermentativos, que são aqueles microorganismos que produzem ácido lático como o principal produto da fermentação da glicose, enquanto 8,96 % (n = 6) isolados foram heterofermentativos, ou seja, produzem, além do ácido lático, dióxido de carbono (PARADA et al., 2007). Hermanns (2013) isolou e identificou BAL com características bacteriocinogênicas e probióticas de leite e queijos artesanais da região noroeste do Rio Grande do Sul, e obteve 21 isolados, todos homofermentativos. Por causa de suas diferentes características fermentativas, BAL têm sido utilizadas para melhorar a textura e as propriedades sensoriais dos alimentos especialmente na fabricação de produtos fermentados (FONDÉN et al., 2000; D SOUZA et al., 2002). Um exemplo seria a utilização de isolados homofermentativos para a produção de queijos artesanais, conferindo a estes características tecnológicas importantes, como uma massa fechada e isentas de olhaduras (HERMANNS, 2013).

60 Identificação dos isolados de BAL Dezessete isolados de BAL produtores de substâncias antimicrobianas e caracterizados como homofermentativos, foram selecionados e submetidos à identificação fenotípica através do sistema Vitek 2, cujos resultados estão apresentados na tabela 5. Tabela 5 - Identificação pelo sistema Vitek 2 de bactérias ácido láticas homofermentativas e com atividade antimicrobiana, isoladas de queijo mussarela Isolado Micro-organismo 42 Leuconostoc mesenteroides 55 Leuconostoc mesenteroides 94 Streptococcus alactolyticus 95 Lactococcus lactis subsp. cremoris 102 Leuconostoc mesenteroides 132 Helcococcus kunzii Pediococcus pentosaceus Streptococcus sanguinis 250 Helcococcus kunzii 255 Enterococcus faecium Leuconostoc pseudomesenteroides Lactococcus lactis subsp. lactis Dos 17 isolados submetidos a análise pelo sistema Vitek, doze foram identificados em nível de gênero e espécie e 5 não foram identificados. Estes foram submetidos a identificação molecular, pelo sequenciamento de um fragmento de 252 pb do gene 16S rdna e a identidade dos isolados está apresentada na tabela 6. Tabela 6 - Identificação por sequenciamento de uma região do gene 16s rdna de bactérias ácido láticas homofermentativas e com atividade antimicrobiana, isoladas de queijo mussarela Isolado Micro-organismo Similaridade 177 Lactobacillus casei 99 % 246 Lactobacillus casei 99 % 247 Lactobacillus casei 99 % 254 Lactobacillus curvatus 100 % 277 Enterococcus durans 99 % Através dos resultados apresentados nas tabelas 5 e 6 verifica-se que, com exceção do isolado 250, identificado como Helcococcus kunzii, os demais

61 58 são BAL. H. kunzii é uma bactéria anaeróbia facultativa, que foi descrita pela primeira vez por Collins et al., em 1993, e infecções humanas causadas por esta bactéria continuam a ser raras (LOTTE et al., 2015). Ainda, pode-se observar a diversidade de BAL presentes no queijo mussarela fatiado comercializado em mercados e minimercados na cidade de Pelotas. Hermanns et al. (2014) avaliaram amostras de leite in natura e queijos artesanais da região noroeste do Rio Grande do Sul, e identificaram BAL com atividade antimicrobiana pertencentes as espécies E. faecium, E. faecalis e L. plantarum. Já Perin e Nero (2014), identificaram predominância dos gêneros Lactococcus e Enterococcus em leite de cabra produzido no município de Viçosa, Minas Gerais. Além destes, outros estudos também apontam a diversidade da microbiota nativa encontrada em leite e seus derivados (CAVICCHIOLI et al., 2015; JERONYMO-CENEVIVA et al. 2014; RIBEIRO et al., 2014), corroborando os dados obtidos no presente trabalho. De acordo com Moraes et al. (2010), a variabilidade da população microbiana de cada produto lácteo ocorre pela região geográfica onde este é produzido, além de variar em função do tipo de leite utilizado, do clima predominante e dos métodos empregados durante o processamento. O isolado LC254, único que apresentou atividade antagonista pela produção de substância antimicrobiana presente no sobrenadante livre de células entre as BAL avaliadas neste estudo, foi identificado como L. curvatus. Outros trabalhos, têm descrito o isolamento e identificação dessa espécie microbiana, relatando sua atividade bacteriocinogênica, como é o caso do L. curvatus 54M16, isolado de embutidos fermentados tradicionais da Itália (CASABURI et al., 2016), do L. curvatus NRIC 0822, isolado de produto fermentado à base de peixe tradicional do Japão (COUSIN et al., 2015), do L. curvatus A61, isolado de queijo tradicional do Azerbaijão (AHMADOVA et al., 2013) e do L. curvatus MBSa2, isolado de salame tipo italiano em São Paulo, Brasil (BARBOSA, 2013).

62 Caracterização do isolado bacteriocinogênico Levando-se em consideração que apenas um isolado apresentou atividade antimicrobiana pela produção de substância antimicrobiana presente no sobrenadante livre de células, as análises de caracterização do isolado, assim como da substância antimicrobiana produzida e seu potencial de utilização tecnológica, descritas a seguir, foram realizadas a partir do isolado L. curvatus LC Motilidade Conforme se pode observar na figura 1, o isolado LC254 apresentou-se móvel em ágar motilidade. Figura 1 - Motilidade do isolado Lactobacillus curvatus LC254 em ágar motilidade A motilidade bacteriana permite sua disseminação e multiplicação, conferindo uma vantagem competitiva sobre as espécies não móveis com relação à colonização de um determinado nicho (NEVILLE et al., 2012). Entre as espécies bacterianas móveis, temos Yersinia enterocolitica e L. monocytogenes, que apresentam motilidade variável em função da

63 60 temperatura. Y. enterocolitica e L. monocytogenes são móveis a temperatura de 25 ºC e imóveis, ou apresentam motilidade reduzida, no caso de L. monocytogenes, quando submetidas a temperatura de 37 ºC (BROOKS; BUTEL; MORSE, 2014). O gênero Lactobacillus tem sido amplamente pesquisado devido à sua importância na área da saúde e alimentação. No entanto, a motilidade ainda é mal caracterizada e, até o momento, apenas 14 espécies são reconhecidas como móveis. Entre elas, 13 isolados pertencentes à espécie L. salivarius (SALVETTI; TORRIANI; FELIS, 2012) e um isolado de L. curvatus (NRIC 0822) (COUSIN et al., 2015). L. curvatus NRIC 0822 foi isolado a partir de um alimento fermentado Japonês e identificado, inicialmente, como móvel a partir de testes laboratoriais de rotina. A motilidade foi revelada por microscopia de contraste de fase e por inoculação em ágar motilidade, com diferentes fontes de carboidrato, temperaturas e condições atmosféricas, com posterior sequenciamento do seu genoma (COUSIN et al., 2015). Esses dados reforçam a importância de testes adicionais para confirmar a motilidade do isolado LC Suscetibilidade do isolado LC254 a antimicrobianos Os resultados dos testes de suscetibilidade do isolado LC254 a antimicrobianos de uso clínico, estão apresentados na tabela 7. Tabela 7 - Perfil de suscetibilidade do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a antimicrobianos de uso clínico e respectivos tamanhos dos halos de inibição Antimicrobiano Halo de inibição (mm) Classificação Amicacina (30µg) 30 S Ampicilina (10 µg) 39 S Cloranfenicol (30 µg) 24 S Estreptomicina (10 µg) 22 S Eritromicina (15 µg) 42 S Gentamicina (10 µg) 29 S Penicilina G (10 µg) 41 S Sulfametoxazol-Trimetoprim (25µg) 24 S Tetraciclina (30 µg) 32 S Vancomicina (30 µg) 13 R S = Sensível; I = Intermediário; R = Resistente

64 61 O isolado LC254 foi sensível a todos os antimicrobianos testados, exceto a vancomicina, para o qual apresentou resistência. Ahmadova et al. (2013) avaliaram a suscetibilidade do L. curvatus A61, e observaram que este foi sensível a cloranfenicol, penicilina, tetraciclina, vancomicina e ciprofloxacina, mas resistente à ampicilina e gentamicina, diferentemente do perfil de suscetibilidade apresentado pelo isolado LC254, avaliado neste estudo. Em geral, Lactobacillus são suscetíveis à ampicilina e cloranfenicol (AMMOR; FLÓREZ; MAYO, 2007) e, em alguns casos, são resistentes a ciprofloxacina, canamicina, gentamicina e à vancomicina (DANIELSEN; WIND, 2003; DICKS; TODOROV; FRANCO, 2009). A resistência a um antibiótico pode ser inerente a uma espécie bacteriana ou gênero (resistência intrínseca) ou adquirida por mutação ou aquisição de genes (DANIELSEN; WIND, 2003; COCCONCELLI; CATIVELLI; GAZZOLA, 2004; AMMOR; FLORES; MAYO, 2007; TOOMEY et al., 2009). A capacidade de uma bactéria resistir à exposição aos antimicrobianos pode representar uma ameaça à saúde humana e animal, pois a presença dessa bactéria nos alimentos e no TGI pode agir como reservatório de genes de resistência aos antimicrobianos, os quais podem ser transferidos para outras bactérias, tornando-as multirresistentes (JERONYMO-CENEVIVA et al. 2014) Avaliação do potencial probiótico Tolerância ao trato gastrointestinal de forma simulada Os resultados de tolerância ao suco gástrico e intestinal pelo isolado LC254 estão apresentados na figura 2 (Apêndice A) e na tabela 8, respectivamente. LC254 não foi capaz de sobreviver ao suco gástrico simulado (ph 2,5 + 3 mg.ml -1 de pepsina), não sendo observada contagem celular já nos primeiros 15min do ensaio, quando inoculado em solução salina. No entanto, manteve-

65 62 se viável entre 60 e 120min no suco gástrico simulado quando inoculado em leite integral, demonstrando o efeito protetor que o alimento pode apresentar sobre a sobrevivência do isolado LC254 durante a passagem no estômago do hospedeiro. Figura 2 - Número de células viáveis do isolado Lactobacillus curvatus LC254 em suco gástrico simulado (pepsina 3 mg.ml-1 + ph 2,5). Linha azul: suspensão celular + solução salina; linha verde: suspensão celular + leite integral. O baixo ph do estômago e a ação antimicrobiana da pepsina são conhecidos como barreiras eficazes contra a passagem de micro-organismos pelo TGI (HOLZAPFEL et al., 1998). Em geral, o ph estomacal varia de ph 2,5 a 3,5, podendo reduzir a ph 1,5 em período de jejum, ou aumentar à ph 4,5 após a ingestão de alimentos. O tempo de permanência do alimento no estômago também varia de acordo com a sua composição, permanecendo, geralmente, entre 2 a 4h (HUANG; ADAMS, 2004). O aumento do ph, quando ocorre a adição do alimento, é um dos fatores que contribuem para o aumento da viabilidade de linhagens candidatas a probióticos (CONWAY et al., 1987). Vários trabalhos têm relatado o isolamento de grande número de BAL a partir de diferentes produtos, entretanto, poucos

66 63 isolados apresentam resistência ao ph ácido e sobrevivem à passagem através do TGI (HERMANNS et al., 2014; JERONYMO-CENEVIVA et al., 2014; LEITE et al., 2015 MEIRA, 2011; BOTTA et al., 2014). Assim como foi observado neste estudo, o aumento da viabilidade de isolados de Lactobacillus e de Bifidobacterium sensíveis à acidez durante o teste de tolerância ao suco gástrico simulado tem sido evidenciado na presença de leite (CONWAY et al, 1987; CHARTERIS et al., 1998, MEIRA, 2011, JERONYMO-CENEVIVA et al., 2014). Dessa forma, este critério não pode ser decisivo na seleção de BAL probióticas uma vez que muitos probióticos são consumidos com produtos alimentícios e o efeito protetor dos alimentos deve ser considerado.

67 64 Tabela 8 - Número de células viáveis do isolado Lactobacillus curvatus LC254 em suco intestinal simulado (pancreatina 1mg.mL -1 + ph 8,0) na presença/ausência de alimento e sais biliares Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Sb* Sb Sb Sb Sb Tratamentos 0min 60min 120min 180min 240min Log UFC.mL -1 % Log UFC.mL -1 % Log UFC.mL -1 % Log UFC.mL -1 % Log UFC.mL -1 % 1 8,76 ± 0,08 ABa 100 8,70 ± 0,03 Ba 99,32 8,93 ± 0,02 Aa 101,94 8,73 ± 0,002 Aab 99,66 8,82 ± 0,04 ABab 100,68 2 8,60 ± 0,04 Ba 100 7,70 ± 0,10 Cb 89,53 8,81 ± 0,02 Aabc 102,44 8,80 ± 0,01 Aa 102,33 8,81 ± 0,05 Aab 102,44 3 8,65 ± 0,03 Aa 100 8,74 ± 0,03 Aa 101,04 8,75 ± 0,04 Aabc 101,16 8,35 ± 0,002 Bb 96,53 8,72 ± 0,05 Aabc 100,81 4 8,72 ± 0,05 ABa 100 8,89 ± 0,03 Aa 101,95 8,60 ± 0,04 BCc 98,62 8,70 ± 0,03 Aba 99,77 8,54 ± 0,004 Bc 97,94 1: Solução salina sem sais biliares; 2: Leite integral sem sais biliares; 3: Solução salina com sais biliares; 4: Leite integral com sais biliares. *: Sobrevivência. A-C: As médias seguidas de uma mesma letra na linha, para cada variável, não diferem entre si a P < 0,05 de significância pelo Teste de Tukey; a-c: As médias seguidas de uma mesma letra na coluna, para cada variável, não diferem entre si a P < 0,05 de significância pelo Teste de Tukey.

68 65 Outra característica que micro-organismos probióticos devem apresentar é a capacidade de sobreviver na presença de sais biliares e de pancreatina no intestino delgado (FLOCH et al, 1972; LE VAY, 1988), no qual o tempo de passagem do alimento é de 1 a 4h. Os sais biliares são os principais componentes da bile, capazes de desorganizar a estrutura de membranas celulares e, dessa forma, são tóxicos às células microbianas viáveis (BEGLEY et al., 2006). Observa-se que o isolado LC254 foi capaz de resistir às condições do trato intestinal simulado (pancreatina 1 mg.ml -1 e ph 8,0), sem diferença significativa (p>0,05) entre suas contagens no tempo inicial e após 4h, na maioria das condições avaliadas. Ou seja, o mesmo apresenta potencial para alcançar o intestino e promover efeitos benéficos na presença do alimento e sais biliares. Os resultados obtidos no presente trabalho são similares aos encontrados por Silva et al. (2015), que avaliaram a viabilidade de 28 isolados de BAL em suspensão e inoculadas em queijo, durante a passagem no TGI, e verificaram que no queijo (utilizado como veículo de transporte para a entrega de micro-organismos) houve maior sobrevivência de todos os isolados de BAL. O aumento na capacidade de sobrevivência do isolado LC254 durante a passagem no trato gastrointestinal de forma simulada na presença de alimento, é uma característica importante a ser considerada para a utilização deste isolado como potencial micro-organismo probiótico Autoagregação, coagregação e hidrofobicidade Os resultados de autoagregação e coagregação do isolado LC254 estão demonstrados na figura 3 (Apêndice B). A capacidade de autoagregação do isolado LC254 e de L. monocytogenes Scott A aumentou no decorrer do tempo avaliado, atingindo valor máximo em 24h (54,91 % ± 1) e 20h (58,93 % ± 1,23), respectivamente. Além disso, em 20h o percentual de autoagregação de LC254 e L. monocytogenes Scott A foi significativamente maior (p<0,05) que em 2h.

69 66 Hermanns (2013) avaliou isolados de BAL pertencentes aos gêneros Enterococcus e Lactobacillus provenientes de leite e queijos artesanais, e obteve resultados similares aos deste estudo em 20h de avaliação e, em 24h, quatro dos cinco isolados avaliados mantiveram, no mínimo, 50 % de autoagregação. Por outro lado, Todorov et al. (2011), obtiveram valores de 7,2 % e 12,1 % de autoagregação para L. fermentum ET35 e E. faecium ET05, respectivamente. Figura 3 - Autogregação e coagregação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 e de Listeria monocytogenes Scott A. Barra azul: isolado LC254; barra laranja: Listeria monocytogenes Scott A; barra cinza: Isolado LC254 e Listeria monocytogenes Scott A. A capacidade de coagregação do isolado LC254 apresentou a mesma tendência que a observada para a autoagreagação, de aumento ao longo do tempo avaliado, atingindo o maior valor em 24h (66,52 ± 5,43 %), com diferença significativamente superior (p<0,05) aos demais tempos avaliados. Ahmadova et al. (2013), obtiveram valor de autoagregação de 76 % para L. curvatus A61 e capacidade de coagregação com diferentes isolados de L. monocytogenes, de 28 a 45%, dependendo do isolado de L. monocytogenes. A capacidade de autoagregação é correlacionada com a adesão, característica reconhecida como um pré-requisito para a colonização do TGI

70 67 por bactérias probióticas. A capacidade das bactérias para autoagregação depende de características físico-químicas da superfície da célula, tais como a hidrofobicidade (DEL RE et al., 2000). A capacidade de coagregação a micro-organismos patogênicos é outra propriedade desejável em bactérias probióticas. Além disso, BAL bacteriocinogênicas com essa característica, de coagregar a micro-organismos patogênicos contra os quais possuem atividade antimicrobiana, podem constituir um importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra infecção (TODOROV; LE BLANC; FRANCO, 2012). Quanto à hidrofobicidade, o percentual encontrado para o isolado LC254 foi de 14 % (± 0,64). Valores superiores a este foram encontrados por outros autores (HERMANNS et al., 2014; JERONYMO-CENEVIVA et al., 2014; TODOROV et al., 2011b; TODOROV; LE BLANC; FRANCO, 2012). Entretanto, de acordo com Schar-Zammaretti e Ubbink (2003), a hidrofobicidade está relacionada com a adesão da bactéria probiótica na mucosa, mas não é um pré-requisito para uma forte aderência às células. Além disso, para determinar o caráter hidrofóbico da superfície celular de micro-organismo in vitro, hoje são utilizados vários compostos apolares, como o n-hexadecano e o tolueno (GUGLIELMOTTI et al., 2007; TODOROV et al., 2011a), podendo haver variação nos valores de hidrofobicidade, conforme o composto utilizado. A capacidade das bactérias de auto e coagregação é espécie-específica e varia dentro de uma mesma espécie microbiana (AHMADOVA et al., 2013; COLLADO; MERILUOTO; SALMINEN, 2008; TODOROV et al., 2011). Nesses quesitos, os resultados apresentados indicam que o isolado LC254 possui potencial para ser utilizado como probiótico, uma vez que apresenta capacidade de auto-agregação e coagregação com L. monocytogenes, um importante patógeno de origem alimentar Atividade da enzima β-galactosidase A produção da enzima β-galactosidase por BAL tem grande importância para a saúde do consumidor, principalmente para aqueles que são lactase não persistente, pois esta enzima tem a função de hidrolisar a lactose em galactose

71 68 e glicose (MARTINS; BURKET, 2009). Assim, alimentos adicionados da enzima pura ou fermentados com culturas produtoras de β-galactosidase são capazes de melhorar a digestão da lactose com pouco ou mesmo sem efeito adverso ao consumidor (MEIRA, 2011). Apesar da maioria das espécies de Lactobacillus serem produtoras da enzima β-galactosidase (HONDA et al., 2007), o isolado LC254 não apresenta atividade desta enzima (0,43 ± 0,04 unidades Miller). Dado similar foi observado por Vinderola e Reinhemer (2003), que obtiveram baixa ou nenhuma atividade da enzima β-galactosidase em isolados de L. casei. Por outro lado, Jeronymo-Ceneviva et al. (2014), obtiveram 3 isolados produtores e um não produtor desta enzima Adesão de L. monocytogenes e do isolado LC254 a células intestinais HCT-116 A capacidade do isolado LC254 em aderir e modificar a adesão de L. monocytogenes ATCC 7644 a células HCT-116, é apresentada na figura 4.

72 69 Figura 4 - Porcentagem de adesão de Listeria monocytogenes ATCC 7644 e do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a células HCT-116 após uma hora de incubação a 37 ºC. 1: adesão de L. monocytogenes ATCC 7644 a células HCT-116; 2: adesão do isolado LC254 a células HCT-116; 3: adesão de L. monocytogenes ATCC 7644 a células HCT-116 na presença do isolado LC254; 4: adesão do isolado LC254 a células HCT-116 na presença de L. monocytogenes ATCC L. monocytogenes ATCC 7644 e o isolado LC254 foram capazes de aderir às células HCT-116, no entanto, o percentual de adesão de L. monocytogenes foi significativamente maior (p<0,001) que do isolado LC254, provavelmente devido a presença de fatores de adesão presentes em L. monocytogenes e ausentes em L. curvatus LC254. Garriga et al. (2015) obtiveram resultados semelhantes, com um percentual de adesão de L. monocytogenes CTC1034 (25 %) significativamente maior que a cepa padrão de BAL (L. rhamnosus CG) utilizada (6%). A adesão in vitro a linhagens de células intestinais é um teste frequentemente utilizado para avaliar o potencial de novas estirpes candidatas a probióticas, uma vez que simula a capacidade da bactéria de realizar a colonização transitória do epitélio intestinal, a qual permitiria o probiótico exercer o seu efeito benéfico (FAO/OMS, 2006). O isolado LC254 foi capaz de reduzir em 20 % (3,41 para 2,72 %) a adesão de L. monocytogenes ATCC 7644 as células HCT116 durante o ensaio de competição, resultado significativamente menor (p<0,001) que o percentual de adesão de L. monocytogenes ATCC 7644 às células HCT116 de forma

73 70 isolada. Da mesma forma, houve redução do percentual de adesão do isolado LC254 quando em competição com L. monocytogenes ATCC 7644, comparado ao percentual de adesão do LC254 isoladamente, porém, esta redução não foi significativa (p>0,05). Esses dados sugerem competição por sítios de ligação as células intestinais, com vantagem competitiva para o isolado LC254. França et al. (2015) obtiveram uma redução de 47% na adesão de S. Typhimurium a células HCT116 quando incubada com P. pastoris, e de 37 % com S. boulardi, sob as mesmas condições utilizadas no presente estudo. Os resultados deste estudo corroboram outras pesquisas que destacam a capacidade de isolados de BAL em alterar a adesão a células intestinais de diferentes micro-organismos patogênicos de importância em alimentos (SUNG- MEE; AHN, 2012; GARRIGA et al., 2015; WINKELSTRÖTER; DE MARTINIS, 2015). Ressalta-se que alguns autores não observaram interação entre a adesão de BAL e a de micro-organismos patogênicos em linhagens de células intestinais (AYENI et al., 2011; GUEIMONDE et al., 2006), portanto, os resultados obtidos neste estudo são relevantes, tendo em vista que a capacidade de neutralizar o efeito de micro-organismos patogênicos no intestino é uma das características desejáveis para potenciais candidatos probióticos (FAO / WHO, 2006). 5.5 Caracterização da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC Atividade antimicrobiana e espectro de ação do SLC de LC254 A atividade antimicrobiana do SLC do isolado LC254 contra L. monocytogenes ATCC 7644, micro-organismo indicador selecionado como padrão para os testes realizados, bem como o espectro de ação contra diferentes micro-organismos, estão apresentados na tabela 9.

74 71 Tabela 9 - Espectro de ação da substância antimicrobiana produzida pelo isolado Lactobacillus curvatus LC254 Micro-organismo Atividade antimicrobiana (UA.mL -1 ) Gram-positivas Cepas padrão Listeria monocytogenes ATCC Listeria monocytogenes Scott A Listeria monocytogenes SILIKEN 400 Listeria ivanovii ATCC Listeria innocua CLIP Staphylococcus aureus ATCC Isolados de alimentos (queijo e presunto fatiado) Listeria monocytogenes L6P4 800 Listeria monocytogenes L80P2 200 Listeria monocytogenes L89P Listeria monocytogenes L101P5 200 Listeria monocytogenes L136P8 - Listeria monocytogenes L137P2 400 Listeria monocytogenes L164P5 400 Listeria monocytogenes L167Q5 200 Listeria monocytogenes L172P2 200 Listeria monocytogenes L177P Listeria monocytogenes L190Q Bactérias Ácido Láticas Cepas padrão Lactobacillus acidophilus ATCC Lactobacillus plantarum ATCC Lactobacillus fermentum ATCC Lactobacillus brevis ATCC Lactobacillus delbrueckii ATCC Gram-negativas Cepas padrão Acinetobacter baumannii ATCC Bacillus cereus ATCC Escherichia coli O157:H7 ATCC Escherichia coli ATCC Proteus mirabilis ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Salmonella Enteritidis ATCC Salmonella Typhimurium ATCC Shigella dysenteriae ATCC : ausência de atividade antimicrobiana. O SLC do LC254 apresentou maior título de atividade antimicrobiana ( UA.mL -1 ) contra L. ivanovii ATCC e dois isolados de L. monocytogenes, oriundos de amostras de presunto (L177P4) e queijo (L190Q5) fatiados. Também apresentou atividade contra todas as cepas padrão de Listeria spp. testadas, e contra mais de 90% (10/11) dos isolados de L. monocytogenes provenientes de alimentos. A inibição de L. monocytogenes é importante para a produção de alimentos seguros, pois este patógeno de

75 72 origem alimentar é capaz de se adaptar e superar diversas condições hostis a outros micro-organismos, além de manter-se no ambiente de processamento de alimentos e contaminar o produto final (GANDHI; CHIKINDAS, 2007). É o agente causador da listeriose, uma infecção grave, geralmente adquirida pelo consumo de alimentos contaminados e que é responsável por cerca de 260 mortes por ano nos Estados Unidos da América (CDC, 2014). Por outro lado, o SLC do LC254 inibiu outras BAL, com exceção de L. fermentum ATCC A atividade de bacteriocinas contra bactérias estreitamente relacionadas às cepas produtoras é uma das principais características destes antimicrobianos (BASTOS, COUTINHO; COELHO, 2010; HEN et al., 2007) o que, do ponto de vista tecnológico, pode não ser desejável quando da utilização de BAL com essa característica, como cultura iniciadora ou como cultura associada. Dessa forma, o isolado LC254 não é indicado para ser utilizado com esta finalidade em alimentos fermentados. No entanto, quando testada a ação antimicrobiana da substância presente no SLC contra o próprio isolado LC254 (espectro de autoimunidade), esta não apresentou atividade. Isolados bacteriocinogênicos são imunes às próprias bacteriocinas, devido à produção de proteínas específicas de imunidade (COTTER; HILL; ROSS, 2005). Em relação aos micro-organismos Gram-negativos, o SLC do isolado LC254 apresentou atividade contra 3 das 9 espécies testadas, entre elas uma patogênica de grande importância em alimentos, a E. coli O157:H7 e duas deteriorantes, A. baumannii e P. mirabilis. Esta atividade contra bactérias Gram-negativas não é comum, entretanto, tem sido relatada, com a adição de algum agente capaz de alterar a integridade da parede celular, como temperatura ou produtos químicos, como EDTA, por exemplo. De um modo geral, a presença da membrana externa dessas bactérias dificulta a ação de bacteriocinas (BROMBERG et al., 2005; ORTOLANI et al., 2010). Ainda, é possível observar que a substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 não foi capaz de inibir outros micro-organismos de importância em alimentos, como S. aureus, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa, S. Enteritidis, S. Typhimurium e S. dysenteriae.

76 73 Bacteriocinas ST28MS e ST26MS, produzidas por L. plantarum isolados a partir de melaço, inibiram a multiplicação de L. casei, L. sakei, S. aureus, E. faecalis, P. aeruginosa, E. coli e A. baumanii (TODOROV; DICKS, 2004a). Masuda et al. (2011) ao avaliarem a ação da bacteriocina leucociclina, proveniente de L. mesenteroides TK41401 contra diversas bactérias, observaram que esta apresentou atividade inibitória contra E. coli, L. innocua e algumas linhagens de BAL, mas não contra S. aureus, resultados similares aos encontrados pelo presente trabalho, o que indica mecanismo de ação semelhante entre as bacteriocinas Natureza da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 Os resultados da avaliação da sensibilidade enzimática da substância produzida pelo isolado LC254 estão apresentados na tabela 10. A atividade antimicrobiana do SLC do isolado LC254 foi inativada completamente após o tratamento com as proteases proteinase K e quimotripsina, indicando a sua natureza proteica (BROMBERG et al., 2005). Entretanto, a atividade permaneceu constante quando o SLC foi tratado com as enzimas tripsina, pepsina e catalase, individualmente. Vários estudos já demonstraram a capacidade de produção de substâncias antimicrobianas por isolados de BAL bacteriocinogênicos com diferentes padrões de sensibilidade a enzimas (RODRÍGUES et al., 2000; BROMBERG et al., 2005; SHARMA et al., 2006; WANNUN; PIWAT; TEANPAISAN, 2014), o que pode sugerir a produção de uma ou mais bacteriocinas. Já a manutenção da atividade antimicrobiana após tratamento com catalase, demonstra que a inibição do micro-organismo indicador não ocorreu devido a ação do peróxido de hidrogênio (H2O2) (MORAES et al., 2010). O perfil de sensibilidade enzimática das substâncias antimicrobianas produzidas por BAL fornece um resultado importante, considerando a possibilidade de degradação dessas substâncias por enzimas presentes naturalmente nos alimentos nos quais seria viável a sua utilização (GÁLVEZ et al., 2007).

77 Estabilidade da substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 aos agentes químicos e em diferentes valores de ph e temperatura Os resultados de estabilidade da substância produzida pelo isolado LC254 na presença de agentes químicos, variações de ph e temperatura, estão apresentados na tabela 10, na qual é possível verificar que a atividade antimicrobiana se manteve estável frente a maioria dos tratamentos empregados, com redução da atividade quando submetido ao tratamento com agentes químicos. Observa-se que a atividade residual após tratamento com acetona, glicerol e uréia reduziu para 12,5 %, em relação ao controle. Resultados similares foram relatados para a bacteriocina ST99, produzida por L. mesenteroides subsp. dextranicum ST99 (TODOROV; DICKS, 2004b), e as bacteriocinas ST209GB, ST278GB, ST315GB e ST711GB, produzidas por E. faecium (FAVARO et al., 2014). A estabilidade a diferentes agentes químicos é de grande importância sob o ponto de vista tecnológico e laboratorial, pois estes compostos podem ser utilizados nas etapas de purificação da bacteriocina, em técnicas de biologia molecular, em práticas bioquímicas, ou mesmo aplicados concomitantemente a substância antimicrobiana, como por exemplo, o NaCl, que é utilizado no processamento de alimentos (JERONYMO-CENEVIVA et al. 2014). A estabilidade ao calor e à ampla faixa de ph, especialmente ao ph ácido e a temperatura de 121 ºC, demonstram a potencial aplicação de substâncias antimicrobianas com essas características, como bioconservadores em alimentos fermentados (JERONYMO-CENEVIVA et al. 2014) ou em alimentos submetidos a tratamento térmico (BARBOSA et al., 2015).

78 75 Tabela 10 - Efeito da ação de enzimas, ph, temperatura e agentes químicos sobre a estabilidade da substância antimicrobiana produzida pelo isolado Lactobacillus curvatus LC254 Tratamento Atividade antimicrobiana residual (%) Enzimas Pepsina, Proteinase K α-quimiotripsina Tripsina Catalase Agentes químicos Acetona Álcool Glicerol NaCl SDS Tween 20 Tween 80 Triton X-100 Triton X-114 Uréia ph 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 Temperatura 30 ºC 37 ºC 45 ºC 60ºC 80 ºC 100ºC 121ºC -: ausência de atividade antimicrobiana , , , , Presença de genes codificadores de bacteriocinas A presença de 7 genes codificadores de bacteriocinas foi avaliada por PCR, entretanto, apenas um fragmento, de 186 pb, foi identificado e confirmado por sequenciamento, o qual corresponde a bacteriocina Sakacina P, conforme demonstrado na figura 5.

79 76 M pb pb - Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 1,5 % com produto das PCR para genes de bacteriocinas. M: 1 kb Plus DNA ladder (Invitrogen ); 1: controle negativo (S. aureus ATCC como DNA molde); 2: controle da reação (água ultrapura como DNA molde); 3 e 4: gene Sak P. Bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus spp. podem produzir bacteriocinas, entre as quais, plantaricinas, pediocinas e sakacinas, que apresentam atividade antimicrobiana contra diversos micro-organismos (CHEN; HOOVER, 2003; ELEGADO et al., 2004; HÉQUET et al., 2007). Casaburi et al. (2016) avaliaram a presença de genes das bacteriocinas Curvacina A, Sakacina T, X e P em L. curvatus 54M16 por PCR, e identificaram a presença do gene de 3 bacteriocinas: Sakacina T, X e P. A presença de mais de um gene de bacteriocina não é incomum em isolados de Lactobacillus (HEQUET et al, 2007; VAUGHAN et al., 2003). A presença do gene da Sakacina P já foi descrita no isolado L. sakei 5 (VAUGHAN et al., 2003), L. curvatus MBSa2 e MBSa3 (BARBOSA et al., 2015) e no isolado L. curvatus 2711, o qual possui o gene, porém, este não é expresso.

80 Cinética de produção da substância antimicrobiana do isolado L. curvatus LC254 Os resultados da cinética de multiplicação de LC254 e de produção da substância antimicrobiana produzida em caldo MRS a 30 ºC e 37 ºC, estão apresentados nas figuras 6 e 7, respectivamente (Apêndice C). Figura 6 - Mudanças no número de células viáveis (Log UFC.mL -1 ), ph e atividade antimicrobiana (UA.mL -1 ) durante a multiplicação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a 30 ºC durante 48h. Resultados da análise de variância com índice de confiança de 95%. Cada ponto representa a média de 3 repetições testados em duplicata. Linha verde: ph; linha azul: Log UFC.mL -1 ; barra laranja: UA.mL -1 utilizando L. monocytogenes ATCC 7644 como microorganismo indicador; barra cinza: UA.mL -1 utilizando L. monocytogenes Scott A como microorganismo indicador. *: atividade antimicrobiana determinada em unidades arbitrárias (UA.mL -1 ) por método de diluição crítica.

81 78 Figura 7 - Mudanças no número de células viáveis (Log UFC.mL -1 ), ph e atividade antimicrobiana (UA.mL -1 ) durante a multiplicação do isolado Lactobacillus curvatus LC254 a 37 ºC durante 48h. Resultados da análise de variância com índice de confiança de 95%. Cada ponto representa a média de 3 repetições testados em duplicata. Linha verde: ph; linha azul: Log UFC.mL -1 ; barra laranja: UA.mL -1 utilizando L. monocytogenes ATCC 7644 como microorganismo indicador; barra cinza: UA.mL -1 utilizando L. monocytogenes Scott A como microorganismo indicador. *: atividade antimicrobiana determinada em unidades arbitrárias (UA.mL -1 ) por método de diluição crítica. A redução do ph de 6 para 4 ocorreu no mesmo intervalo de tempo para as duas temperaturas testadas (30 e 37 ºC) e manteve-se constante até o final do período avaliado. Observa-se diferença significativa (p<0,05) no número de células viáveis e na produção de substância antimicrobiana entre os tempos avaliados. O número de células viáveis manteve-se constante ao longo de 6 h de cultivo e, em 8h, foi significativamente maior (p<0,05) a 30 ºC que a 37 ºC, diferença mantida ao longo das 48h avaliadas, mesmo após a redução do número de células viáveis a partir de 24h. Quanto à atividade antimicrobiana contra L. monocytogenes ATCC 7644, verificou-se que a máxima concentração atingida foi de UA.mL -1, em 18h a 30 ºC e, em 10h a 37 ºC. No entanto, em 48h a 37 ºC houve redução significativa (p<0,05) da atividade antimicrobiana. Resultados semelhantes já

82 79 foram relatados para outras bacteriocinas (BAREFOOT; KLAENHAMMER, 1984; LEROY; DE VUYST, 1999; MESSENS; DE VUYST, 2002; XIRAPHI et al, 2006, CASABURI et al., 2016) e pode ser devido à vários fatores, como agregação, presença e ação de proteases extracelulares ou mesmo a adsorção às células do próprio isolado produtor da substância antimicrobiana (DE VUYST; CALLEWAERT; CRABBE, 1996). Utilizando L. monocytogenes Scott A como micro-organismo indicador da atividade antimicrobiana, o valor máximo atingido foi de 800 UA.mL -1 em 2h e, UA.mL -1 em 10h, mantendo-se constante ao longo das 48h. As bacteriocinas MBSa2 e MBSa3, produzidas por isolados de L. curvatus em caldo MRS foram avaliadas a 25 ºC, 30 ºC e 37 ºC por Barbosa et al. (2015). O início da produção das bacteriocinas ocorreu em 4h, com diminuição depois de 12h a 37 ºC. O máximo de atividade antimicrobiana ( UA.mL -1 ) foi atingido em 8h a 25 ºC e 37 ºC e, em 6h a 30 ºC, exceto para a bacteriocina MBSa3 a 25 ºC, que obteve o valor máximo em 10h. Estas características indicam uma cinética de metabolismo primário, ou seja, a produção de metabólito ocorreu durante a fase logarítmica de multiplicação microbiana (SIP et al. 2012). Esta característica também foi observada para outras bacteriocinas, como Sakacina K, produzida por L. sakei CTC 494 (LEROY; DE VUYST, 1999), Sakacina P, produzida por L. sakei CCUG (MORETRO et al., 2000) e curvacina A, produzida por L. curvatus LTH 1174 (MESSENS; DE VUYST, 2002). A diferença encontrada entre a atividade antimicrobiana contra L. monocytogenes ATCC 7644 e L. monocytogenes Scott A, também foi relatada por Murua et al. (2013). Estes autores avaliaram a atividade da bacteriocina produzida pelo isolado L. plantarum LP08AD, e obtiveram maiores valores contra L. monocytogenes, em comparação a L. curvatus e E. faecium, e atribuíram o resultado a presença de receptores presentes na superfície de L. monocytogenes, porém ausentes nos demais micro-organismos.

83 Efeito da substância antimicrobiana sobre a multiplicação de L. monocytogenes ATCC 7644 Os resultados obtidos para a multiplicação celular após adição de 20 % e 50 % do SLC do isolado LC254 (6.400 UA.mL-1) à cultura de L. monocytogenes ATCC 7644 estão apresentados na figura 8 (Apêndice D). Observa-se que a substância antimicrobiana presente no SLC do isolado LC254 foi capaz de reduzir significativamente (p<0,05) o número de células viáveis de L. monocytogenes ATCC 7644 logo após a adição do sobrenadante (de 8,26 ± 0,00 UFC.mL -1 para 7,39 ± 0,04 UFC.mL -1 e 6,66 ± 0,48 UFC.mL -1, em 20 e 50 % de SLC adicionado, respectivamente) e, essa diferença entre o controle e os dois tratamentos se manteve ao longo das 6 h avaliadas. A adição de 50 % de SLC ao cultivo de L. monocytogenes ATCC 7644, apresentou o melhor resultado, com redução por cerca de 3h do número de células viáveis de L. monocytogenes ATCC No entanto, no decorrer do tempo avaliado, observa-se um aumento gradual do número de células, chegando a valores semelhantes (p>0,05) aos iniciais, o que sugere que L. monocytogenes ATCC 7644 foi capaz de se recuperar a partir dos tratamentos utilizados. Da mesma forma, Todorov e Dicks (2004a) verificaram que as bacteriocinas ST28MS e ST26MS, produzidas por L. plantarum, apresentaram capacidade de reprimir a multiplicação celular de L. casei e P. aeruginosa por 2h.

84 81 Figura 8 - Multiplicação de Listeria monocytogenes ATCC 7644 a 37 ºC após adição da substância antimicrobiana do isolado Lactobacillus curvatus LC254. Linha azul: (controle) L. monocytogenes ATCC 7644 sem adição de SLC; Linha laranja: L. monocytogenes ATCC % do SLC do isolado LC254; Linha verde: L. monocytogenes ATCC % do SLC do isolado LC254. Cabe ressaltar que este experimento foi realizado utilizando-se alta concentração inicial do micro-organismo indicador (10 8 UFC.mL -1 ), a qual dificilmente é encontrada em alimentos contaminados por L. monocytogenes. Pode-se supor que em menores populações do patógeno, a substância antimicrobiana presente no SLC do isolado LC254 poderia ser mais eficaz. Rilla, Martinez e Rodrigues (2004) observaram a ação de L. lactis subsp. lactis IPLA729 frente ao micro-organismo patogênico S. aureus em duas diferentes concentrações: 10 4 UFC.mL -1 (amostra 1) e 10 6 UFC.mL -1 (amostra 2). Após 24h de incubação não foi detectado S. aureus na amostra 1, entretanto, na amostra 2, foram detectadas cerca de 10 4 UFC.mL -1 de S. aureus. Além disso, é importante considerar que a atividade inibitória apresentada por bactérias produtoras de bacteriocina em meios de cultura (in vitro) pode não ocorrer em matrizes alimentares. Vários fatores presentes nos alimentos podem influenciar no efeito antimicrobiano, por exemplo, interação com aditivos e ingredientes,

85 82 inativação por enzimas alimentares e mudanças no ph do alimento (HARTMANN; WILKE; ERDMANN, 2011; BALCIUNAS et al., 2013). Os resultados obtidos demonstram que a substância antimicrobiana presente no SLC do isolado LC254 apresenta potencial bacteriostático por até 3h o que pode ser considerado um aspecto positivo no controle de L. monocytogenes, considerando a possibilidade de aplicação em alimentos Toxicidade da substância antimicrobiana produzida por L. curvatus LC254 em modelo de Drosophila melanogaster Os resultados de toxicidade da substância antimicrobiana presente no SLC do isolado LC254 usando a mosca D. melanogaster, estão apresentados nas figuras 9 e 10 (Apêndice E). Moscas adultas expostas a diferentes concentrações de substância antimicrobiana presente no SLC do isolado LC254 (10, 20, 500, 1.000, e UA.mL -1 ) não apresentaram mortalidade significativa (p>0,05) ao longo de 7 dias de tratamento (Figura 9). Ainda, ao término dos 7 dias (Figura 10) o número de moscas mortas não diferiu (p>0,05) entre os tratamentos. Este resultado indica que a substância antimicrobiana produzida pelo isolado LC254 não apresenta efeito tóxico sobre células eucarióticas.

86 83 Figura 9 - Mortalidade de Drosophila melanogaster ao longo de 7 dias de tratamento com diferentes concentrações da substância antimicrobiana presente no sobrenadante livre de células do isolado Lactobacillus curvatus LC254. Figura 10 - Efeito de diferentes concentrações da substância antimicrobiana presente no sobrenadante livre de células do isolado Lactobacillus curvatus LC254 sobre a mortalidade de Drosophila melanogaster após 7 dias de tratamento. Barras azuis: indicam os tratamentos com respectivas concentrações de SLC do isolado LC254

87 84 A grande maioria dos estudos que avaliam a toxicidade in vitro de bacteriocinas são realizados utilizando linhagens celulares, como células Vero, Caco-2, HCT-116 e HT29 (MARTINEZ et al., 2013; EL-ADAWI et., 2013; JASNIEWSKI et al., 2009; MESSAOUDI et al., 2012). No entanto, estes testes não exibem todas as características desejáveis, como a absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade em uma situação in vivo (PANACEK et al., 2011). D. melanogaster, vulgarmente conhecida como ''mosca da fruta'' é um organismo eucariótico considerado um excelente modelo para o estudo de genética e biologia celular, com vantagens distintas para o estudo dos efeitos toxicológicos de compostos durante o período de desenvolvimento (BENFORD et al., 2000; AHMED et al., 2010). Gupta et al. (2014) avaliaram a toxicidade de peptídeos antimicrobianos purificados produzidos por L. plantarum LR/14 utilizando como modelo a D. melanogaster e verificaram que concentrações abaixo de 10 mg.ml -1 não apresentaram toxicidade. No entanto, valores superiores a 10 mg.ml -1 exerceram efeito tóxico, dependente da dose, atraso do desenvolvimento, e capacidade de reprodução comprometida. Os autores relatam ser o único trabalho publicado até o momento utilizando D. melanogaster como modelo de toxicidade para substância antimicrobiana de origem bacteriana. Cabe ressaltar que, apesar dessas substâncias antimicrobianas serem produzidas por bactérias classificadas como probióticas, os quais apresentam característica de uso seguro, ensaios clínicos adequados são necessários para confirmar a segurança destas substâncias para utilização em alimentos. 5.6 Atividade antimicrobiana de filmes biodegradáveis incorporados com a substância antimicrobiana produzida pelo isolado L. curvatus LC254 As atividades antimicrobianas do SLC líquido e liofilizado adicionados aos filmes biodegradáveis foram de e 800 UA.mL -1, respectivamente, demonstrando que o processo de liofilização levou a uma diminuição da atividade antimicrobiana da substância produzida pelo isolado LC254 contra L. monocytogenes ATCC Os resultados da atividade antimicrobiana dos

88 85 filmes biodegradáveis elaborados com o SLC do isolado LC254 estão apresentados na tabela 11. Tabela 11 - Atividade antimicrobiana de filmes contendo a substância antimicrobiana produzida pelo isolado Lactobacillus curvatus LC254 ao longo de 10 dias, contra Listeria monocytogenes ATCC 7644 Formulação filmes ativos Halo de inibição (mm)* Dia 1 Dia 3 Dia 6 Dia 10 E 21,00 ± 0,00 Aa 18,33 ± 0,89 Ba 10,67 ± 0,89 Cbc 12,33 ± 0,89 Cab F 21,33 ± 0,44 Aa 15,00 ± 0,00 Bb 10,67 ± 0,89 Cbc 13,00 ± 0,00 Cab G 9,00 ± 0,00 Ab 11,00 ± 0,00 Ac 9,33 ± 1,78 Ac 11 ± 0,00 Ab I 23,33 ± 0,44 Aa 18,33 ± 0,89 Ba 13,00 ± 0,00 Cab 13,00 ± 0,00 Cab J 23,33 ± 0,44 Aa 18,33 ± 0,44 Ba 13,33 ± 0,44 Ca 14,33 ± 0,44 Ca E: amido de batata + 10 ml do SLC de LC254, sem adição de Tween 20 e sem agitação; F: amido de batata + 20 ml do SLC de LC254, sem adição de Tween 20 e sem agitação; G: zeína + 10 ml do SLC de LC254, sem adição de Tween 20 e sem agitação; I: amido de batata + 10 ml do SLC de LC254, com adição de Tween 20 e sem agitação; J: amido de batata + 20 ml do SLC de LC254, com adição de Tween 20 e sem agitação. A-C: As médias seguidas de uma mesma letra na linha, para cada variável, não diferem entre si a P < 0,05 de significância pelo Teste de Tukey; a-c : As médias seguidas de uma mesma letra na coluna, para cada variável, não diferem entre si a P < 0,05 de significância pelo Teste de Tukey.* Medida dos halos correspondem ao diâmetro total, incluindo o filme. A incorporação de SLC do isolado LC254 com diferentes concentrações da substância antimicrobiana a diferentes matrizes poliméricas resultou em 5 filmes ativos, das 10 formulações testadas. Zonas de inibição visíveis contra L. monocytogenes ATCC 7644 foram observadas quando utilizado o SLC líquido, enquanto aqueles incorporados com o SLC liofilizado (formulações A, B, C, D e H) não apresentaram atividade antimicrobiana, o que pode estar associado à baixa atividade antimicrobiana apresentada pela substância produzida pelo isolado LC254 após o processo de liofilização Com relação ao tempo em que os filmes se mantiveram ativos, observase que a atividade antimicrobiana da substância produzida pelo isolado LC254 na formulação G foi a menor entre as formulações de filmes ativos, no entanto, esta permaneceu estável ao longo dos 10 dias avaliados, enquanto as formulações E, F, I e J apresentaram redução significativa (p<0,05) da atividade antimicrobiana, já aos 3 dias de avaliação. Massani et al. (2014) avaliaram a atividade antimicrobiana de filmes a base de glúten incorporados

89 86 com bacteriocinas produzidas por L. curvatus CRL705 os quais apresentaram atividade contra L. innocua 7 e L. plantarum CRL691 após 50 dias de avaliação. Avaliando a adição de SLC às diferentes matrizes poliméricas, não se observa diferença significativa (p<0,05) entre as formulações de filmes ativos em 10 dias de avaliação. Meira et al. (2014) avaliaram a incorporação de diferentes concentrações de nisina (1, 1,25 e 5%) a nanocompósitos e obtiveram filmes ativos contra L. monocytogenes, os quais apresentaram maior zona de inibição quanto mais elevada a quantidade de nisina incorporada ao filme. Ibarguren et al. (2015) elaboraram filmes utilizando como base gelatina e adicionaram as bacteriocinas Enterocinas A, B e P produzidas pelo isolado E. faecium SM21, e éster flavonóide, como agentes antimicrobianos, os quais foram capazes de inibir L. monocytogenes, S. aureus e B. cereus. É possível observar diferentes níveis de atividade antimicrobiana, que correspondem a formação de dois halos de inibição, um maior, com inibição parcial e outro menor, com inibição total do micro-organismo indicador ao redor do filme, conforme demonstrado na figura 11.

90 87 Figura 9 - Atividade antimicrobiana dos filmes I e J a base de amido de batata, incorporados com sobrenadante livre de células do isolado Lactobacillus curvatus LC254 contendo a substância antimicrobiana, contra Listeria monocytogenes ATCC 7644, no primeiro dia de avaliação. I: amido de batata + 10 ml do SLC de LC254, com adição de Tween 20 e sem agitação; J: amido de batata + 20 ml do SLC de LC254, com adição de Tween 20 e sem agitação. Setas pretas: indicam halo de inibição parcial (maior); setas vermelhas: indicam halo de inibição total (menor). Os resultados obtidos neste estudo demonstram o potencial de utilização do SLC do isolado LC254 para aplicação em filmes a base de amido de batata, visando o controle de L. monocytogenes em alimentos.