IMPORTÂNCIA DA CALIBRAÇÃO DE ESPECTROFOTÔMETROS UV-VIS NAS ANÁLISES QUÍMICAS

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1 IMPORTÂNCIA DA CALIBRAÇÃO DE ESPECTROFOTÔMETROS UV-VIS NAS ANÁLISES QUÍMICAS Debora Emy Fujiy Gonçalves 1, Elisama Melo da Silva Carvalho 2, Ana Paula Dornelles de Alvarenga 2, Juliana Freitas Santos Gomes 2 1 Visomes Comercial Metrológica Ltda. 2 Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (Inmetro) Resumo: Este trabalho descreve a importância da calibração de espectrofotômetros UV-Vis, muito utilizados em laboratórios de análises e indústrias químicas, apresentando o funcionamento do equipamento e a metodologia utilizada na calibração. Por fim, são apresentadas as planilhas de cálculo de incerteza de medição na calibração dos espectrofotômetros com as principais fontes de incerteza detectadas no processo de calibração. Palavras-chave: Espectrofotômetro, calibração, MRC 1. INTRODUÇÃO A espectrofotometria UV-Visível (UV-Vis) é um dos métodos ópticos mais utilizados em laboratório de análises químicas para quantificação de analitos devido à robustez do equipamento, facilidade no manuseio do instrumento, rapidez na obtenção de dados e simplicidade na interpretação dos resultados [1]. Essa técnica óptica é utilizada para identificar substâncias e compostos pelos seus espectros de absorção / transmitância, determinar quantitativamente a concentração de analitos e para monitorar as reações químicas e enzimáticas (cinética química e bioquímica). O espectrofotômetro é um instrumento cuja função é medir e comparar a quantidade de luz (energia radiante) absorvida por uma determinada amostra. Em geral, um espectrofotômetro possui uma fonte estável de radiação, um monocromador (por exemplo, um prisma ou uma grade de difração) para decompor a luz nos seus diversos comprimentos de onda, um seletor do comprimento de onda de interesse (banda espectral), um recipiente para colocar a amostra a ser analisada (cubeta ou tubo de ensaio) e um detector de radiação, que permite uma medida relativa da intensidade da luz. O funcionamento de um espectrofotômetro UV-Vis pode ser observado na Figura 1. 1

2 Figura 1 Funcionamento de um espectrofotômetro A medição consiste em comparar a quantidade de radiação emitida pela fonte e a quantidade da radiação que atinge o detector, ou seja, que foi transmitida pela amostra analisada. A transmitância é definida como a fração da luz original que passa pela amostra e, usualmente, é representada na forma de percentual, conforme (1). ( ) onde %T é a transmitância em percentual, I tot é a intensidade total da energia radiante que atinge a cubeta e I t é a intensidade de energia radiante que é detectada (depois de passar pela cubeta) [2]. A medição é dada em percentagem de transmitância, mas muitas vezes ela é apresentada em absorbância. A absorbância corresponde ao simétrico do logaritmo decimal do inverso da transmitância, conforme (2), ou seja, é uma medida logarítmica de uma razão de intensidades luminosas, assim, não possui dimensionalidade. ( ) ( ) A lei de Lambert Beer é uma relação empírica que relaciona a absorção da luz com as propriedades do material no qual a luz atravessa, cuja equação é dada por (3). A = a. b. c (3) onde a é a absortividade molar de um dado composto, em L mol -1 cm -1, b é o comprimento do caminho óptico que a luz tem que atravessar na cubeta, em cm, e c é a concentração do composto absorvente na solução, em mol L -1[2]. Essa equação é muito utilizada, porque a absorbância é diretamente proporcional aos outros parâmetros da equação, permitindo relacionar, para um mesmo analito, a concentração dele com sua absorbância e, assim, possibilitando determinar quantitativamente substâncias em amostras desconhecidas. 2

3 Quando uma solução contendo um analito específico é submetida a leituras de absorbância (ou transmitância) ao longo de um intervalo de comprimentos de onda eletromagnética, obtêm-se informações referentes à capacidade do analito em absorver a radiação emitida pela fonte do equipamento. A representação gráfica dos valores de comprimento de onda ( ) versus absorbância é denominada espectro de absorção (ou espectro de transmitância %T). Um exemplo de espectro de absorção está exemplificado na Figura 2. A interação da radiação com a matéria depende da estrutura química dos compostos químicos, assim, o espectro de absorção é um modo de caracterização que permite conferir qual o comprimento de onda (ou a faixa dele) que uma dada substância absorve de forma mais eficaz. Figura 2 Espectro de absorção do óxido de hólmio em ácido perclórico Devido à sua robustez inerente, há uma tendência em não verificar o desempenho de espectrofotômetros na rotina de utilização no laboratório. No entanto, a prática analítica e o atendimento às normas exigem que seu desempenho seja verificado em intervalos regulares. Para a precisão e exatidão do espectrofotômetro UV-Vis, é essencial que os parâmetros que influenciam na medição sejam mensurados periodicamente, seguindo os requisitos da Norma ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005, calibrando corretamente o espectrofotômetro e mantendo a rastreabilidade das medições químicas. Essa tarefa pode ser facilmente realizada caso haja um bom entendimento das características do equipamento. A calibração periódica requer medição da precisão do comprimento de onda e da transmitância [3]. A avaliação do desempenho de um espectrofotômetro deve ser realizada conforme documentos, tais como ASTM E275 [4], ASTM E387 [5], ASTM E925 [6], ASTM E958 [7] e ASTM E1866 [8], utilizando-se materiais de referência certificados (MRC). A calibração 3

4 periódica de um espectrofotômetro é necessária já que, com o passar do tempo, há desgaste físico de alguns componentes ópticos do equipamento, possibilitando alterações dos valores das medições de absorbância e de comprimento de onda, que são as duas escalas de medição de um espectrofotômetro. Outras características, como a uniformidade das cubetas e o controle da luz espalhada, também devem ser mensuradas e consideradas para maior exatidão dos resultados de medição. A escala de comprimento de onda é utilizada nas análises químicas como escala de referência para as medições, sendo os parâmetros de medida pré-determinados por metodologias descritas em normas, como por exemplo o Método da EPA, no qual a análise colorimétrica de amônia é realizada exatamente no comprimento de onda de 425 nm [9]. Os MRC utilizados para calibração dessa escala possuem alterações na absorbância em diferentes comprimentos de onda. A escala fotométrica é muito utilizada pelos laboratórios para traçar curvas analíticas de diferentes analitos e se descobrir a concentração da amostra desconhecida. Nessa escala, devem ser utilizados mais de um MRC para determinados comprimento de onda, verificando, assim, a linearidade da escala de absorbância. Dessa forma, a verificação da confiabilidade das medições espectrofotométricas pode ser garantida através da calibração e verificação periódica, levando em consideração todas as fontes de incerteza que influenciam no processo de medição. 2. OBJETIVO O objetivo deste artigo é estabelecer alguns requisitos de calibração e verificação de espectrofotômetros UV-Vis proposto por normas ASTM que atendam a ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005 e mostrar a importância da calibração do equipamento antes de sua utilização nas medições realizadas por laboratórios analíticos. 3. MÉTODOS E MATERIAIS De acordo com as normas ASTM E275 [4], ASTM E925 [6] e ASTM E958 [7], para a calibração da escala de comprimento de onda na região do UV-VIS, podem ser utilizados os seguintes materiais: - MRC de óxido de hólmio em ácido perclórico - MRC de filtro sólido de hólmio 4

5 - MRC de filtro sólido de didímio - Cubeta com vapor de benzeno - Lâmpadas de descarga de baixa pressão contendo mercúrio, cadmio, deutério ou zinco. Para a calibração da escala fotométrica (transmitância/absorbância) na região do visível, podem ser utilizados os seguintes materiais: - MRC de filtro de vidro de densidade neutra (conjunto) - Sulfato de cobre em ácido sulfúrico Para a calibração da escala fotométrica (transmitância/absorbância) na região do UV, podem ser utilizados os seguintes materiais: - MRC de dicromato de potássio (conjunto) - MRC de ácido nicotínico (conjunto) - MRC de filtro de quartzo metalizado Para a verificação das cubetas, utilizam-se: - Cubeta de vidro - Cubeta de quartzo Na verificação da luz espalhada, os seguintes materiais podem ser utilizados: - Solução de KCl, NaBr, NaI, KI e Acetona para a região do UV - Solução de NaNO 2 e os filtros sólidos de VG10, OG570, RG610 ou RG780 para a região do visível 4. RESULTADO E DISCUSSÕES 4.1 Calibração da Escala de Comprimento de Onda A primeira questão que deve ser abordada é o grau de precisão do comprimento de onda exigido. Os fatores mais relevantes a se considerar são a largura de banda espectral do instrumento e o grau de complexidade das características na absorção espectral do material medido. Dependendo do grau de precisão exigido pelo usuário do equipamento, os padrões de calibração podem mudar. A calibração da escala de comprimento de onda é o passo mais importante na avaliação do desempenho de um espectrofotômetro UV-Vis, pois ela afeta diretamente na localização do pico de absorção no qual se deseja ser analisada a absorbância. A calibração é realizada medindo artefatos que foram calibrados para o comprimento de onda em máximos ou mínimos em seus espectros de absorbância. 5

6 Velocidade de varredura Existem alguns fatores que influenciam nos resultados de medição deste parâmetro, que devem ser considerados pelos usuários para determinar a especificação do equipamento mais adequado para suas medições, por exemplo, a largura da banda espectral e a velocidade de varredura [3]. O aumento da banda espectral pode comprometer a quantidade de picos identificados no espectro, já que o alargamento da banda espectral tem influência nos pico individuais, dificultando a localização do mesmo. Pode também atrapalhar na identificação de picos de absorção próximos no espectro, pois podem acabar se sobrepondo, dificultando a visualização. Um exemplo de dificuldade de identificação do número de picos no espetro pode ser observado na Figura 3. Figura 3 Comparação dos espectros de transmitância do óxido de hólmio em diferentes larguras de banda Outro fator de grande influência para os resultados de medição é a velocidades de varredura. A velocidade de varredura, quando é aumentada, pode deslocar a posição do pico de absorbância, gerando maiores erros na escala de comprimento de onda. Um exemplo do deslocamento do pico de absorção pode ser verificado na Tabela 1. Tabela 1 Pico de transmitância da solução de óxido de hólmio em 536 nm obtido com diferentes velocidades de varredura Valor certificado do SRM 2034 do NIST 536,42 nm 20 nm/min 536,47 nm 150 nm/min 535,95 nm 300 nm/min 536,80 nm Na calibração da escala de comprimento de onda de um espectrofotômetro UV-Vis são empregados MRC apropriados que apresentam bandas de absorção bem definidas e resolvidas, em diferentes intervalos de comprimento de onda. A largura de banda espectral e a velocidade de varredura são selecionadas a fim de melhorar a resolução do espectro e 6

7 encontrar o melhor desempenho do equipamento. Também é importante verificar com o usuário qual a largura de banda e a velocidade de varredura que ele utiliza em sua rotina para suas medições, para que a calibração contemple os parâmetros do usuário. Dentre os diferentes MRC utilizados para calibração do parâmetro de comprimento de onda, destacam-se os filtros de vidro de didímio e de óxido de hólmio (Figura 4). O filtro de didímio (uma mistura de praseodímio e neodímio) apresenta um grande número de bandas de absorção nas regiões espectrais do visível e do infravermelho próximo. Já o filtro sólido de óxido de hólmio, apresenta picos de absorção mais estreitos na região do UV e do visível. Figura 4 Espectro de transmitância do filtro de vidro de didímio (A) e filtro de vidro de óxido de hólmio (B) O MRC de óxido de hólmio em ácido perclórico também é muito utilizado na calibração, pois ele provê linhas mais nítidas e menos dependentes da matriz do que as matrizes de vidro e disponibiliza um pico de absorção em 241 nm que não é facilmente mensurável no vidro de hólmio. O espectro de absorção da solução ácida de óxido de hólmio pôde ser visualizado na Figura 2. Alguns espectrofotômetros UV-Vis contém um compartimento para lâmpadas de descarga de baixa pressão. Nesses casos, a verificação do comprimento de onda pode ser realizada operando as lâmpadas e girando o monocromador para isolar as linhas espectrais emitidas. Nesse tipo de verificação deve-se utilizar a menor largura de banda espectral que o equipamento permitir, proporcionando uma alta precisão [10]. As lâmpadas de descarga de baixa pressão mais utilizadas são as que contêm mercúrio ou deutério. Os comprimentos de onda cujas linhas espectrais se destacam estão descritos na Tabela 2 e um exemplo de espectro de emissão de uma lâmpada de descarga de baixa pressão encontra-se na Figura 5. As normas ASTM E275 [4] e ASTM E958 [7] indicam o procedimento da realização da calibração com as lâmpadas de descarga de baixa pressão. 7

8 Tabela 2 Linhas de emissão do zinco, cádmio, mercúrio e deutério Elemento Comprimento de Comprimento de Elemento Onda (nm) Onda (nm) Mercúrio 185,0 Cádmio 467,8 Zinco 213,9 Deutério 486,0 Cádmio 228,8 Mercúrio 579,1 Mercúrio 365,0 Cádmio 643,8 Mercúrio 404,7 Deutério 656,1 com dados da ASTM E958 [7] Figura 5 Espectro de emissão da lâmpada de mercúrio Fonte: ASTM E275 [4] 4.2 Calibração da Escala Fotométrica A calibração da escala fotométrica de absorbância ou transmitância de um espectrofotômetro UV-Vis é de grande importância. Como a concentração de uma substância que absorve a radiação UV-Vis usualmente é diretamente proporcional à medida da absorbância (conforme apresentado pela lei de Lambert Beer em (3)), a linearidade e a estabilidade da escala fotométrica deve ser confirmada. Uma compreensão adequada de qualquer desvio da linearidade desta escala é essencial para a calibração do espectrofotômetro como uma ferramenta analítica para a medição da concentração dos analitos de interesse. Esta calibração é realizada medindo a absorção de artefatos que foram calibrados para absorbância ou transmitância em comprimentos de onda especificados. A norma ASTM E925 [6] indica os comprimentos de onda em que devem ser realizadas as calibrações da escala fotométrica tanto para a região do visível quanto para a região do UV. No caso da calibração da escala fotométrica na região do visível, isso pode ser feito com facilidade e precisão empregando-se MRC cuja absorbância varia pouco com o comprimento de onda [10], ou seja, são espectralmente planos; esses materiais são chamados de filtros de densidade neutra (Figura 6). Para a região do visível ainda há a opção de utilizar soluções de sulfato de cobre de 8

9 diferentes concentrações em 1% de ácido sulfúrico. Figura 6 Espectro de transmitância dos filtros de densidade neutra No caso de calibração da escala fotométrica na região do UV, geralmente são utilizadas soluções de dicromato de potássio de diferentes concentrações em meio ácido. Elas são fornecidas em cubetas seladas ou em ampolas para utilização única. No caso das soluções de dicromato de potássio, são realizadas as medições em picos e vales do espectro do composto, conforme pode ser verificado na Figura 7. Figura 7 Espectro das soluções de dicromato de potássio em diferentes concentrações Filtros sólidos de quartzo metalizado podem ser utilizados como uma opção para a calibração da escala fotométrica na região do UV, porém eles funcionam de forma diferente dos demais filtros. Os filtros de quartzo metalizado refletem a radiação ao invés de absorver, as camadas finamente depositadas das ligas metalizadas são utilizadas como superfície refletora. Sendo assim, alguns cuidados particulares devem ser tomados referentes à luz espalhada isocromática, já que há uma probabilidade desses filtros ocasionarem luz espalhada, 9

10 especialmente nos instrumentos utilizados em análise de rotina. Esses filtros também podem ocasionar reflexões múltiplas entre o filtro e os outros componentes, além de serem mais vulneráveis de arranhões e às vezes terem problemas a respeito da não homogeneidade espacial. Apesar disso, os filtros têm demonstrado estabilidade e aplicabilidade na faixa do UV [11]. Além da calibração com MRC, é necessário realizar verificações de alguns fatores que influenciam significativamente nessa escala, como, por exemplo, a luz espalhada (que será abordada no item 4.4), o ruído, a estabilidade e a linearidade fotométrica [3]. Caso não sejam verificadas e consideradas, essas influências podem alterar os valores medidos de absorbância, gerando resultados incorretos. A norma ASTM E1866 [8] prevê os testes para verificação da estabilidade, linearidade e ruído fotométrico. A estabilidade fotométrica é um parâmetro que indica quão estável um espectrofotômetro é em um determinado tempo. A estabilidade a curto e longo prazo é determinada, principalmente, pelos elementos na construção do equipamento. A linearidade fotométrica determina a precisão dos instrumentos na medição de absorção a partir do aumento da concentração. Problemas na linearidade do espectrofotômetro podem produzir resultados incorretos. Ela pode ser expressa como um coeficiente de correlação gerado a partir de dados experimentais, ou seja, é a relação linear entre a potência radiante incidente no detector do instrumento e outra quantidade medida do sistema. O ruído fotométrico é causado pelas flutuações na velocidade que os fótons da radiação das lâmpadas incidem no detector. O sinal de saída de um instrumento analítico flutua de uma forma aleatória, essas flutuações limitam a precisão do instrumento e representam o resultado de um grande número de variáveis incontroláveis do instrumento e do sistema químico em estudo. O termo ruído é empregado para descrever essas flutuações e cada variável não-controlada é uma fonte de ruído. Fontes comuns de ruído incluem: vibrações, interferência da rede elétrica, variações de temperatura, flutuação de frequência ou voltagem nas fontes de alimentação e incidência aleatória de fótons no detector. O ruído fotométrico é a medida da relação sinal/ruído do instrumento. O teste é realizado em função do tempo, determinando a variação da absorção em para um comprimento de onda fixo. 4.3 Verificação das Cubetas Erros de medição podem ser gerados pelas mais diversas fontes. No caso da 10

11 espectrofotometria, uma delas pode ser a cubeta de medição utilizada para as análises. Caso haja algum problema nesse item, haverá erros de medição na escala fotométrica. Desvios nas medidas de absorbância podem ocorrer caso as cubetas estejam sujas ou riscadas. Os erros podem aumentar se os comprimentos das cubetas (caminho óptico) forem diferente do especificado, se as paredes das cubetas não forem paralelas, ou ainda se houver diferenças na espessura das paredes. É importante que haja cuidado no manuseio das cubetas, para sempre mantê-las limpas e adequadas ao uso. Durante a limpeza das mesmas, é importante retirar todo o resíduo de amostras anteriores, utilizando solventes adequados e evitando o uso de agentes corrosivos. Cuidados para não riscar nem arranhar as paredes devem ser empregados e elas devem ser manuseadas corretamente: existe local adequado para segurá-las (lateral) e não deixar impressões digitais nem gordura das mãos. Quando é necessário utilizar-se de uma cubeta de referência com o branco de medição, é importante que sejam escolhidas cubetas com valores próximos de absorção para compensar perdas de potência da radiação incidente por reflexão e espalhamento. O material da qual a cubeta é feita também poderá ter um impacto nas medições dependendo da região do espectro UV-Vis de interesse. O vidro absorve a radiação com mais alta em energia a partir de cerca de 300 nm; portanto, se a amostra absorver no UV, uma cubeta de quartzo deverá ser empregada (e não a de vidro), pois o corte de absorbância é de cerca de 160 nm para o quartzo (Figura 8). Figura 8 Espectro de transmitância do vidro, acrílico, quartzo e sílica Fonte: Para os usuários de espectrofotômetro UV-Vis, é importante que as cubetas sejam 11

12 verificadas regularmente e uma verificação usual é medir a transmitância das cubetas preenchidas com água, tendo como referência o ar. As medições devem ser realizadas - para cubetas de vidro, em 356 nm e 650 nm - para cubetas de quartzo, em 220 nm e 240 nm e a transmitância medida deve ser maior que 0,85 no menor comprimento de onda e maior que 0,88 no maior comprimento de onda [10]. 4.4 Controle da Luz Espalhada A luz espalhada, também conhecida como luz dispersa ou espúria, é a dispersão de luz indesejada que alcança o detector. A luz espalhada pode ser categorizada em dois tipos: a heterocromática e a isocromática e os dois tipos devem ser avaliados. A norma ASTM E387 [5] prevê os testes necessários para avaliação da luz espalhada. A luz espalhada heterocromática é aquela que a luz do monocromador de comprimentos de onda diferentes do selecionado passa pela amostra e é detectada pelo detector. Já a luz espalhada isocromática é a luz do comprimento de onda selecionado que é disperso no feixe que sai da câmara de amostra sem passar pela amostra. A Figura 9 ilustra as duas categorias de luz espalhada. Figura 9 Tipos de luz espalhada A luz espalhada heterocromática ocorre quando o detector não consegue diferenciar a luz incidente e a luz dispersa na amostra, juntando os dois sinais e gerando, assim, indicações erradas. Esse comportamento depende também tanto da sensibilidade do detector quanto da distribuição espectral da fonte. A luz espalhada heterocromática tem a tendência de aumentar com o passar do tempo do equipamento e frequentemente não é verificada nem suspeita, 12

13 sendo uma das razões para ser medida periodicamente. O valor da quantidade de luz espalhada heterocromática pode ser avaliado usando filtros de corte, exemplificados na Tabela 3. Tabela 3 Filtros de corte para avaliação da luz espalhada heterocromática Filtro Comprimento de Comprimento de Filtro onda de corte onda de corte KCl 12 g/l 200 nm NaNO 2 50 g/l 385 nm NaBr 10 g/l 223 nm VG nm NaI 10 g/l 259 nm OG nm KI 10 g/l 259 nm RG nm Acetona 325 nm RG nm com dados da ASTM E387 [5] e Clare,2005 [10] A luz espalhada isocromática ocorre quando há reflexão das radiações dentro do compartimento de amostra do espectrofotômetro. Ela pode ser quantificada com um simples teste na qual é quantificado o valor detectado quando se insere um bloqueador no compartimento de cubeta que absorve totalmente a radiação e se compara com o valor obtido quando o bloqueador é colocado na saída do compartimento de amostra, conforme ilustrado na Figura 10. Figura 10 Teste para quantificação da luz espalhada isocromática 4.5 Estimativa da Incerteza de Medição A planilha de cálculo da estimativa da incerteza de medição para a calibração da escala de comprimento de onda do espectrofotômetro UV-Vis pode ser verificada na Tabela 4 e para a calibração da escala fotométrica do espectrofotômetro UV-Vis pode ser verificada na Tabela 5. 13

14 Tabela 4 Planilha de estimativa da incerteza de medição na calibração da escala de comprimento de onda do espectrofotômetro UV-Vis Fonte de Incerteza Tipo da Distribuição de Unidade de Coeficiente de Unidade Graus de Incerteza Probabilidade Entrada Sensibilidade de Saída Liberdade Largura da Banda Espectral A Normal nm 1,00 nm *n 1 Velocidade de Varredura A Normal nm 1,00 nm *n 1 Lâmpada de Deutério A Normal nm 1,00 nm *n 1 Reprodutibilidade B Retangular nm 1,00 nm Infinito Rastreabilidade do MRC Resolução do Equipamento B Normal nm k (certificado) nm Veff (certificado) B Retangular nm 1,00 nm Infinito Legenda: * n = número de medições Tabela 5 Planilha de incerteza de medição na calibração da escala fotométrica do espectrofotômetro UV-Vis Fonte de Incerteza Tipo da Distribuição de Unidade de Coeficiente de Unidade Graus de Incerteza Probabilidade Entrada Sensibilidade de Saída Liberdade Comprimento de onda A Normal nm Ci %T Veff Repetibilidade A Normal %T 1,00 %T *n 1 Estabilidade fotométrica A Normal %T 1,00 %T *n 1 Reprodutibilidade B Retangular %T 1,00 %T Infinito Rastreabilidade Veff B Normal %T k (certificado) %T do MRC (certificado) Resolução do Equipamento B Retangular %T 1,00 %T Infinito Luz espalhada heterocromática A Normal %T 1,00 %T *n 1 Luz espalhada isocromática A Normal %T 1,00 %T *n 1 Legenda: Ci = depende de cada tipo de filtro ; * n = número de medições 5. CONCLUSÕES Este trabalho apresentou a importância da calibração e verificação periódica do espectrofotômetro UV-Vis, além uma revisão dos principais fatores a serem considerados na verificação de seu desempenho e as principais fontes de incerteza a serem consideradas no cálculo de incerteza da calibração do equipamento. Apresentou também as normas envolvidas que descrevem a caracterização periódica do instrumento (ASTM E925), os ensaios de performance que devem ser realizados (ASTM E1866), as estimativas das luzes espalhadas (ASTM E387) e os parâmetros que influenciam as medições (ASTM E275). 14

15 Referências Bibliográficas: [1] Galo, A.L e Colombo, M.F. Espectrofotometria de longo caminho óptico em espectrofotômetro de duplo-feixe convencional. Química Nova, V.32, Nº2, 2009 [2] Acessado em 10/07/2017. [3] Gomes, J.F.S., et. al. Desempenho de Espectrofotômetros UV/Vis/IVP: Emprego dos Materiais de Referência. ENQUALAB Congresso da Qualidade em Metrologia, 2008 [4] ASTM E275 Standard Practice for Describing and Measuring Performance of Ultraviolet, Visible and Near Infrared Spectrophotometers, 2001 [5] ASTM E387 Standard Test Method for Estimating Stray Radiant Power of Spectrophotometers by the Opaque Filter Method, 2004 [6] ASTM E925 Standard Practice for Periodic Calibration of Narrow Band-pass Spectrophotometers ; 2002 [7] ASTM E958 Standard Practice for Measuring Practical Spectral Bandwidth of Ultraviolet-Visible Spectrophotometers ; 1993 [8] ASTM E1866 Standard Guide for Establishing Spectrophotometer Performance Tests, 1997 [9] EPA Method Nitrogen, Ammonia (Colorimetric, Titrimetric, Potentiometric Distillation Procedure), [10] Clare, J.F. Calibration of UV vis spectrophotometers for chemical analysis. Accreditation and Quality Assurance, V.10, 2005 [11] NBS Special Publication Metal-On-Quartz Filter as a Standard Reference Material for Spectrophotometry SRM 2031,