Implementação e Validação de Métodos Analíticos

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1 Alexandra Sofia Reynolds Mendes Laboratório Regional de Controlo da Qualidade da Água Estação da Alegria 9050-FUNCHAL Resumo Este artigo tem como principal objectivo descrever as principais etapas associadas à implementação e validação de um método analítico. Apresenta-se um exemplo: implementação e validação de um método em Absorção Atómica com Câmara de Grafite para determinação da concentração de alumínio em aguas de consumo humano 1. Introdução A validação de um método analítico é um aspecto crucial da garantia da qualidade analítica pelo tem recebido uma atenção considerável por parte da comunidade cientifica, comités industriais e entidades reguladoras. Isso ocorre pela necessidade de uniformizar os critérios utilizados com o fim de demonstrar que um método de ensaio, nas condições em que é praticado tem as características necessárias para assegurar a obtenção de resultados com a qualidade exigida. Um método de ensaio é um processo que envolve manipulações susceptíveis de acumularem erros (sistemáticos e/ou aleatórios), o que, em algumas situações, pode alterar de forma significativa o valor do resultado final.

2 A implementação de um método analítico pode por vezes ser entediante, mas as consequências de não se fazer correctamente podem ser desastrosas pois se traduzem em perda de tempo, de dinheiro e outros recursos.. Mas então o que é a validação de um método? Segundo a Norma NP EN ISO/IEC 1705, Validação é a confirmação, através de exame e apresentação de evidência objectiva, de que os requisitos específicos relativos a uma dada utilização são cumpridos. A validação de um método analítico permite demonstrar que o método é adequado ao uso pretendido. Sempre que um laboratório execute ensaios terá que instruir um processo de validação do método durante a sua implementação, ou sempre que ocorra uma alteração relevante do mesmo, o qual incluirá todos os registos obtidos. A validação de um método deve ser adaptada caso a caso, sendo progressivamente mais exigente para as seguintes situações: Extensões e/ou modificações de métodos normalizados; Métodos normalizados utilizados fora do âmbito de utilização prevista; Métodos Não Normalizados; Métodos criados e desenvolvidos pelo próprio laboratório. A validação inclui: A especificação dos requisitos; A determinação das características do método;

3 Metrologia e Qualidade Uma verificação de que os requisitos podem ser satisfeitos utilizando o método em causa; Uma declaração de validade. Os parâmetros de validação de um método analítico incluem: A gama de linearidade; Limiares analíticos (limite de detecção e limite de quantificação); A repetibilidade/reprodutibilidade; A exactidão; A selectividade do método; A robustez a influências externas; A incerteza dos resultados. A LINEARIDADE PODE SER AVALIADA POR: Representação gráfica e cálculo do coeficiente de correlação Variáveis Dependentes Variáveis Dependentes Variáveis Independentes Variáveis Independentes r = { ( xi x)( yi y) } ( xi x) yi [ ][ ( y) ] 1 r 1

4 Análise de residuais (ex.: razão entre os valores de y experimentais e os valores de y estimados) Variáveis Dependentes 1, 1 0,8 Variáveis Independentes Aplicação da norma ISO 8466 Calibração e Avaliação de Métodos Analíticos e Estimativa das Características do Desempenho : Teste da Homogeneidade das Variâncias (comparação estatística da variância do padrão mais concentrado S M com a do padrão menos concentrado S m da curva, visto que estas normalmente apresentam uma maior variância). O valor teste é calculado pelas equações: sm sm VT = s para s s VT = M m e s para s s m M m M E é comparado com o valor tabelado na distribuição de Fisher. A decisão estatística é a seguinte: Se VT F a diferença entre as variâncias não é significativa.

5 Metrologia e Qualidade Se VT > F a diferença entre as variâncias é significativa e a gama de trabalho deve ser reduzida até que esta se deva apenas a erros aleatórios. Teste da Linearidade (comparação estatística do valor teste com o valor tabelado da distribuição de Fisher, para 1 g.l.) O valor teste é calculado pelas equações: DS = ( N ) s ( ) / (1º) N 3 s / (º) y x y x VT = onde : DS s y / x(º) s y / x(1º) Desvio padrão residual da curva de calibração linear. s y / x ( º) Desvio padrão residual da curva de calibração não linear. A decisão estatística é a seguinte: Se VT F, a função de calibração linear conduz a um melhor ajuste dos pontos. Se VT > F, a função de calibração linear não conduz a um melhor ajuste dos pontos. A gama de concentrações deve

6 ser reduzida ou então aplica-se uma função de calibração não linear. 3. Limiares Analíticos Os conceitos de limite de detecção (Ld) e de quantificação (Lq) devem ser entendidos conforme recomendado pela IUPAC, isto é: o limite de detecção corresponde ao início da gama em que é possível distinguir com uma dada confiança estatística (normalmente 95 %), o sinal do branco do sinal da amostra, e como tal indicar se o analito em questão está ausente ou presente; a gama entre o Ld e o Lq deve ser entendida como uma zona de detecção qualitativa, e não quantitativa, pelo que não se devem reportar valores numéricos nesta gama; o limite de quantificação corresponde ao início da gama em que o coeficiente de variação (incerteza relativa) do sinal se reduziu a valores razoáveis (normalmente 10 %) para se poder efectuar uma detecção quantitativa; deste modo, na prática deve usar-se o Lq como início da zona em que se reportam valores numéricos. Assim, na gama baixa, o 1º padrão de calibração deve ser igual ou ligeiramente superior ao limite de quantificação. Podem ser usados dois métodos para o cálculo dos referidos limites: a partir de uma série de ensaios com um branco representativo (ou um padrão de baixa concentração, caso o branco não tenha flutuação significativa), e calculando a respectiva média e desviopadrão; recomenda-se a que sejam utilizados brancos

7 Metrologia e Qualidade independentes para obter esta estimativa (dias diferentes, condições de rotina): LD + = x0 3, 3s0 LQ = x s0 a partir da estatística de mínimos quadrados da recta de calibração, admitindo-se que o desvio-padrão da estimativa (Sy/x ver ISO ) representa o desvio-padrão do branco representa o desvio padrão do branco: 3,3s0 10s0 LD = LQ = declive declive O LQ estimado deverá ser confirmado experimentalmente com um padrão de concentração semelhante. 4. Repetibilidade/Reprodutibilidade repetibilidade é a aproximação entre os resultados de medições sucessivas da mesma mensuranda, efectuadas nas mesmas condições de medição no mais curto espaço de tempo, isto é: o mesmo laboratório; o mesmo analista; o mesmo equipamento; o mesmo tipo de reagentes. reprodutibilidade é a aproximação entre resultados das medições da mesma mensuranda efectuada com alteração de pelo menos uma das condições de medição, ou seja:

8 o o o o mesmo laboratório ou diferentes laboratórios; diferentes analistas; diferentes equipamentos; e/ou diferentes épocas. A repetibilidade e a reprodutibilidade podem exprimir-se quantitativamente em termos das características da dispersão dos resultados. s = n ( xi x) ( 1) CV xo s = x xo 100(%) 5. Exactidão A exactidão é definida como a aproximação entre o resultado da medição e o valor verdadeiro da mensuranda. A exactidão de um método analítico pode ser determinada: através da participação em ensaios interlaboratoriais, pelo estudo de materiais de referência certificados, através de ensaios fortificados, por comparação com métodos de referência. A exactidão é um parâmetro qualitativo que pode ser avaliado por testes de significância estatística. ( x µ ) n s t = /

9 Metrologia e Qualidade 6. Selectividade A selectividade do método é a capacidade deste para identificar e distinguir um determinado analito numa mistura complexa, sem interferência de outros componentes. A selectividade do método deve ser estudada usando várias amostras, desde soluções padrão a misturas de matrizes complexas ou elementos considerados potenciais interferentes. A selectividade do método é demonstrada como o desvio dos resultados obtidos pela análise do analito em causa em amostras fortificadas com todos os potenciais interferentes e os resultados obtidos com amostras não fortificadas, isto é, contendo somente o analito. Quando se desconhecem os interferentes, a selectividade do método pode ser investigada por comparação dos resultados obtidos com outros métodos. 7. Robustez A robustez do método define-se pela capacidade que um método tem para resistir a pequenas variações durante a sua execução. Deve ser investigada na etapa de desenvolvimento do método. Os testes de robustez avaliam essencialmente a alteração a parâmetros identificados à partida como críticos. Deste modo, um teste de robustez bem conduzido, evidenciará as etapas do método em que o rigor é critico e aquelas em que há alguma tolerância. Para se determinar a robustez de um método pode-se utilizar o teste de YOUDEN ou, testar o método em situações de precisão intermédia, isto é, fazendo variar as condições operatórias dentro do próprio laboratório.

10 8. Conclusões A validação de um método é um processo constante e dinâmico. Um processo de validação bem definido e documentado fornece evidência objectiva de que o sistema e o método são adequados ao uso pretendido. 9. Bibliografia consultada Validação de Métodos Analiticos: Paula Teixeira. João Seabra Barros. INETI DEECA. Maio 003. Vocabulário Internacional de Metrologia. Termos Fundamentais e Gerais. ª Edição. Instituto Português da Qualidade (1996). Guia para a Acreditação de Laboratórios em Ensaios Químicos. Instituto Português da Qualidade (000). NP EN ISO/IEC 1705 Requisitos Gerais de Competência para Laboratórios de Ensaio e Calibração. Instituto Português da Qualidade (000). Quantifying Uncertainty i Analytical Measurement. Eurachem/Citac Guide º Ed. (000). ISO 575-1:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 1. General principles and definitions ISO 575-:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part. Basic methods for the determination of repeatability and reproductibility of a standard measurement method.

11 Metrologia e Qualidade ISO 575-3:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 3. Intermidiate measures of the precision of a standard measurement method. ISO 575-4:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 4. Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method. ISO 575-6:1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Use in practice of accuracy values. Guia Relacre 13