POTENCIAL PROBIÓTICO IN VITRO DE BACTÉRIAS E LEVEDURAS ISOLADAS DE BEBIDA ÁLCOOL-ÁCIDA DE MURICI FERMENTADA COM GRÃOS KEFIR

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1 POTENCIAL PROBIÓTICO IN VITRO DE BACTÉRIAS E LEVEDURAS ISOLADAS DE BEBIDA ÁLCOOL-ÁCIDA DE MURICI FERMENTADA COM GRÃOS KEFIR Nome dos autores: Samara Cardoso Alves¹; Claudia Cristina Auler do Amaral Santos² 1 Aluno do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; e- mail:samaracard@uft.edu.br 2 Orientador(a) do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; claudiauler@mail.uft.edu.br RESUMO O kefir é uma bebida que possui culturas microbianas com propriedades probióticas, como bactérias do ácido lático (BAL) e leveduras (LEV) e é considerada um alimento funcional. Este trabalho teve como objetivo avaliar a composição da polpa de murici e realizar a comparação entre os parâmetros físico-químicos e microbiológicos de bebidas fermentadas a partir de grãos de quefir de água, utilizando açúcar mascavo ou polpa de murici. Realizou-se a conservação dos grãos de kefir, seguida da preparação da polpa de murici para ser usada como suplemento. Realizou-se o processo fermentativo em solução de açúcar mascavo a 12 Brix e em solução contendo polpa de murici. Os isolados passaram por caracterização morfotintorial e testes bioquímicos. A polpa apresentou o valor de ph 2,95, com acidez total de 0,48%, cinzas foi de 2,11%, proteína 4,74%, lipídeos 26,87% e umidade 87,05 %. Foram obtidos 21 isolados bacterianos e 23 isolados de leveduras. Quarenta e sete dos isolados bacterianos apresentaram a forma de cocobacilos e 28,57% foram cocos, Gram-positivos e catalase negativos, com resultado positivo para o teste de motilidade. Para os isolados de levedura 65% dos isolados mostraram ter a forma de células ovoidal, e 28% de forma esferoidal. O crescimento dos isolados no meio sem a adição de polpa de murici apresentou pequenas variações. Obteve-se uma contagem de 6,8 Log UFC/mL para as BAL e de 5,2 Log UFC/mL para as LEV. Assim, foi possível obter isolados potenciais bactérias do ácido lático e leveduras para serem testadas com relação ao seu potencial biotecnológico para serem aplicadas na indústria como probióticos. Palavras-chave: funcional; cerrado; biotecnologia; saúde. Página 1

2 INTRODUÇÃO Ao longo da história, desenvolveram-se várias pesquisas envolvendo bactérias do ácido lático (BAL) e outros microrganismos, como exemplo, é o uso de BAL para Biocontrole em Leite (BAPTISTA, 2010). Esses microrganismos podem vir a trazer benefícios ao alimento que se deseja produzir, incluindo a conservação das propriedades nutricionais, maior segurança alimentar e melhora no sabor do produto, além da conservação da microbiota desejável (COSTA et al, 2013). Neste aspecto, destaca-se a utilização dos grãos de kefir como fonte de probióticos, pois estes grãos apresentam em sua composição algumas culturas com propriedades probióticas (BAPTISTA, 2010). Os microrganismos presentes no Kefir produzem compostos de aroma e sabor durante a fermentação, tornando os produtos obtidos através de fermentação com Kefir diferenciados (CARNEIRO, 2010). Os grãos de kefir possuem uma grande diversidade microbiana, com elevada heterogeneidade entre si, variando com a origem dos grãos e dos diferentes cultivos. Os principais microrganismos são as BAL do gênero Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus e Enterococcus, bactérias ácido-acéticas do gênero Acetobacter e leveduras do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces e Candida (SANDES, 2013). Os grãos cultivados em água com a presença de sacarose e de frutas são grãos opacos e translúcidos, em que sua cor varia de acordo com o substrato usado. O kefir é considerado um produto funcional, por possuir funções nutricionais básicas e promover efeitos fisiológicos e metabólicos benéficos à saúde. O desenvolvimento de uma bebida álcool-ácida fermentada a partir de grãos de kefir de água suplementada com a polpa de murici, promoverá o aproveitamento dos atrativos como cor, sabor e aroma peculiar e intenso ainda pouco explorado comercialmente, desse fruto do cerrado. O isolamento de microrganismos, a partir do kefir de água, é relevante para de um banco de microrganismos, a fim de selecionar a estipe mais adequada para o uso e alimentos e bebidas potencialmente probióticos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma nova bebida álcool-ácida fermentada a partir de grãos de kefir de água Página 2

3 suplementada com a polpa de murici, isolar BAL e leveduras e caracterizar suas potencialidades quanto probióticos. MATERIAL E MÉTODOS Os grãos de kefir foram propagados em condições padronizadas para que se eliminem possíveis variações de resultados no processo de cultivo. Realizou-se a sanitização dos frutos. A seguir foi realizado o despolpamento, para a preparação do mosto. Amostras foram retiradas para a realização da caracterização da polpa, que inclue sólidos solúveis, cinzas, proteína, (AOAC, 1990), acidez titulável, ph, lipídeos e umidade (IAL, 2008). De acordo com Puerari e colaboradores (2012), para a elaboração da bebida fermentada preparou-se uma solução com concentração de 3,73% (m/v) de açúcar mascavo, o ºBrix dessa solução foi ajustado para se obter uma relação entre este e a concentração de açúcar na solução. Em seguida foi preparada uma solução com polpa de murici, com concentração de 16,7% (m/v). Três Erlenmeyers para cada substrato (açúcar mascavo e a polpa de murici) foram preparados contendo 257 ml de água destilada autoclavada. O inóculo foi cultivado em uma solução de sacarose, durante sete dias. Após esse procedimento, 30,0 g de grãos de kefir foram inoculados em 225 ml de mosto. O processo fermentativo foi conduzido em condições estáticas em estufa bacteriólogica a 25ºC por 24 horas. Amostras da bebida foram retiradas em intervalos de 4 horas para a verificação dos parâmetros físico-químicos e microbiológicos. As BALs e leveduras foram isoladas das fermentações conduzidas somente com o açucar mascavo e também com a polpa de murici. As amostras foram devidamente diluídas em solução salina tamponada (5,61g NaCl, 1,0g KH 2 PO 4, NaHPO 4, 0,11g KCl por litro), e plaqueadas pelo método Spread-plate em meio seletivo para bactérias láticas (BALs), Ágar De Man, Rogosa e Sharpe (MRS), e também em meio Extrato de Levedura, Peptona e Glicose (20g glicose, 20g peptona, 10g extrato de levedura, 15g de Página 3

4 ágar por litro) para leveduras. Após o período de incubação, as colônias crescidas nas placas foram classificadas de acordo com as características e as estruturas morfológicas. As bactérias isoladas foram submetidas ao teste de coloração diferencial de Gram. Os isolados também foram analisados, em microscópio óptico, quanto à forma e o arranjo das células. Em seguida as bactérias que se enquadraram no grupo de grampositivas, foram sujeitas aos testes bioquímicos de KOH, catalase, motilidade, e bactérias gram-negativas foram submetidas aos testes de KOH, catalase e oxidase, seguindo as indicações recomendadas em Bergey s Mannual of Determinative Bacteriology (BUCHANAN, 1974). Para caracterização de leveduras foram realizadas análises morfológicas das colônias e células de acordo com Kurtzman e Fell (1998). RESULTADOS E DISCUSSÃO A polpa apresentou o valor de ph 2,95, com acidez total de 0,48%, cinzas 2,11%, proteína 4,74%, lipídeos 26,87% e umidade 87,05 %. Com relação à caracterização visual das colônias presentes nos meios seletivos YEPG e MRS, X ou X% isolados do meio MRS (21) apresentaram coloração branca e bege, forma circular, bordas lisas, estrutura lisa e são opacas. Já os 23 isolados do meio YEPG apresentaram coloração creme, forma circular e irregular, com bordas onduladas e lisas, estruturas convexas, protuberantes, rugosas, opacas, brilhosas e translúcidas. Quarenta e oito por cento dos isolados bacterianos apresentaram a forma de cocobacilos e 28,6% de cocos, sendo Gram-positivos e catalase negativos, podendo ser classificados como potenciais BAL, segundo OLIVEIRA et al, (2006). Os 21 isolados obtiveram um resultado positivo no teste de motilidade, indicando que são bactérias móveis, que pode ser uma das caraterísticas das bactérias do ácido lático, mesmo sendo rara (GONÇALVES, 2009). Sessenta e cinco por cento dos isolados de leveduras mostraram ter a forma de células ovoidal, e 28% de forma esferoidal. Os demais isolados apresentaram formas cilindroidal e uma pequena parte ogival. Para todas as leveduras analisadas, a forma de brotamento foi monopolar com ausência de turbo Página 4

5 germinativo. Quanto à caracterização físico-química da bebida durante a fermentação, temos que a acidez total titulável aumentou de 0,2 para 0,4g/100mL, confirmando a acidificação durante o processo fermentativo. O ph decresceu após 24 horas de fermentação de XX para 3,13, apresentando um caráter ácido. O crescimento das bactérias e das leveduras no meio sem a adição de polpa de murici apresentou pequenas variações. Obteve-se uma contagem de 6,8 Log UFC/mL para as BAL e de 5,2 Log UFC/mL para as LEV. Observou-se, que no meio sem a adição da polpa, as bactérias, mantiveram-se com população constante, permanecendo com 6,8 Log UFC/mL. De acordo com Tortora et al.(2010) este comportamento caracteriza uma fase estacionária do crescimento bacteriano. A população de bactérias e leveduras, nas fermentações com a adição da polpa de murici apresentou decaimento inicial, esse comportamento pode ter sido ocasionado pelas as alterações das condições de cultivo, seja pela variação de ph, causada pela adição da polpa de murici ácida, ou pela oferta de novos nutrientes no meio, fazendo com que a fase de adaptação dos microrganismos ao meio se tornasse mais longa. Após 12 horas de fermentação, iniciou-se a fase log, tanto para as bactérias quanto para as leveduras, tendo um máximo crescimento às 16h de cultivo, com um valor de 5,5 Log UFC/mL para as leveduras e 6,6 Log UFC/mL para as bactérias. Após esse período há um decaimento da população de leveduras e bactérias no meio adicionado de polpa de murici. A partir dos dados obtidos, a polpa de murici utilizada neste trabalho obteve um valor significativo para umidade e lipídeos, apresentando um valor de ph baixo, sendo então de caráter ácido. Com relação à caracterização físico química da bebida durante a fermentação, os resultados mostraram que o processo fermentativo desenvolveu-se bem. A maiorias dos microrganismos isolados são potenciais probióticos, devido ao os grãos de kefir ser uma fonte de probiótico, pois estes grãos apresentam em sua composição algumas culturas com propriedades probióticas. Página 5

6 LITERATURA CITADA 18/10 a 09/11 de 2016 Câmpus de Gurupi, Araguaína e Palmas BAPTISTA, E.V. Desenvolvimento de ingredientes simbiótico por fermentação de soro de leite e do subproduto da agroindústria de suco de laranja por grãos de kefir e cultura probiótica Tese de Doutorado. Dissertação de Mestrado em Ciência de Alimentos. State University of Londrina. Brazil. COSTA, H. H. S., SOUZA, M. R., ACÚRCIO, L. B., CUNHA, A. F., RESENDE, M. F. S., NUNES, Á. C. Potêncial probiótico in vitro de bactérias ácido-láticas isoladas de queijo-de-minas artesanal da Serra da Canastra, MG. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.65, p , CARNEIRO, R. P. Desenvolvimento de uma cultura iniciadora para produção de kefir. Dissertação (mestrado em Ciência de Alimentos) Pelo programa de Pós- Graduação em ciência de Alimentos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais,2010. SANDES, S. H. C. Seleção de bactérias láticas com potencial probiótico para uso como promotor de crescimento ou como adjuvante imune em vacinas de mucosa na pecuária bovina f. Dissertação (Mestrado em Genética)- Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, AOAC - Association of Official Analytical Chemists. Chapter 37 Fruits and fruit products. Official Methods of Analyses of AOAC, Washington, 15 ed., v. 2,p , INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do IAL.: métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 5.ed. São Paulo, p. AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio do Programa Institucional Voluntário de Iniciação Científica (PIVIC). Agradecimentos também ao HABITE, incubadora de empresas de biotecnologia da UFT. E ao Laboratório de Biotecnologia/ Análise de Alimentos e Purificação de Produtos (LABAP). Página 6