ISOLAMENTO, ENUMERAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO PRELIMINAR DE LEVEDURAS DE GRÃOS DE KEFIR

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1 ISOLAMENTO, ENUMERAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO PRELIMINAR DE LEVEDURAS DE GRÃOS DE KEFIR Nathane Fernandes da Silva 1 Mário Abatemarco Júnior 2 RESUMO Os grãos de kefir assemelham-se a pedaços de couve-flor que possuem em sua constituição bactérias e leveduras que se encontram firmemente aderidas por uma trama de polissacarídeos denominado kefirano. Neste trabalho objetivou-se isolar, enumerar e identificar preliminarmente as leveduras presentes em grãos de kefir cultivados em dois substratos (leite ou água açucarada). Foram utilizados oito amostras de diversas localidades (Curitiba, Viçosa, Divinópolis, Bahia e Belo Horizonte), que estavam armazenadas sob uma temperatura de -80 C. Antes do isolamento as amostras foram ativadas para então serem maceradas, diluídas, plaqueadas em ágar YM e incubadas a 28 C por quatro dias. As colônias foram caracterizadas morfologicamente e enumeradas separadamente. Duas colônias de cada morfotipo foram estriadas em Agar YM para obtenção de cultura pura e coradas pelo método de Gram. A observação de morfologia celular típica confirmou o isolamento de levedura e esta foi congelada em caldo GYMP adicionado 20% de glicerol para posterior identificação molecular. Para verificar a capacidade de crescimento a 37 C, 100 µl da cultura congelada foi transferida para 5mL de caldo GYMP e a positividade foi avaliada pela turvação do meio de cultura. Todas as amostras analisadas apresentaram contagem de leveduras superior a 10 4 UFC/g, quantidade preconizada pelo Codex Alimentarius. Foram isoladas 54 leveduras categorizadas em 11 morfotipos diferentes das quais quatro estão presentes tanto nas amostras de leite quanto nas amostras de água açucarada; três 1 Discente do curso de Ciências Biológicas do Centro Universitário Metodista Izabela Hendrix 2 Orientador e aluno de mestrado do Programa de Pós Graduação em Microbiologia da UFMG

2 somente nas amostras de leite e quatro somente nas amostras de água. Todas as leveduras foram capazes de crescer a 37, teste importante quando se deseja utilizar um micro-organismo como probiótico. INTRODUÇÃO Os grãos de kefir são estruturas semelhantes a pedaços de couve-flor, constituídos por um conjunto complexo de bactérias e leveduras que se encontram firmemente aderidas e encapsuladas por uma trama de polissacarídeos insolúveis (kefirano). Juntos, o kefirano, as leveduras e bactérias constituem uma comunidade simbiótica responsável pelas propriedades probióticas do Kefir (Micheli et al., 1999). A adição dos grãos de kefir em leite seguida da sua fermentação espontânea por 24 horas dá origem a uma bebida ácida, levemente alcoólica, com ph variando entre 4,2 e 5,5, ou menor denominada kefir. Começou a ser consumida há milhares de anos na região das montanhas do Cáucaso, na Rússia, de onde é originária (Schneendorf e Anfiteatro, 2004) e atualmente tem ganhado popularidade em várias partes do mundo incluindo sudoeste da Ásia, leste e norte da Europa, América do Norte, Japão, África e Brasil devido às suas propriedades nutricionais e terapêuticas (Sarkar, 2008). De acordo com o Codex Alimentarius, o kefir deve ser constituído de menos que 10% de gordura de leite, um mínimo de 2,8% de proteína de leite, 0,6% de acidez titulável, 10 7 UFC/g (7 na escala logarítimica) de contagem microbiana total e 10 4 UFC/g (4 na escala logarítimica) de levedura (FAO/WHO, 2001). No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) define kefir como leite fermentado com cultivo ácido-lático elaborado com grãos de kefir, Lactobacillus kefir, espécies dos gêneros Leuconostoc, Lactococcus e Acetobacter com produção de ácido lático, etanol e dióxido de carbono. Os grãos de kefir são constituídos por leveduras fermentadoras de lactose (Kluyveromyces marxianus). Leveduras não fermentadoras de lactose (Saccharomyces omnisporus, Saccharomyces cerevisae e Saccharomyces exiguus), Lactobacillus casei, Bifidobacterium ssp. e Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (Resol. n o 5/2000; Instr.Normativa n o 46/2007 MAPA). Apesar da legislação Brasileira definir apenas o leite como substrato para a

3 produção da bebida fermentada, outros, como solução de açúcar mascavo, tem sido cada vez mais usado pela população como meio de cultivo para produção da bebida. No entanto, o número de trabalhos publicados na literatura científica que compara a diversidade de leveduras nos diferentes meios de cultivo ainda é escasso. A microbiota dominante nos grãos de kefir apresenta bactérias dos gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Acetobacter e Streptococcus e leveduras dos gêneros Kluyveromices, Saccharomyces, Candida e Torula (Schneendorf e Anfiteatro, 2004). Hoje, tanto lactobacilos como outros micro-organismos que possuam comprovada ação benéfica sobre o hospedeiro são chamados de probióticos, que são microrganismos viáveis que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios para a saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). A grande maioria dos micro-organismos utilizados como probióticos são bactérias encontradas na microbiota humana, no entanto, existe uma única levedura utilizada como probiótico, a levedura Saccharomyces boulardii (Martins, 2005). Esta levedura foi isolada da casca de lichia, uma fruta muito comum em países asiáticos. Atualmente, o uso de S. boulardii para o tratamento de diarréias associadas ao uso de antimicrobianos está difundido por todo o mundo e os médicos estão cada vez mais encorajados a prescrevêla em função do grande número de ensaios laboratoriais e clínicos mostrando os benéficos e a segurança do seu uso. Na América do sul, os direitos de comercialização foram adquiridos pela Merck S.A e, no Brasil, a formulação contendo a levedura é vendida com o nome comercial de Floratil (Martins, 2005). A microbiota dos grãos de kefir é rica em leveduras, o que faz dos grãos uma fonte segura desses micro-organismos. Desta forma o presente trabalho tem o objetivo de isolar, enumerar e identificar preliminarmente leveduras dos grãos de kefir, para que possam ser utilizadas em culturas iniciadoras para

4 produção do kefir em escala industrial, algo que ainda não é uma realidade no Brasil, e para utilização como probiótico em humanos. METODOLOGIA Amostras de grãos de kefir Para a realização deste trabalho foram utilizadas oito amostras de grãos de kefir, provenientes dos seguintes locais: (1) Viçosa Minas Gerais; (2) Belo Horizonte Minas Gerais, (3) Salvador - Bahia; (4) Curitiba - Paraná e (5) Divinópolis Minas Gerais. De Belo Horizonte foi utilizada apenas uma amostra cultivada em água com açúcar mascavo e de Divinópolis apenas uma amostra cultivada em leite. Das outras três localidades foram utilizadas uma amostra de grão de kefir de cada substrato. As amostras de grãos de kefir foram codificadas como KLVI - kefir de leite de Viçosa; KAVI- kefir de água de Viçosa; KLBA - kefir de leite de Bahia; KABA - kefir de água de Bahia; KLCU- kefir de leite de Curitiba; KACU kefir de água de Curitiba; KLDI - kefir de Leite de Divinópolis e KABH - kefir de água de Belo Horizonte. Ativação dos grãos de kefir Três gramas de cada amostra de grãos de kefir congeladas em ultrafreezer -80 C foram transferidos para 27mL de uma solução aquosa de açúcar mascavo a 5% p/v ou leite desnatado reconstituído a 10% p/v (preconizado pelo laboratório). Após 24 horas de incubação em temperatura ambiente, os grãos foram coados e um novo substrato foi adicionado. Este procedimento foi repetido duas vezes. Isolamento e enumeração de leveduras dos grãos de kefir Três gramas de cada amostra de grãos de kefir provenientes dos diferentes cultivos (leite ou água com açúcar) foram ressuspendidos em 27 ml de solução salina (NaCl 0,9% p/v) e triturados no homogeneizador de tecidos Ultra Turrax até não serem observadas partículas dos grãos, à velocidade de rpm.

5 As amostras foram diluídas seriadamente em solução salina 0,9% p/v estéril e 0,1 ml das diluições10-3, 10-4 e 10-5 foram plaqueadas, em duplicata, em Ágar Extrato de Malte-Extrato de Levedura (YM peptona 0,5%, extrato de levedura 0,3%, extrato de malte 0,3%, glicose 1%, ágar 1,5%; adicionado de cloranfenicol 0,02%), pela técnica Spread-plate e incubadas a 28ºC em aerobiose por 4 dias. Para a contagem, foram consideradas apenas as placas com crescimento entre 15 e 150 colônias e a fórmula utilizada para expressão do resultado em LogUFC/g foi: MxFD/VI, onde M é a média da contagem das placas, FD é o fator de diluição e VI é o volume inoculado. O resultado encontrado foi então transformado em logarítmico Identificação, enumeração e caracterização preliminar dos morfotipos As colônias foram caracterizadas quanto à cor (branca ou bege), textura (cremosa ou rugosa), tamanho (1 a 10mm), contorno da borda (regular ou irregular), presença ou não de algum detalhe no centro e, então, classificadas em diferentes morfotipos e contadas separadamente. Para enumeração de cada morfotipo, foi utilizado a mesma fórmula mostrada anteriormente. Duas colônias de cada morfotipo foram estriadas em Ágar YM para obtenção de uma cultura pura e, em seguida, foi realizada a observação microscópica das leveduras, através da fixação de uma pequena massa de células em lâmina de vidro e corada pelo método de Gram. Finalmente as leveduras isoladas foram conservadas em ultrafreezer 80ºC em caldo GYMP (Glicose 2,0%, Extrato de levedura 0,5%, Extrato de malte 1,0%, Fosfato de sódio monobásico 0,2%) suplementado com 20% de glicerol puro para posterior identificação molecular. Capacidade de crescimento a 37 C Para avaliar a habilidade das leveduras crescerem a 37 C, 100 µl de cada amostra foi repicada para caldo GYMP (glicose 2%, extrato de levedura 0,5%, extrato de malte 1%, fosfato de sódio monobásico 0,2%) e incubada na estufa de aerobiose por 72 horas. Foram considerados positivos os tubos que apresentaram turvação do meio de cultura.

6 RESULTADOS Isolamento e enumeração Foi observado crescimento de colônias típicas de leveduras em todas as amostras analisadas. No total, foram isoladas 58 colônias e a visualização de morfologia celular típica após coloração de Gram confirmou que 54 delas eram leveduras; as demais apresentaram morfologia típica de bactérias Gram positiva. A contagem total de leveduras em cada uma das oito amostras analisadas está mostrada na Figura 1. Figura 1. Enumeração de leveduras nas amostras de grãos de kefir. KAVI (kefir de água de Viçosa); KLVI (kefir de leite de Viçosa); KABA (kefir de água da Bahia); KLBA (kefir de leite da Bahia); KACU (kefir de água de Curitiba); KLCU (kefir de leite de Curitiba); KLDI (kefir de leite de Divinópolis); KABH (kefir de água de Belo Horizonte)

7 Identificação, enumeração e caracterização preliminar dos morfotipos Após a contagem total do número de colônias por amostra, essas foram caracterizadas em 12 morfotipos diferentes (tabela 1) e cada um deles contado separadamente (figura 2). Tabela 1: Caracterização morfológica de cada colônia isolada por amostra Código da amostra* Morfotipo N de colônias Cor Tamanho (diâmetro) Textura Borda Centro KAVI 1 1,20x10 4 Branca 5mm Rugosa Irregular - 6 4,80x10 4 Branca 5mm Cremosa Regular - 8 1,00x10 3 Bege 10mm Cremosa Regular - 9 4,20x10 4 Branca 7mm Cremosa Regular - KLVI 1 1,00x10 5 Branca 5mm Rugosa Irregular - 4 1,30x10 7 Branca 5mm Rugosa Irregular Ponto 5 4,00x10 4 Branca 3mm Cremosa Regular - KABA 6 1,61x10 5 Branca 5mm Cremosa Regular - 7 8,00x10 3 Branca 2mm Cremosa Regular - KLBA 1 1,00x10 4 Branca 5mm Rugosa Irregular - 4 4,95x10 6 Branca 5mm Rugosa Irregular Ponto 7 1,50x10 4 Branca 2mm Cremosa Regular - KACU 6 9,85x10 5 Branca 5mm Cremosa Regular -

8 7 3,90x10 4 Branca 2mm Cremosa Regular - 8 1,80x10 4 Bege 10mm Cremosa Regular - KLCU 1 2,75X10 6 Branca 5mm Rugosa Irregular - 2 1,46x10 6 Branca 3mm Rugosa Irregular Ponto 3 7,5x10 5 Branca 4mm Cremosa Regular - 4 5x10 4 Branca 5mm Rugosa Irregular Ponto KLDI 4 2,05x10 6 Branca 5mm Rugosa Irregular Ponto 1 6,10x10 5 Branca 5mm Rugosa Irregular - 6 5,00x10 4 Branca 5mm Cremosa Regular - 3 5,00x10 4 Branca 4mm Cremosa Regular - KABH 6 6,00x10 3 Branca 5mm Cremosa Regular - 7 4,75x10 5 Branca 2mm Cremosa Regular ,50x10 5 Branca 1mm Cremosa Regular ,00x10 3 Branca 10mm Rugosa Irregular Ponto 12 5,50x10 4 Branca 3mm Rugosa Irregular Laranja * KAVI ( kefir de água de Viçosa); KLVI (kefir de leite de Viçosa); KABA (kefir de água da Bahia); KLBA (kefir de leite da Bahia); KACU (kefir de água de Curitiba); KLCU (kefir de leite de Curitiba); KLDI (kefir de leite de Divinópolis); KABH (kefir de água de Belo Horizonte)

9 Figura 2. Contagem de cada morfotipo por amostra (LogUFC/g de grão). Os morfotipos diferentes estão representados por números diferentes. KAVI (kefir de água de Viçosa); KLVI (kefir de leite de Viçosa); KABA (kefir de água da Bahia); KLBA (kefir de leite da Bahia); KACU (kefir de água de Curitiba); KLCU (kefir de leite de Curitiba); KLDI (kefir de leite de Divinópolis); KABH (kefir de água de Belo Horizonte). Capacidade de crescimento a 37 C Após o tempo previsto de incubação, todas as 54 amostras testadas foram capazes de crescer a 37 C.

10 DISCUSSÃO A visualização de células leveduriformes ao microscópio ótico permitiu confirmar preliminarmente 54 colônias de leveduras e quatro de bactérias. Estas foram isoladas apenas de duas amostras de kefir de água (KAVI e KACU) e, em ambos os casos, somente as colônias beges (morfotipo 8) foram de bactérias. Todas as colônias brancas foram de leveduras. Gulitz et al. (2011) estudou a microbiota de três amostras de grãos de kefir de água e confirmou por identificação molecular que mais de 90% de todas as colônias de leveduras eram brancas, inclusive de espécies diferentes. Isso mostra uma fraca correlação entre diversidade de cor e espécie, isto é, a obtenção de colônias de cores iguais não implica necessariamente em espécies iguais. Em todas as amostras o número de leveduras foi superior a 10 4 (ou 4 na escala logarítmica), quantidade preconizada pelo Codex Alimentarius para kefir. Gulitz et al. (2011) encontram para 3 amostras uma contagem de leveduras/g de grão igual 6,8; 6,7 e 7,4, valores bem próximos aos encontrados neste trabalho. Miguel (2009) ao estudar a composição microbiológica dos grãos de kefir de leite e água açucarada de diferentes localidades encontrou contagens de leveduras que variaram de 5,15 a 8,30 log sendo que não houve uma correlação clara entre maior ou menor quantidade total de leveduras e meio de cultivo dos grãos (leite ou água açucarada), mas sim entre as localidades. No presente trabalho, o número total de leveduras dos grãos de leite foi maior que o dos grãos de água, independentemente da localidade. Isso pode ser explicado pela maior adaptação das leveduras a este substrato, uma vez que, originalmente os grãos eram cultivados apenas em leite e somente há pouco tempo é que se começou a utilizar outros substratos como meio de cultivo. Em relação aos morfotipos, pode ser observado que o 1, 4, 6 e 7 estão presentes tanto em amostras de leite quanto de água. Já os morfotipos 2, 3 e 5 foram isolados apenas das amostras de leite enquanto o 9, 10, 11 e 12 de grãos de água, sendo que os três últimos foram detectados apenas na amostra KABH cujo cultivo em água com açúcar iniciou-se há pelo menos 5 anos enquanto das outras amostras a transição do leite para água com açúcar aconteceu mais recentemente. Aqueles morfotipos observados nos dois substratos

11 provavelmente são de espécies que já se adaptaram ao novo meio de cultivo, enquanto aqueles observados somente em amostras de leite são espécies menos versáteis quanto a utilização de nutrientes e exigem um meio de cultivo mais complexo para se desenvolverem A avaliação da capacidade de crescimento a 37 C (temperatura corporal humana) é um parâmetro importante quando se deseja utilizar um microrganismo como probiótico visto que para desempenhar seus efeitos benéficos tais microrganismos precisam se multiplicar no interior do hospedeiro. Num trabalho realizado por Tiago et al. (2009), apenas 25 leveduras, de 103 avaliadas (24%), apresentaram habilidade de crescimento a 37 C. No presente trabalho, 100% das leveduras apresentaram tal habilidade, mostrando que tais isolados atendem ao primeiro requisito imposto para que um microrganismo seja utilizado como probiótico na saúde humana. Deve-se enfatizar que muitos outros testes, in vitro e in vivo, como por exemplo, resistência ao suco gástrico e sais biliares, antagonismo contra bactérias patogênicas, entre outros, são necessários para uma avaliação mais completa do potencial probiótico. Perspectivas O próximo passo do presente trabalho é a identificação das leveduras isoladas por métodos moleculares, etapa esta que deve ser realizada durante meu mestrado no programa de Pós Graduação em Microbiologia da UFMG. A identificação das espécies de leveduras não somente ajudará a esclarecer a complexa composição microbiológica dos grãos, como também possibilitará que tais leveduras sejam utilizadas em culturas iniciadoras para produção da bebida fermentada em escala industrial, realidade em vários países da Europa e Canadá, mas não no Brasil. Os isolados também serão submetidos a testes de caracterização probiótica in vitro e em modelo murino, para a seleção de leveduras com potencial probiótico para num futuro próximo serem inseridas num alimento ou numa formulação farmacêutica, com possibilidade real de obtenção de patente.

12 CONCLUSÕES Como conclusões principais do presente trabalho, podem-se citar: - As oito amostras analisadas apresentaram contagem de leveduras superior a 10 4 UFC/g de grão, quantidade preconizada pelo Codex Alimentarius. - A quantidade de leveduras presentes nas amostras de leite foi superior à encontrada nas amostras de água açucarada. - Foram observados quatro morfotipos iguais tanto nas amostras de leite como nas amostras de água; três morfotipos somente nas amostras de leite e quatro somente nas amostras de água açucarada, sendo que três destes foram vistos apenas em uma das amostras. - As 54 leveduras isoladas foram capazes de crescer a 37 C, característica importante quando se deseja utilizar um microrganismo como probiótico. REFERÊNCIAS BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa Nº 46 de 23 de Outubro de Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Leites Fermentados. Disponível em: < A%C7%D5ES%20SOBRE%20ROTULAGEM/LEITE%20E%20DERIVADOS/IN %2046_07_RTIQ%20leites%20fermentados.pdf> Acesso em: 17 Sentembro 2013, 13:40 CODEX ALIMENTARIUS Disponível em: < acesso em 20 outubro 2013, 12:30 FAO/WHO, Evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food, including powder milk with live lactic acid bacteria. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization Expert Consultation Report,1-34, 2001.

13 GULITZ, Anna; STADIE, Jasmin; WENNING, Mareike; EHRMANN, Matthias A.; VOGEL, Rudi F. International Journal of Food Microbiology, The microbial diversity of water kefir MARTINS, F. S.; TIAGO, F. C. P.; BARBOSA, F. H. F.; PENNA, F. J.; ROSA, C. A.; NARDI, R. M. D.; NEVES, M. J.; NICOLI, J. R. Utilização de leveduras como probióticos. Revista de Biologia e Ciências da Terra, v. 5, p. 1-13, 2005 MICHELI L., UCCELLETTI D., PALLESCHI C., CRESCENZI V. Isolation and characterisation of a ropy Lactobacillus strain producing the exopolysaccharide kefiran. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, MIGUEL, M.G.C.P Identificação de Microrganismos Isolados de Grãos de Kefir de Leite e de Água de Diferentes Localidades. Lavras. Minas Gerais SARKAR, S. Biotechnological innovations in kefir production: a review. British Food J., 110(3) , SCHNEEDORF, J. M., ANFITEATRO, D., Quefir, um probiótico produzido por microorganismos encapsulados e inflamação. Tecmedd. São Paulo MARTINS, F.S. ; TIAGO, F.C.P. ; ROSA, C.A. ; NARDI, R.M.D. ; CARA, D.C. ; NICOLI, J.R.. Physiological characterization of non-saccharomyces yeasts from agro-industrial and environmental origins with possible probiotic function. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v. 25, p , 2009.

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