Parainfluenza 1/2/3 IgA ELISA
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- Vinícius Barreiro Bentes
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1 Instruções de Utilização Parainfluenza 1/2/3 IgA ELISA Ensaios imunoenzimáticos (tiras de microtitulação) para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos IgA contra o vírus Parainfluenza 1, 2 e 3 em soro e plasma humanos. RE x8 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. APLICAÇÕES Ensaios imunoenzimáticos (tiras de microtitulação) para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos IgA contra o vírus Parainfluenza 1, 2 e 3 em soro e plasma humanos. 2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO A infeção pelos vírus parainfluenza é uma infeção transmitida pelo ar e aparece de forma endémica em todo o mundo. A seroprevalência da parainfluenza em crianças no seu primeiro ano de vida é de 50%. Típicas para os vírus parainfluenza são as novas infeções frequentes, particularmente para o vírus parainfluenza 3. O período de incubação é de 2-6 dias. Os vírus parainfluenza são um subgrupo dos paramyxovírus. Juntamente com os vírus respiratórios sincitiais (VRS), estes patógenos pertencem aos maiores patógenos virais das doenças do trato respiratório, sendo acompanhados de sintomas clínicos graves. Em adultos, o vírus parainfluenza causa uma rinite febril e laringite. Os primeiros sinais são dores de cabeça súbitas, dores musculares e nas articulações, seguidos de febre na ordem dos C. Se o trato respiratório inferior estiver envolvido, desenvolve-se ainda traquifonia e tosse seca como sinal de traqueobronquite. O vírus parainfluenza 1 causa pneumonias graves em recém-nascidos, que se manifestam através de febre alta, cianose, dispneia e expetoração purulenta e ensanguentada. Às vezes, ocorrem em simultâneo sintomas de meningite. O vírus parainfluenza 2 causa com frequência uma laringotraqueobronquite aguda com pseudocrupe em bebés e crianças. Os primeiros sinais de infeção são sintomas de catarro, seguidos por traquifonia, tosse de cão seca e estridor inspiratório. Os vírus parainfluenza 3 são considerados como os principais patógenos responsáveis pela pneumonia e bronquiolite. Embora os tipos 1, 2 e 3 estejam distribuídos por todo o mundo, o vírus parainfluenza tipo 4 aparece apenas nos EUA. As infeções 1 e 3 ocorrem durante todo o ano, enquanto os vírus parainfluenza 2 e 4 aparecem apenas esporadicamente. O diagnóstico laboratorial dos vírus parainfluenza é feito utilizando a reação de ligação do complemento (CF) do teste de inibição da hemaglutinação (HIT) e o teste de neutralização (NT). O IFA e o ELISA são métodos mais recentes, que permitem identificar os anticorpos IgG e IgA no soro do paciente. No diagnóstico diferencial, têm de ser realizados testes para outros paramyxovírus, como o vírus da papeira, os vírus do tifo e os vírus símios tipo 5, devido a possíveis reações cruzadas. 3. PRINCÍPIO DO TESTE Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) em fase sólida baseado no princípio de sandwich. Os poços são revestidos com antigénio. Anticorpos específicos da amostra ligados aos poços revestidos com antigénio são detectados por um anticorpo secundário conjugado com enzima (E-Ab) específico para IgA humanos. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de IgA-anticorpos específicos detectada. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente usando a curva padrão. 4. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional. 2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo. 3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação. 4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados. 5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário. 6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL: 7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos. 8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais. 9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras. Version (02) 1 / 6
3 10. Alguns reagentes contêm azida de sódio (NaN 3) como conservante. Em caso de contacto com os olhos ou pele, enxagúe imediatamente com água. A NaN 3 pode reagir com o chumbo e o cobre da canalização para formar azidas metálicas explosivas. Quando descartar os reagentes, enxagúe com grande volume de água para evitar a formação dos compostos. 11. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes. Os reagentes não abertos permanecem estáveis até a data de validade indicada. O kit é estável até 3 meses após a primeira abertura, quando a Placa de Microtitulação é embalada num saco bem fechado, as garrafas são fechadas as respectivas com tampas e o kit é armazenado a 2-8 C. 6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Soro, Plasma (EDTA, Heparina) Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria. Armazenamento: 2-8 C -20 C Manter afastado do calor ou luz solar directa. Estabilidade: 7 dias > 7 dias Evitar congelar-descongelar repetidamente. 7. MATERIAIS FORNECIDOS Quantidade Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 15 ml ENZCONJ IgA 1 x 4 x 2 ml CAL A-D 1 x 60 ml DILBUF 1 x 60 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP 2 x FOIL 1 x BAG Microplaca Tiras separáveis. Revestida com antigénios específicos. Conjugado Enzimático IgA Colorido vermelho. Pronto a usar. Contêm: anti-humano IgA, conjugado com peroxidase (coelho), tampão contendo proteína, 0.01 % Metilisotiazolinona, 0.01 % Bromonitrodioxane e 5 mg/l ProClin. Padrão A-D 1; 10; 40; 100 U/mL. Pronto a usar. Padrão A = Controlo Negativo Padrão B = Controlo Cut-off Padrão C = Controlo positivo fraco. Padrão D = Controlo Positivo Contêm: IgA anticorpos contra Parainfluenza (vírus paragripal) 1/2/3, PBS, 0.01% Metilisotiazolinona e 0.01 % Bromonitrodioxane. Tampão de Diluição Pronto a usar. Contêm: PBS Tampão, BSA, < 0.1 % NaN3. Tampão de Lavagem, Concentrado (10x) Contêm: PBS Tampão, Tween 20. Solução de Substrato TMB Pronto a usar. Contêm: TMB. Solução de Paragem TMB Pronto a usar. 0.5 M H2SO4. Película Aderente Para tapar a Microplaca durante a incubação. Saco Plástico Resselável. Para armazenamento a seco de tiras não usadas. Version (02) 2 / 6
4 8. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 5; 50; 100; 500 µl 2. Proveta 3. Tubos (1 ml) para diluição de amostras 4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente 5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de referência nm) 7. Água bidestilada ou desionizada 8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro 9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO 1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados. 2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma. 3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes. 4. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa. 5. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços. 6. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços. 7. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante. Version (02) 3 / 6
5 10. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE Preparação de Componentes Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas. Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações). Diluir / dissolver Componente Diluente Relação Observações Armazenamento Estabilidade 20 ml WASHBUF CONC 180 ml agua bidest. 1: Diluição de Amostras Aquecer até 37 C para dissolver cristais. Misturar energicamente. 2-8 C 8 semanas Amostra diluir com Relação Observações Soro / Plasma geralmente DILBUF 1:101 p.ex. 5 µl µl DILBUF Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas. 11. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 1. Pipetar 100 µl de cada Padrão e amostra diluída para os respectivos poços da Microplaca. No teste qualitativo apenas é utilizado o Padrão B. 2. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min a C. 3. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lave a placa 3 x com 300 μl de Solução de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel. 4. Pipetar 100 µl de Conjugado Enzimático para cada poço. 5. Tapar a placa com nova película adesiva. Incubar 30 min a C. 6. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 300 µl de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel. 7. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de positive displacement e evitar a formação de bolhas de ar. 8. Pipetar 100 µl de Solução de Substrato TMB para cada poço. 9. Incubar 20 min a C no escuro (sem película aderente). 10. Parar a reacção de substrato adicionando 100 µl de Solução de Paragem TMB a cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. A cor muda de azul para amarelo. 11. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência: nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem. 12. CONTROLO DE QUALIDADE Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões/controlos do kit devem-se encontrar dentro de limites aceitáveis como indicado no Certificado de Controlo de Qualidade. Caso não se cumpram esses critérios, o teste não é válido e deve ser repetido. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. No caso de qualquer desvio, os seguintes detalhes técnicos devem ser verificados: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, equipamentos, condições de incubação e métodos de lavagem. Version (02) 4 / 6
6 13. CÁLCULO DE RESULTADOS A avaliação do teste pode ser feita quer quantitativamente quer qualitativamente Avaliação Qualitativa O valor do Cut-off é dado pela DO do Padrão B (Padrão de Cut-off). O Índice de Cut-off (COI) é calculado a partir das densidades ópticas médias da amostra e do Valor do Cut-off. Se a densidade óptica da amostra estiver num intervalo de 20% á volta do Valor de Cut-off (zona cinzenta), a amostra deve ser considerada como equívoca. Amostras com DO superiores são positivas, amostras com DO inferiores são negativas. O Índice de Cut-off (COI) das amostras pode ser calculado da seguinte forma: COI = DO Amostra DO Padrão B Avaliação Quantitativa Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Ao utilizar um programa de computador, são recomendados os métodos "Cubic-Spline" ou "Ponto a Ponto", uma vez que fornecem a máxima precisão na avaliação dos dados de medição comparando com outros modelos de avaliação. Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado). A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração. Ao ler os resultados a partir do gráfico tem que se considerar a diluição inicial. Os resultados das amostras com pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição. Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente. Curva de Calibração Típica (Exemplo. Não usar para cálculos!) Padrão U/mL DO Média A B C D INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS Método Intervalo Interpretação < 8 U/mL negativo Quantitativa 8 12 U/mL indeterminado (Curva Padrão) > 12 U/mL positivo Qualitativa (Índice de Cut-off, COI) < 0.8 negativo indeterminado > 1.2 positivo Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico. 15. VALORES ESPERADOS Num estudo interno, indivíduos aparentemente saudáveis evidenciaram os seguintes resultados: Interpretação Ig Isotípico n positivo indeterminado negativo IgA % 5.7% 88.6% Version (02) 5 / 6
7 16. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes. Azidas e timerosal em concentrações > 0.1 % interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos. Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito Hemoglobina 8.0 mg/ml significativo (+/-20%) nos resultados do teste se estiverem em Bilirrubina 0.3 mg/ml concentrações inferiores às indicadas: Triglicéridos 5.0 mg/ml 17. DESEMPENHO Intra-Ensaio Precisão 7.6 % Inter-Ensaio Precisão 7.7 % Inter-lotes Precisão % Sensibilidade Analítica 0.96 U/mL Recuperação % Linearidade % Reactividade Cruzada Especificidade clínica 99 % Sensibilidade clínica 100 % Não foram detectadas reactividade cruzadas com: RSV Adenovirus e Bordetella 18. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO 1. Andrewes CH, Bang FB, Chanock RM, et al: Parainfluenza viruses 1, 2, and 3: Suggested names for recently described myxoviruses. Virology 8: (1959) 2. Chanock RM, Association of a new type of cytopathogenic myxovirus with infantile croup. J. Exp Med 104: (1956) 3. Collins PL, Chanock RM, McIntosh K: Parainfluenza viruses, in Fields BN (ed): Fields Virology. Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers, (1996) 4. Davidkin I, Jokinen S., Paananen A., Leinikki P., Peltola H., Etiology of Mumps-Like Illnesses in Children and Adolescents Vaccinated for Measles, Mumps, and Rubella J Infect Dis. 191(5): (2005) 5. Fan J, Henrickson KJ, Rapid diagnosis of human parainfluenza virus type 1 infection by quantitative reverse transcription-pcr-enzyme hybridization assay. J Clin Microbiol 34: (1996) 6. Hotez PJ, Doveikis SA, Adult respiratory distress syndrome associated with parainfluenza virus type 1 in children. Pediatr Infect Dis J 9: (1990) 7. Hornsleth A, Respiratory virus disease in infancy and childhood in Copenhagen : an estimation of the etiology based on complement fixation tests. Acta Pathol Microbiol Scand 69: (1967) 8. Karron RA, Wright PF, Hall SL, et al: Live attenuated bovine parainfluenza virus type 3 vaccine is safe, infectious, immunogenic, and phenotypically stable in infants and children. J Infect Dis 171: (1995) 9. Killgore GE, Dowdle WR: Antigenic characterization of parainfluenza 4a and 4b by the hemagglutinationinhibition test and distribution of HI antibody in human sera. Am J Epidemiol 91: (1970) 10. LaPlaca M, Moscovici C, Distribution of parainfluenza antibodies in different groups of population, J Immunol 88:72-77 (1962) 11. Monto AS, The Tecumseh study of respiratory illness: V: Patterns of infection with the parainfluenza viruses, Am J Epidemiol 97: (1973) 12. Zvirbliene A, Sezaite I, Pleckaityte M, Kucinskaite-Kodze I, Juozapaitis M, Sasnauskas K, Mapping of an antigenic site on the nucleocapsid protein of human parainfluenza virus type 3, Viral Immunology 22(3): (2009) Version (02) 6 / 6
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